黃艷明，楊 梅，袁容娣

目的：探討低溫瓊脂包埋振動切片機切片法制作的大鼠視網膜切片內核層神經元的形態(tài)和基本電生理學特性。

方法：采用低溫瓊脂包埋振動切片機切片的方法制作大鼠視網膜切片，對內核層的神經元進行膜片鉗全細胞記錄，同時在胞內液中加入熒光黃觀察記錄細胞的形態(tài)。

結果：該方法制作的視網膜切片切面平整、細胞活性好、保留了細胞之間的突起聯(lián)系，能夠根據細胞胞體的大小、位置初步辨別細胞的種類。在視網膜切片上熒光黃顯示的細胞形態(tài)表明，雙極細胞胞體呈梭形，突起主要沿縱向延伸；而水平細胞和無長突細胞胞體圓形或橢圓形、胞體較大，分別位于內核層的最外層和最內層。水平細胞和無長突細胞的靜息膜電位(RMP)和膜電容(Cm)明顯高于雙極細胞。給予時程40ms，步階10mV從-60mV至+40mV的電壓刺激，41.7%的視錐雙極細胞和64.7%的無長突細胞表現(xiàn)出內向鈉電流和外向鉀電流，其他細胞則只表現(xiàn)出外向鉀電流。

結論：采用低溫瓊脂包埋振動切片機切片的方法操作簡單，制作的切片質量穩(wěn)定可靠，使得在視網膜切片上對包括水平細胞在內的不同內核層神經元進行膜片鉗記錄成為可能。進一步研究視網膜內核層神經元的電生理學特性，有助于揭示視覺信號的發(fā)生、傳導和調控機制。

0 引言

視網膜主要由三層細胞構成，從外至內依次為外核層、內核層(inner nuclear layer, INL)和節(jié)細胞層。其中INL的細胞種類復雜，包括水平細胞(horizontal cell, HC)、視桿雙極細胞(rod bipolar, RB)、視錐雙極細胞(cone bipolar, CB)和無長突細胞(amacrine cell, AC)。且在視覺信息的傳遞過程中擔當承上啟下的重要功能，雙極細胞將接收的光感受器的信號分流為給光(ON)和撤光(OFF)信號；同時經感光細胞—雙極細胞—神經節(jié)細胞垂直通路傳遞的視覺信號在INL的水平細胞和無長突細胞兩個水平進行整合；最后通過INL細胞與神經節(jié)細胞之間特殊的突觸傳遞，將持續(xù)性的分級電位轉化為動作電位。因此對INL細胞電生理功能的研究對于揭示視網膜的信息處理機制尤為重要。

由于感光細胞和神經節(jié)細胞分別位于視網膜的最外層和最內層，對其電生理功能的記錄可在視網膜鋪片上進行[1]。而對處于視網膜中間層的INL細胞如雙極細胞[2]、無長突細胞[3]的膜片鉗記錄則只能在視網膜切片上進行。但是至今對水平細胞的膜片鉗記錄仍然采用酶消化、分離單個細胞的方法[4-5]。究其原因，可能是由于傳統(tǒng)的方法制作的視網膜切片質量欠佳，難以辨認數量相對較少的水平細胞。本研究借用腦片膜片鉗技術中振動切片機切片的方法，加以改進將視網膜用低熔點瓊脂包埋后振動切片機切片，制作出形態(tài)和活性較好的視網膜切片，對INL 的各種神經元進行膜片鉗全細胞記錄。

1 材料和方法

1.1材料 選取出生后30d Long Evan’s大鼠(來源于陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心)。常規(guī)化學試劑(NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，NaHCO3，NaH2PO4，葡萄糖，乳酸鈉)購于重慶北碚化學試劑廠，丙戊酸鈉和熒光黃購于上海生工，低熔點瓊脂(美國Sigma Aldrich)。玻璃微電肌毛胚(北京正天易科貿有限責任公司)。主要設備：膜片鉗放大器(美國Axon公司Axopatch200B)、電極拉制器(美國Sutter公司P-97 Flaming/Brown式)、熒光顯微鏡(德國Leica Q550FW)、振動切片機(美國Ted Pella，INC Vibratome 1000)。

