肖益群,翟少偉,郭松林

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021;2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

鰻鱺是我國重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟品種。隨著養(yǎng)殖生產(chǎn)集約化程度提高和水域環(huán)境影響，鰻鱺病害日益嚴重，對鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展造成了威脅，尤以細菌性疾病最為嚴重。創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)是弧菌屬第5群細菌，革蘭氏染色陰性，為嗜鹽型海洋菌[1]。同時，創(chuàng)傷弧菌還是兼性厭氧型細菌，在有氧和無氧條件下均能生長，最適生長溫度為28℃。根據(jù)生化反應(yīng)、遺傳特性、血清學(xué)試驗的差異和宿主范圍的不同，將其分為3種生物型[2]，其中生物2型菌株是鰻鱺的重要病原菌，是導(dǎo)致鰻鱺出血性敗血癥、爛鰓病、爛尾病等的原發(fā)性致病菌[3-5]。創(chuàng)傷弧菌表面的外膜蛋白(OMPs)和胞外產(chǎn)物中的外毒素在細菌的致病過程中起著十分重要的作用[6-7]。創(chuàng)傷弧菌對鰻鱺有較強的感染性，若能建立起快速而又準確的檢測方法，將能有效防治和控制鰻鱺細菌病害的發(fā)生，減少養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是一種利用抗原抗體之間的特異性反應(yīng)與酶分子的高效催化作用，使降解底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，可定性定量檢測抗原或抗體的方法[8]。該方法有著操作簡便、所需時間短、特異性強、靈敏度高、結(jié)果直觀和實用性強等優(yōu)點[9-10]?？v觀已經(jīng)報道的細菌鑒定試劑盒研究，基本局限于細菌培養(yǎng)后的實驗室檢測，能夠用于養(yǎng)殖發(fā)病現(xiàn)場的細菌檢測試劑盒很少，且一般均存在嚴重的非特異性反應(yīng)。本研究以實驗室近20年分離的創(chuàng)傷弧菌和其他37株鰻鱺致病菌為材料，擬初步建立特異性的創(chuàng)傷弧菌的ELISA現(xiàn)場快速檢測方法，以期能夠特異性檢出病鰻臟器內(nèi)的創(chuàng)傷弧菌。

1 材料與方法

1.1 菌株、血清和酶標抗體

試驗采用的38株菌取自集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院鰻魚病原菌庫，其編號與鑒定結(jié)果詳見表1。創(chuàng)傷弧菌兔抗血清由本實驗室制備，羊抗兔酶標抗體購自Thermo公司。

表1 試驗所用菌株名稱及編號

1.2 試驗鰻鱺和菌液制備

30尾健康美洲鰻鱺(Auguillarostrata)取自集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院海水養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)于水簇箱中，保持充氣。用1×108cfu/mL創(chuàng)傷弧菌、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellaanguillarum)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)分別腹腔注射健康鰻鱺10尾，收集不同時間瀕死或剛剛死亡的鰻鱺臟器，樣品經(jīng)勻漿后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?chuàng)傷弧菌采用劃平板法接種于含有0.5%NaCl的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基上，在生化培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)24 h，無菌操作下挑取平板分離培養(yǎng)出的單菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，于搖床培養(yǎng)箱中30 ℃振蕩培養(yǎng)約16 h。將肉湯倒入滅菌后的離心管，配平質(zhì)量，于高速冷凍離心機上4 ℃、7 000 r/min離心4 min，然后棄上清液，用PBS重懸沉淀，經(jīng)同條件下離心和PBS洗滌3次后，再用少量包被液重懸沉淀，邊加包被液邊測A595，待A595=0.1時，即得到濃度為1×108cfu/mL的創(chuàng)傷弧菌菌液。按此方法分離培養(yǎng)其他37株菌株并制備菌液。

1.3 創(chuàng)傷弧菌兔抗血清效價的測定

用包被液稀釋1.2制得的濃度為1×108cfu/mL的創(chuàng)傷弧菌菌液，并調(diào)整至最佳工作濃度(1×106cfu/mL)，用排槍以100 μL/孔包被于酶標板上，置恒溫培養(yǎng)箱中45 ℃包被過夜直至干燥。用PBST洗滌酶標板3次，200 μL/孔，5 min/次。加入封閉液(1 %BSA/PBST)200 μL/孔，恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃孵育2 h。PBST洗滌液又洗板3次，5 min/次。加入PBST稀釋的創(chuàng)傷弧菌兔抗血清(用PBST按1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000，1∶128 000，1∶256 000，1∶512 000，1∶1024 000進行倍比稀釋，每個稀釋度做2孔平行)100 μL/孔，陰性對照孔加入相同稀釋度的等量陰性兔血清，30 ℃孵育1 h。PBST再洗板3次，5 min/次。用PBST按1∶20 000稀釋的羊抗兔酶標抗體100 μL/孔加入酶標板中，37 ℃孵育30 min。繼續(xù)用PBST洗板4次，5 min/次。加入OPD底物溶液(按照每10 mL OPD底物溶液臨用前加入30 μL的30%H2O2)50 μL/孔，顯色10 min。最后加入2 mol/L的H2SO4終止顯色，50 μL/孔，酶標儀上測A492。間接ELISA檢測法測定。以S/N值≥2的最高稀釋倍數(shù)為該樣品的血清效價(S為樣品的A492，N為陰性對照的A492)。

