楊翠蘭，克迎迎，李亞格，袁培培，傅 陽(yáng)，馮衛(wèi)生，鄭曉珂Δ

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)， 鄭州 450046； 2. 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450046)

中藥四性是指寒、熱、溫、涼4種藥性，它反映了藥物影響人體陰陽(yáng)盛衰、寒熱變化方面的作用傾向[1-2]。本項(xiàng)目首席科學(xué)家匡海學(xué)教授提出，藥性(氣)是藥物通過(guò)不同途徑，以主要影響機(jī)體的能量代謝、物質(zhì)代謝為特征的，與治療作用有關(guān)或無(wú)關(guān)的，但均可影響藥物療效發(fā)揮或與副作用發(fā)生有關(guān)的一類生物學(xué)效應(yīng)。其中能促進(jìn)機(jī)體能量代謝、物質(zhì)代謝的中藥多具有熱(或溫)性，抑制機(jī)體能量代謝、物質(zhì)代謝的中藥多具有寒(或涼)性。中藥藥性(氣)可以通過(guò)宏觀的正?；蚝疅釀?dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，以及系統(tǒng)生物學(xué)等方法予以評(píng)價(jià)歸屬[3-4]。在這一假說(shuō)的指導(dǎo)下，本實(shí)驗(yàn)基于熱證模型歸屬桑白皮性味拆分組分的寒熱藥性。

桑白皮為?？浦参锷orusCortexL.的干燥根皮[5],前期研究將桑白皮拆分為成分互不交叉的黃酮、苯駢呋喃、二苯乙烯、多糖、脂肪油組分[6-7]。為驗(yàn)證《黃帝內(nèi)經(jīng)》中用藥原則“熱者寒之”的科學(xué)性及桑白皮性味拆分組分的寒涼藥性，本實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)甲樂(lè)建立熱證模型[8]，給藥15 d后檢查各組大鼠體質(zhì)量、肛溫、自主活動(dòng)次數(shù)及物質(zhì)能量代謝相關(guān)酶的表達(dá)，以期更好地闡釋桑白皮各性味拆分組分的藥性。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠80只，體質(zhì)量(180～200)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(許可證SCXK(京)2012-0001)。

1.2 藥物

優(yōu)甲樂(lè)(左甲狀腺素鈉片，MerkSerono，生產(chǎn)批號(hào)210128)。桑白皮性味拆分組分制備：桑白皮水煎液濃縮后，上DiaionHP-20柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇洗脫，水洗脫液經(jīng)過(guò)醇沉、干燥得到多糖組分，提取率4.4%。其他3個(gè)洗脫液經(jīng)濃縮、干燥分別得到黃酮、苯駢呋喃和二苯乙烯組分，提取率分別為5.8%、0.31%、0.25%。脂肪油組分的提取方法：精密稱取10 g干燥至恒重的桑白皮藥材粉末(過(guò)60目篩)于濾紙筒內(nèi)，置索氏提取器中，加入100 ml石油醚(60～90 ℃)回流提取6 h，提取液放冷至室溫過(guò)濾，回收濾液，低溫?fù)]去溶劑，100 ℃干燥1 h后冷卻，精密稱定，經(jīng)計(jì)算桑白皮得油率3.10%。

1.3 試劑與儀器

GCK(glucokinase葡萄糖激酶)、PFK-1(phosphofructokinase-1果糖磷酸激酶)、PGK(phosphoglycerate kinase磷酸甘油酸激酶)、PK(pyruvate kinase丙酮酸激酶)、PDH(pyruvate dehydrogenase丙酮酸脫氫酶)、acetyl-CoA(acetyl coenzyme A乙酰輔酶A)、CS(citrate synthase檸檬酸合酶)、ICD(isocitrate dehydrogenase異檸檬酸脫氫酶)、α-KGDHC(α-ketoglutarate dehydrogenaseα-酮戊二酸脫氫酶)、FUM(fumarase延胡索酸酶)、PYGL(glycogen phosphorylase糖原磷酸化酶)、GSK-3(glycogen synthase kinase糖原合成酶激酶-3)、ATGL(adipose triglyceride lipase脂肪甘油三酯脂酶)及能量代謝相關(guān)酶CCR(cytochrome C reductase細(xì)胞色素C還原酶)、COX(cytochrome C oxidase細(xì)胞色素C氧化酶)、ATPs(ATP synthaseATP合酶)、ADK(adenylate kinase腺苷酸激酶)、Na+-K+ATP酶、ATP、ADP、NAD+、NADH、NAD+/NADH含量檢測(cè)試劑盒(蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號(hào)20141203 A)，其他各種化學(xué)試劑均為市售分析純(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)。

YLS-IB多功能大鼠自主活動(dòng)記錄儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)；醫(yī)用電子體溫計(jì)(東阿阿膠阿華醫(yī)療器械有限公司)；Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo，USA)；5810R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，Germany)；SK-1快速混勻器(常州國(guó)宇儀器制造有限公司)；移液器(Gilson，F(xiàn)rance)；BT25S十萬(wàn)分之一精密分析天平(Sartorius，Germany)；DZF-6050B真空干燥箱(北京恒泰豐科試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；BCD-206TAS低溫冰箱(海爾公司)；常規(guī)手術(shù)器械。