1.2方法

1.2.1視網膜切片的制作 麻醉并處死出生后30d Long Evan’s大鼠，迅速摘出眼球，在細胞外液(NaCl 119mmol/L，KCl 2.5mmol/L，CaCl22.5mmol/L，MgCl21.3mmol/L，NaHCO326.2mmol/L，NaH2PO41mmol/L，葡萄糖 20mmol/L，丙酮酸鈉 2mmol/L，乳酸鈉 4mmol/L)中剝離視網膜，并將其剪成2～3片。該研究中使用的Long Evan’s 大鼠符合我國微生物控制的要求，實驗設計、實驗過程及動物處死方法，經過陸軍軍醫(yī)大學實驗動物福利倫理審查委員會審核通過，符合動物倫理和動物福利要求。視網膜片展平后使用37℃的3.5%低熔點瓊脂凝膠包埋，放置冰袋上迅速冷卻凝固后，修整瓊脂塊，使用瞬間粘合劑將其固定在振動切片機(vibratome 1500, 美國)的載物臺上，迅速加入4℃預冷的細胞外液并通混合氣體(95%O2+5%CO2)，將包埋有視網膜的瓊脂塊切成厚度200μm的切片，用細毛筆將切片轉移入通混合氣體的細胞外液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2記錄電極的制備 應用P97電極拉制儀(Sutter, 美國)采用三步法拉制玻璃毛細管微電極(WPI，美國)，拉制好的電極在注入電極內液(KCl 120mmol/L，HEPES 20mmol/L， EGTA 1mmol/L，MgATP 2mmol/L，NaGTP 0.2mmol/L，0.02%熒光黃)后測阻抗為7～10 MΩ。

1.2.3膜片鉗全細胞記錄 用細毛筆小心將視網膜切片轉移入灌流槽底并用尼龍絲網加以固定，持續(xù)氧飽和的細胞外液灌流(3～5mL/min)。采用傳統(tǒng)的全細胞膜片鉗記錄技術，在電壓鉗模式下，鉗制電壓-60mV，10mV步階階躍至+40mV，記錄細胞的全細胞電流。在形成全細胞模式后，記錄細胞的被動膜學特性，包括靜息膜電位(RMP)、膜輸入阻抗(IR)、膜電容(Cm)等。信號采集頻率為10kHz，濾波頻率為2kHz。所用設備為Axopatch 200-B(Axon Instruments,CA,USA)，信號采集和分析軟件Clampex 10.0和Clampit10.0。采集記錄結束后在熒光顯微鏡下可以觀察、拍攝所記錄細胞的形態(tài)。

2 結果

2.1視網膜切片的形態(tài) 采用低熔點瓊脂包埋振動切片機方法獲得的視網膜切片，在400×顯微鏡下，切面平整層次清晰，組織透光性好，色素上皮細胞、感光細胞及其內外節(jié)、INL各種細胞和神經節(jié)細胞均清晰可見(圖1A)。INL的大部分細胞表面突起隱約可見(圖1B箭頭所示)，且胞體光澤圓滑。在對INL-無長突細胞記錄完畢觀察細胞形態(tài)時(圖1C)，我們還發(fā)現(xiàn)節(jié)細胞層有一細胞胞體同時著色(圖1D)，且可見兩細胞之間的突起聯(lián)系(圖1F)。

2.2內核層神經元的形態(tài) 水平細胞：胞體位于INL緊鄰外叢狀層(outer plexiform layer, OPL)的部位，突起在OPL內水平延伸(圖2A)。視桿雙極細胞：胞體呈梭形，軸突較長，深達內從狀層(inner plexiform layer, IPL)的最內層,軸突末端呈瘤樣膨大(圖2B)。視錐雙極細胞：分為兩種類型，ON型視錐雙極細胞軸突較長，軸突末端止于IPL層的內層(圖2C)；OFF型視錐雙極細胞胞體位于INL內層，軸突較短，末端止于于IPL 的外層(圖2D)。無長突細胞：胞體較雙極細胞大，位于INL層最內層，突起分支模式多樣(圖2E、F)。

2.3內核層神經元的基本電生理學特性 內核層視桿雙極細胞、視錐雙極細胞、水平細胞、無長突細胞這四種神經元的被動膜學特性檢測結果顯示，四種神經元的IR值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；四種神經元的RMP值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中視桿雙極細胞組(-47.3±2.76mV)和視錐雙極細胞組(-42.3±5.53mV)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但視桿雙極細胞組與水平細胞組(-51.2±4.25mV)、視錐雙極細胞組與無長突細胞組(-59.8±3.15mV)相比RMP值均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；四種神經元的Cm值檢測比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中視桿雙極細胞組(28.5±6.12pF)和視錐雙極細胞組(25.7±3.26pF)相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但視桿雙極細胞組與水平細胞組(35.6±4.79pF)、視錐雙極細胞組與無長突細胞組(39.3±1.37pF)相比Cm值均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