1.4 創(chuàng)傷弧菌兔抗血清與鰻鱺病原菌的交叉ELISA試驗

以創(chuàng)傷弧菌為例，將制得的A595=0.1的創(chuàng)傷弧菌菌液用包被液稀釋100倍后得到約1×106cfu/mL的菌懸液，按100 μL/孔加入96孔酶標板中，于干燥箱中45 ℃包被過夜直至干燥。同法包被其他37株菌株的菌液，每株菌包被2孔。創(chuàng)傷弧菌兔抗血清用PBST分別按1∶256 000、1∶128 000進行稀釋，根據(jù)1.3的間接ELISA檢測法進行試驗。當樣品A492<陽性對照A492×50%時且其S/N值小于2判定為不交叉，當陽性對照A492×50%≤樣品A492<陽性對照A492×80%時且其S/N值小于2判定為交叉菌，當樣品A492≥陽性對照A492×80%且其S/N值大于2時判定為創(chuàng)傷弧菌。

1.5 攻毒死亡后鰻鱺不同組織懸液的檢測

用ELISA方法檢測創(chuàng)傷弧菌、遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌分別攻毒死亡后的鰻鱺的肝臟、腎臟、鰓。樣品采集方法如下：解剖鰻鱺并取出各臟器，分別先用剪刀剪碎，再用研缽進行粗研磨，用離心管稱取0.1 g，加入1 mL PBS混勻，離心5 s取上清液，用PBS進行倍比稀釋，即質(zhì)量濃度分別為0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25，0.003 125g/mL，每個質(zhì)量濃度做2孔平行，100 μL/孔包被于酶標板上，恒溫培養(yǎng)箱中45 ℃包被過夜至干燥，同時做陽性、陰性和空白對照，陰、陽性對照的創(chuàng)傷弧菌液包被濃度均為1×106cfu/mL，陰性對照以兔陰性血清代替抗血清。以樣品A492≥陽性對照A492×80%且P/N值≥2(P為陽性對照A492)判定為檢出。創(chuàng)傷弧菌兔抗血清用PBST分別按1∶128 000、1∶64 000、1∶32 000進行稀釋，據(jù)1.3的間接ELISA檢測法進行試驗。

2 結(jié)果

2.1 兔抗創(chuàng)傷弧菌血清效價

本研究在檢測創(chuàng)傷弧菌抗血清效價時采用了3個細菌的包被濃度，分別為1×105，1×106，1×107cfu/mL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1×106cfu/mL的包被效果最好。以1×106cfu/mL的抗原菌液包被ELISA板，不同稀釋倍數(shù)的兔抗創(chuàng)傷弧菌血清ELISA檢測結(jié)果如表2所示。由表2可知，當血清稀釋倍數(shù)為1∶512 000時，S/N值>2，故該兔抗血清的效價為1∶512 000。

表2 兔抗創(chuàng)傷弧菌血清ELISA效價的測定結(jié)果

2.2 兔抗創(chuàng)傷弧菌血清與其他病原菌的交叉試驗結(jié)果

用兔抗創(chuàng)傷弧菌血清與38株細菌進行ELISA交叉實驗，當兔抗創(chuàng)傷弧菌血清稀釋度為1∶256 000或1∶128 000，菌液包被濃度為1.0×106cfu/mL時，除創(chuàng)傷弧菌外，其他37株菌的A492均小于陽性對照的一半，且其S/N值均小于2(見表3、表4)。表明這37菌株鰻鱺病原菌均不與兔抗創(chuàng)傷弧菌血清產(chǎn)生明顯的ELISA交叉反應(yīng)。