2 方法

2.1 動(dòng)物的分組及給藥

動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為NC組(Normal Control group正常對(duì)照組)、M組(Model group熱證模型組)、桑白皮水煎液組(MC)、黃酮組分組(Fla)、苯駢呋喃組分組(Ben)、二苯乙烯組分組(Oli)、多糖組分組(Pol)、脂肪油組分組(FO)。熱證模型每日上午9點(diǎn)灌胃優(yōu)甲樂(lè)120 μg/kg，NC組灌胃生理鹽水，每日下午灌胃目的中藥，NC組、M組給予生理鹽水，MC組給予2.8 g/kg桑白皮水煎液，F(xiàn)la組給予0.1624 g/kg黃酮組分，Ben組給予0.00868 g/kg苯駢呋喃組分，Oli組給予0.007 g/kg二苯乙烯組分，Pol組給予0.1232 g/kg多糖組分，F(xiàn)O給予0.0868 g/kg脂肪油組分，連續(xù)給藥15 d。15 d后取大鼠肝臟、心臟迅速凍存于液氮中后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 給藥期間各組大鼠體質(zhì)量、肛溫、自主活動(dòng)次數(shù)的記錄

記錄給藥前及給藥期間各組大鼠體質(zhì)量及肛溫的變化，同時(shí)記錄給藥第15天各組大鼠5 min內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù)。

2.3 物質(zhì)能量代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

ELISA法檢測(cè)各組大鼠肝臟中GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、GSK-3、ATGL、CCR、COX、ATPs、ADK、ATP、ADP、NAD+、NADH、NAD+/NADH的水平以及各組大鼠心臟中Na+-K+ATP酶的水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 桑白皮性味拆分組分對(duì)熱證大鼠體質(zhì)量、肛溫、自主活動(dòng)的影響

表1示，與NC組比較，M組大鼠體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)，桑白皮水煎液及各性味拆分組分組大鼠體質(zhì)量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與NC組比較，M組大鼠肛溫、自主活動(dòng)極顯著升高(P<0.01)，與M組比較，桑白皮水煎液及各性味拆分組分組大鼠肛溫、自主活動(dòng)極顯著降低(P<0.01)。

3.2 桑白皮性味拆分組分對(duì)熱證大鼠物質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

表2、3示，與NC組比較，M組GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、GSK-3、ATGL的表達(dá)顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與M組比較，桑白皮水煎液及各性味拆分組分組GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、GSK-3、ATGL的表達(dá)顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表1 桑白皮性味拆分組分對(duì)熱證大鼠體質(zhì)量、肛溫、自主活動(dòng)的影響

注：與NC組比較：**P<0.01；與M組比較：#P<0.05，##P<0.01

3.3 桑白皮性味拆分組分對(duì)熱證大鼠能量代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

表4、5示，與NC相比，M組CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶、ATP、NADH的表達(dá)顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，ADP、NAD+、NAD+/NADH的表達(dá)顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與M組比較，桑白皮各給藥組CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶的表達(dá)顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)，ADP、NAD+、NAD+/NADH的表達(dá)顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

表2 桑白皮水煎液及各性味拆分組分對(duì)熱證大鼠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化成乙酰輔酶A階段相關(guān)酶的影響

注：與NC組比較：*P<0.05，**P<0.01；與M組比較：#P<0.05，##P<0.01

表3 桑白皮性味拆分組分對(duì)熱證大鼠三羧酸循環(huán)階段相關(guān)酶的影響

注：與NC組比較:*P<0.05，**P<0.01；與M組比較:#P<0.05，##P<0.01

表4 桑白皮性味拆分組分對(duì)熱證大鼠能量代謝相關(guān)酶的影響

注：與NC組比較：**P<0.01；與M組比較:#P<0.05，##P<0.01

表5 桑白皮性味拆分組分對(duì)熱證大鼠能量代謝相關(guān)物質(zhì)含量的影響

注：與NC組比較：**P<0.01；與M組比較:#P<0.05，##P<0.01

4 討論

中醫(yī)診斷的寒熱之證與機(jī)體的物質(zhì)能量代謝密不可分，而中藥的寒熱藥性可能會(huì)通過(guò)影響機(jī)體物質(zhì)能量代謝的某些環(huán)節(jié)，來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的寒熱之證。吳桂琴、徐珊等[9-11]發(fā)現(xiàn)，寒性藥龍膽草、黃芩、生黃柏能不同程度地抑制熱證大鼠能量代謝。能量代謝非常復(fù)雜，包括氧化磷酸化過(guò)程中的許多酶和因子，而這些酶和因子起著調(diào)控作用[12]。本實(shí)驗(yàn)從物質(zhì)能量代謝的角度出發(fā)，探討桑白皮性味拆分組分對(duì)熱證模型物質(zhì)能量代謝的影響，以此歸屬桑白皮各性味拆分組分的寒熱藥性。