在同樣的步階電壓刺激下，比較INL各種神經元的全細胞電流。水平細胞、視桿雙極細胞、部分視錐雙極細胞7/12)和部分無長突細胞(6/17)只表達外向鉀電流。鉗制電位+40mV時，前三類細胞外向鉀電流的峰值分別為820.5±137.4 pA(n=7)(圖3A)、648.7±98.3pA(n=15)(圖3B)、672.3±11.5pA(n=7)(圖3C)，而無長突細胞的外向鉀電流峰值較大可達2614.5±275.1pA(n=6)(圖3E)。41.7%視錐雙極細胞(5/12)(圖3D)和64.7%無長突細胞(11/17)(圖3F)在同上的步階電壓刺激下，同時表現(xiàn)出外向鉀電流和內向鈉電流。視錐雙極細胞內向電流的峰值為-252.9±48.6pA(n=5)(圖3D)，而無長突細胞內向電流峰值達-414.7±73.2pA(n=11)(圖3F)。

圖1 視網膜切片的形態(tài)以及切片上細胞之間的突起聯(lián)系 A：低溫瓊脂包埋振動切片機制作的視網膜切片切面平整、細胞活性良好，根據細胞胞體的位置和突起形態(tài)可以大致區(qū)分細胞類型;B:無長突細胞和它的突起;C:神經節(jié)細胞層的一個神經節(jié)細胞被染色;D:在像差顯微鏡下看到染色較深的無長突細胞和染色較淺的神經節(jié)細胞。E:B和C重疊顯示無長突細胞和神經節(jié)細胞的突起交叉重疊。RPE：色素上皮層；PRC：感光細胞層；ONL：外核層；OPL：外叢狀層；INL：內核層；IPL：內叢狀層；GCL：神經節(jié)細胞層；RB：視桿雙極細胞；CB：視錐雙極細胞；HC：水平細胞； AC：無長突細胞；RGC：神經節(jié)細胞。

圖2 完成膜片鉗全細胞記錄以后，在熒光顯微鏡下觀察內核層神經元的形態(tài) A:水平細胞;B:視桿雙極細胞;C:ON型視錐雙極細胞;D:OFF型視錐雙極細胞;E,F:無長突細胞。

指標水平細胞組(n=7)視桿雙極細胞組(n=15)視錐雙極細胞組(n=12)無長突細胞組(n=17) FPRMP(mV)-51.2±4.25a-47.3±2.76-42.3±5.53-59.8±3.15c2.8140.032IR(MΩ)296±17.8317±40.3303±24.5341±24.17.980.762Cm(pF)35.6±4.79a28.5±6.1225.7±3.2639.3±1.37c3.540.042

注：RMP：靜息膜電位； IR：膜輸入阻抗； Cm：膜電容。aP<0.05vs視桿雙極細胞；cP<0.05vs視錐雙極細胞。

3 討論

以往制作視網膜切片的方法包括濾紙貼附手工切片和簡易組織切片機切片[6]。這兩種切片方法也存在以下缺點：(1)可控性和重復性差。(2)刀片直接切割對細胞損傷大。本實驗中借用腦片膜片鉗實驗中振動切片機切片的方法，將視網膜用低熔點瓊脂包埋成塊，然后振動切片機切成150～200μm的薄片。該方法與上述兩種方法比較，制作的視網膜切片切面平整、各層細胞胞體圓滑有光澤，部分細胞的突起隱約可見，且能夠初步判斷細胞的種類。