表3 兔抗創(chuàng)傷弧菌血清(1∶256 000)的交叉試驗結(jié)果

表4 兔抗創(chuàng)傷弧菌血清(1∶128 000)稀釋時的交叉試驗結(jié)果

2.3 攻毒死亡鰻鱺不同組織懸液檢測結(jié)果

分別采集創(chuàng)傷弧菌、遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌攻毒死亡后的鰻鱺肝臟、腎臟、鰓等組織懸液，經(jīng)ELISA板包被后采用兔抗創(chuàng)傷弧菌血清進行檢測。由表5、表6可知，將兔抗創(chuàng)傷弧菌血清1∶64 000稀釋時，鰓包被質(zhì)量濃度為0.025～0.1 g/mL條件下可檢出創(chuàng)傷弧菌；而當血清1∶32 000稀釋時，鰓包被質(zhì)量濃度為0.025～0.05 g/mL和腎臟包被濃度為0.0125 g/mL條件下均可檢出創(chuàng)傷弧菌。

表5 細菌攻毒死亡鰻鱺檢測結(jié)果平均值(血清1∶64 000稀釋)

表6 攻毒死亡鰻鱺檢測結(jié)果平均值(血清1∶32 000稀釋)

3 討論

提高ELISA檢測法準確性的最重要因素是采用高效價的特異性兔抗血清，高倍稀釋的兔抗血清可以降低抗原抗體反應(yīng)中的非特異吸附水平，增強抗原抗體的特異性反應(yīng)，進而提高檢測方法的靈敏度和準確性[11]。本試驗檢測的兔抗創(chuàng)傷弧菌血清效價高達1∶512 000(見表2)，表明該血清為高效價的特異性血清，可用于特異性檢測創(chuàng)傷弧菌。為確保該法能特異性檢出鰻鱺體內(nèi)的致病性創(chuàng)傷弧菌，本研究采用實驗室分離的另37株病原菌(見表1)進行交叉試驗。結(jié)果表明，高倍稀釋后的兔抗創(chuàng)傷弧菌血清與其他37株菌均未發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)(見表3、表4)。因此，用該血清檢測發(fā)病或死亡鰻鱺體內(nèi)的創(chuàng)傷弧菌將具有良好的特異性和準確的檢測效果[12]。

本研究用稀釋度為1∶64 000和1∶32 000的兔抗創(chuàng)傷弧菌血清時均能特異性檢測出創(chuàng)傷弧菌。當血清1∶64 000稀釋時鰓組織包被質(zhì)量濃度的范圍較廣(0.025～0.1 g/mL)；而1∶32 000稀釋時，鰓包被質(zhì)量濃度稍窄(0.025～0.05 g/mL)，但同時可從0.0125 g/mL的腎臟組織中檢出創(chuàng)傷弧菌(見表5、表6)。文獻[13-14]研究表明，組織包被質(zhì)量濃度過高或過低均可影響檢測效果，過低可能因菌量太少而達不到最低檢測限，過高可能受組織中非特異性物質(zhì)的干擾。本研究未在肝臟中檢測到創(chuàng)傷弧菌，這可能與該菌感染后的定植位置相關(guān)。本試驗在血清稀釋度為1∶128 000時也進行了感染死亡鰻鱺的檢測，但未檢測到創(chuàng)傷弧菌，可能與血清檢測菌體(見表3、表4)和檢測組織所要求的抗體濃度不同有關(guān)(見表5、表6)。另外，本研究僅檢測了鰻鱺常見的3種病原菌(創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌和鰻鱺愛德華氏菌)感染死亡后的臟器，有必要用其他鰻鱺病原菌進行攻毒和檢測，以進一步驗證該抗血清的檢測效果。

由于攻毒或自然感染后病原菌在臟器中的含菌量往往可以達到1×106cfu/g組織以上，故本次檢測采用1×106cfu/mL的病原菌作為陽性對照，但若組織中達不到此含菌量，則可能無法被本次建立的方法檢出[15]。由于直接用組織懸液包被在ELISA板上進行抗原吸附的效果易受組織蛋白的干擾，余俊紅等[13]在檢測鰻弧菌時對組織懸液進行了100 ℃煮沸5～10 min的前處理，可降低組織蛋白的干擾，增加抗原樣品的吸附能力；王艷等[16]采用dot-ELISA代替間接ELISA方法進行試驗并較好地改善了蛋白干擾的問題。

綜上所述，本研究獲得的兔抗創(chuàng)傷弧菌高效價血清對該菌的菌體檢測特異性好，其對該菌攻毒感染死亡的鰻鱺也有較高的檢出率，擬在鰻鱺養(yǎng)殖實踐中取發(fā)病鰻鱺的鰓(0.025～0.1 g/mL)和腎臟組織(0.0125 g/mL)采用1∶32 000稀釋的抗體進行快速檢測。同時，本研究結(jié)果為創(chuàng)傷弧菌病快速檢測試劑盒的研制建立了條件。