首先分析基礎(chǔ)體征指標(biāo)，與正常組比較，熱證模型組大鼠的體質(zhì)量顯著降低，肛溫及自主活動(dòng)顯著升高，這符合臨床熱證的病理表現(xiàn)。與模型組比較，桑白皮各性味拆分組分組大鼠體質(zhì)量增加，肛溫降低，自主活動(dòng)減少，說(shuō)明大鼠熱證病證有所改善，推測(cè)桑白皮各性味拆分組分的藥性可能為寒涼。

在生理狀態(tài)下，體內(nèi)物質(zhì)能量代謝處于動(dòng)態(tài)平衡，研究表明機(jī)體所需要的能量主要是通過(guò)生物氧化提供。根據(jù)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化分解、釋放能量的特點(diǎn)，可將生物氧化分為三個(gè)階段：第一階段，三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過(guò)各自的代謝途徑生成乙酰輔酶A。這個(gè)階段包括葡萄糖有氧氧化及丙酮酸氧化脫羧生成acetyl-CoA過(guò)程，這個(gè)過(guò)程中GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH等酶發(fā)揮著重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熱證模型大鼠肝臟中GCK、PFK-1、PK、PGK、PDH、acetyl-CoA的表達(dá)顯著增加，而給藥桑白皮性味拆分組分后均能夠降低其酶的表達(dá)，與桑白皮水煎液的結(jié)果類似，說(shuō)明桑白皮各性味拆分組分能夠抑制熱證模型大鼠體內(nèi)的物質(zhì)代謝。這可能與桑白皮各性味拆分組分的寒涼藥性有關(guān)。

第二階段，acetyl-CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)，脫羧生成CO2，脫氫生成NADH+H+和FADH2，此階段中有CS、ICD、α-KGDHC及FUM酶的參與，在模型組大鼠體內(nèi)CS、ICD、α-KGDHC及FUM的水平均增加，而給藥桑白皮性味拆分組分后均能夠下調(diào)其酶的表達(dá)，與桑白皮水煎液類似，這說(shuō)明桑白皮各性味拆分組分能夠改善三羧酸循環(huán)過(guò)程的快速代謝狀況。第三階段，NADH+H+或FADH2攜帶的2H通過(guò)線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈依次傳遞，最終與氧結(jié)合生成水，并釋放大量的能量。在此階段中，CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶為關(guān)鍵限速酶。結(jié)果顯示，熱證模型組大鼠CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶的表達(dá)增加，而給藥桑白皮性味拆分組分后各酶的表達(dá)均下降，與桑白皮水煎液效果相似，進(jìn)一步說(shuō)明桑白皮各性味拆分組分的藥性可能為寒涼。

機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下，還可以通過(guò)肝糖原的分解以及脂肪動(dòng)員提供能量，在這個(gè)過(guò)程中PYGL和GSK-3在糖原的分解和合成中發(fā)揮著重要作用。PYGL是催化糖原分解生成葡萄糖的關(guān)鍵別構(gòu)酶，GSK-3可以間接抑制糖原的合成，ATGL在脂肪動(dòng)員中發(fā)揮著重要作用。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與熱證模型組比較，熱證模型大鼠體內(nèi)PYGL、GSK-3和ATGL的水平均升高，而給藥桑白皮性味拆分組分后PYGL、GSK-3和ATGL的水平均降低，與桑白皮水煎液作用一致，說(shuō)明桑白皮各性味拆分組分能夠抑制糖原分解及脂肪動(dòng)員進(jìn)程，這與其藥性為“寒涼”有關(guān)。

從物質(zhì)代謝和能量代謝的角度分析，熱證模型組大鼠的肛溫、自主活動(dòng)次數(shù)、物質(zhì)能量代謝相關(guān)酶GCK、PFK-1、PGK、PK、PDH、acetyl-CoA、CS、ICD、α-KGDHC、FUM、PYGL、ATGL、ATP、CCR、COX、ATPs、ADK、Na+-K+ATP酶、NAD+、NAD+/NADH的表達(dá)及含量極顯著升高，ADP、NADH的表達(dá)極顯著降低，表明熱證模型大鼠的物質(zhì)能量代謝處于高水平亢奮狀態(tài)，而給藥桑白皮各性味拆分組分后能夠顯著抑制熱證模型物質(zhì)能量代謝的高水平亢奮狀態(tài)，與桑白皮水煎液效果類似。這與本課題“促進(jìn)機(jī)體能量、物質(zhì)代謝的中藥具有熱(或溫)性，抑制機(jī)體能量、物質(zhì)代謝的中藥具有寒(或涼)性”這一假說(shuō)相符。同時(shí)也與中醫(yī)臨床“熱者寒之”的治則吻合，因此說(shuō)明桑白皮各性味拆分組分的藥性為寒(涼)性。