圖3 電壓鉗模式下內核層神經元全細胞電流比較 A:水平細胞;B:視桿雙極細胞; C, D:視錐雙極細胞；E,F：無長突細胞的全細胞電壓。

Euler等[7]根據胞體的位置、軸突形態(tài)以及軸突終末的位置將大鼠視網膜雙極細胞分為10種類型，包括1種視桿雙極細胞和9種視錐雙極細胞。Golgi鍍銀染色和免疫組化染色[8-9]表明視桿雙極細胞胞體大多位于內核層靠近外叢狀層的部位，軸突較長, 深達內叢狀層的最內層，末端呈瘤樣膨大。內叢狀層平均分為五等分，靠近內核層的兩等分被稱作a亞層，靠近節(jié)細胞層的三等分被稱為b亞層，分別對應為ON和OFF亞層，視桿雙極細胞的軸突末梢終止于b亞層[10]。在大多哺乳動物的視網膜中[11-12]，根據軸突末梢的分支模式和終止的部位劃分存在9種視錐雙極細胞。 其中軸突末梢終止于內從狀層b亞層的屬于ON型視錐雙極細胞，終止于a亞層的屬于OFF型視錐雙極細胞。在膜片鉗記錄的胞內液中加入0.02%熒光黃，記錄完畢后觀察細胞形態(tài)，由于雙極細胞的軸突主要沿縱向延伸，在視網膜切片上可根據以上標準進一步鑒定記錄細胞所屬的亞型。在活性較好的視網膜切片上，雙極細胞胞體大多成梭形，視桿雙極細胞較視錐雙極細胞略大，更靠近外叢狀層，有時可見較長的軸突深入內從狀層。

大多數脊椎動物視網膜包含兩種基本類型的水平細胞，一種是沒有軸突的A型水平細胞，含有相對大而分支少的初級樹突，另一種是有軸突的B型水平細胞，有較多的樹突。在形態(tài)和活性較好的視網膜切片上，根據水平細胞位于INL最外層的特點，不難找到水平細胞，但是由于該類細胞的突起只在OPL內橫向延伸，故難以在切片上進一步區(qū)分A型和B型水平細胞。無長突細胞的分型更為復雜[13-14]，在視網膜切片上難以確切區(qū)分其亞型，必須結合免疫組化染色和鋪片中的形態(tài)來進一步區(qū)分。在本實驗活性較好的視網膜切片上，水平細胞和無長突細胞胞體較大，呈圓形或橢圓形，前者位于INL的最外層，后者位于INL的最內層。在實驗中對INL-無長突細胞記錄完畢觀察形態(tài)時，發(fā)現(xiàn)節(jié)細胞層有一細胞著色，且可見二者之間的突起聯(lián)系，這更進一步說明該切片方法在較大程度上保留了細胞之間的突起聯(lián)系，更接近生理狀態(tài)。與腦片不同，由于視網膜組織疏松，有些細胞胞體較小，全細胞記錄完畢后移走電極通常會把細胞帶走，電極保持原位稍影響細胞形態(tài)的觀察。

在INL神經元中，無長突細胞和水平細胞的RMP和Cm與兩種雙極細胞有顯著差異；而視錐和視桿雙極細胞的RMP和Cm沒有顯著差異。Cm的大小與細胞膜表面積(包括內陷折疊部分)成正比，無長突細胞和水平細胞Cm值較大，這與這兩種細胞胞體較大相一致。兩種雙極細胞在形態(tài)和細胞大小方面都比較接近，所以它們的RMP和Cm值接近。INL神經元在時程40ms，步階10mV從-60mV至+40mV的電壓刺激下，水平細胞和視桿雙極細胞僅表現(xiàn)出外向鉀電流。而41.7%的視錐雙極細胞和64.7%的無長突細胞同時表現(xiàn)出內向電流和外向電流。對不同種屬動物視網膜水平細胞的研究發(fā)現(xiàn)，一種獨特的內向整流鉀通道可作為水平細胞的電生理標志[15-16]，該電流由超極化電壓所誘發(fā)，本實驗中只設計了去極化電壓故未能觀察到該標志性電流。電壓門控鈉通道通常表達于以動作電位作為信號傳遞方式的神經細胞，而本實驗發(fā)現(xiàn)在去極化電壓刺激下，部分視錐雙極細胞和無長突細胞表現(xiàn)出內向電流。這與Pan等[17]對視錐雙極細胞電壓門控通道的研究結果一致。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，無長突細胞雖然是中間神經元，但是注入電流使其去極化通常能誘發(fā)出尖峰樣的位電反應(spike-like potential)[18]，本實驗中觀察到的電壓門控的內向電流可能參與該尖峰樣電位反應的產生。

本文所采用的方法制作的視網膜切片切面平整、細胞活性好，根據胞體大小、位置等可初步辨認包括水平細胞在內的各種細胞，便于進行膜片鉗全細胞記錄。且該方法制作的切片較大程度的保留了細胞之間的突起聯(lián)系，可用于研究內層細胞的突觸后反應和對光反應等。INL的水平細胞、視桿雙極細胞、視錐雙極細胞和無長突細胞，同為中間神經元，形態(tài)和電生理學特性卻各異。進一步研究這些細胞的離子通道表達和動力學特征，有助于揭示視網膜信息處理的機制。