響應(yīng)面法優(yōu)化矮地茶中3種有效成分提取工藝

肖鵬飛，王良貴，張 新，艾雨欣，代 青

（麗水學院生態(tài)學院，浙江麗水323000）

矮地茶為紫金牛科紫金牛屬植物紫金牛Ardisia japonica的干燥全株，常用于新久咳嗽、喘滿痰多、濕熱黃疽、經(jīng)閉瘀阻、風濕痹痛和跌打損傷的治療[1]。矮地茶中主要有效成分巖白菜素、槲皮素與山奈酚等與其臨床藥理密切相關(guān)[2]。因此，探究矮地茶中主要有效成分的提取工藝可為其質(zhì)量控制與綜合利用提供實驗基礎(chǔ)。響應(yīng)面優(yōu)化法以其好預(yù)測性、實驗簡單、高效等特點在中藥提取、中藥制劑工藝、中藥處方篩選等方面得到很好應(yīng)用[3－4]。黃懿等報道了應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化矮地茶中多糖提取工藝[5]，但以矮地茶中巖白菜素、槲皮素與山奈酚為提取對象的工藝優(yōu)化還未見報道。因此，本文以矮地茶中巖白菜素、槲皮素與山奈酚提取率的綜合評分為指標，基于單因素試驗結(jié)果，以星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化矮地茶中有效成分提取工藝，為矮地茶綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生的新鮮矮地茶全株于2016年11月從浙江麗水蓮都區(qū)藥農(nóng)處購得，經(jīng)主任中藥師鑒定為紫金?？浦参镒辖鹋?，然后以去離子水清凈、60℃真空烘干、粉碎、過80目篩后備用。

Agilent 1100型高效液相色譜儀（20 μL定量進樣環(huán)、Extend-C185μm、4.6 mm×250 mm色譜柱（美國安捷倫公司））；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（總功率250 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；槲皮素對照品（批號：100081-200907）、巖白菜素對照品（批號：111532-201203）購于中國食品藥品檢定研究院；山奈酚對照品（百靈威科技有限公司，純度98%），甲醇、乙腈（色譜純，美國（TEDIA）天地試劑公司），水為高純水，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

預(yù)實驗及參考相關(guān)文獻[6-8]確定測定槲皮素色譜條件為流動相乙腈-0.4%冰醋酸水溶液（60:40，V/V），檢測波長372 nm；巖白菜素測定條件為流動相甲醇-水（35:65，V/V），檢測波長274 nm；山奈酚測定條件為流動相乙腈-0.5%冰醋酸水溶液（40:60，V/V），檢測波長359 nm，進樣量20 μL，流動相流速1.0 mL·min-1，柱溫為室溫。

1.2.2 對照品溶液的制備

以甲醇為溶劑配制濃度分別為 23.00、11.50、2.300、1.150、0.5750、0.2875 mg·L-1槲皮素對照品溶液，12.00、4.800、2.400、1.200、0.6000 mg·L-1山奈酚對照品溶液；以甲醇 - 水（2：1，V/V） 為溶劑配制 10.42、4.170、2.083、1.042、0.5210 mg·L-1巖白菜素對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液制備

精密稱取矮地茶粉末1.0 g，置于具塞碘量瓶中，加入20 mL所選提取劑，置于37℃水浴浸泡0.5 h，以所選功率超聲處理45 min，G5砂芯漏斗過濾，濾渣重復(fù)提取1次，過濾，合并濾液，以提取劑定容到50 mL，從中準確移取25 mL到100 mL圓底燒瓶中，加5%鹽酸10 mL及甲醇5 mL，回流至無沉淀產(chǎn)生，旋蒸近干，氮氣吹干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，混勻，過0.45 μm有機濾膜即為供試品溶液。

1.3 分析方法精密度和穩(wěn)定性試驗

對1.2.3項供試液按1.2.1項色譜條件連續(xù)分析5次，依色譜圖中槲皮素、山奈酚和巖白菜素的相應(yīng)色譜峰面積計算三者峰面積的相對標準偏差值RSDs。分別在0、2、4、6、8、12 h按1.2.1項條件分析同一供試液，記錄槲皮素、山奈酚和巖白菜素色譜峰面積，計算三者峰面積的RSDs。

1.4 回收率試驗

分別準確稱取6份已知含量矮地茶粉末0.5 g于具塞錐形瓶中，精密加入相當質(zhì)量的槲皮素、山奈酚和巖白菜素對照品，按1.2.3項制備供試液和1.2.1項分析，計算槲皮素、山奈酚和巖白菜素平均回收率以及相應(yīng)RSDs。

1.5 單因素試驗

分別以提取時間（min）、提取溫度（℃）、液料比（mL·g-1）、超聲功率（W）和提取劑乙醇濃度（%，體積分數(shù)）為考察因素，觀察變化其中一個因素對槲皮素、巖白菜素和山奈酚提取率的影響。參照方法1.2.3制備供試品溶液，按1.2.1項進行分析。提取率（P%）表達式為：

1.6 CCD-RSM優(yōu)化提取工藝

基于CCD-RSM試驗精度高、數(shù)學模型預(yù)測性好的特性[9-10]，在單因素試驗基礎(chǔ)上應(yīng)用Design-Expert10.0.3.1軟件中CCD-RSM設(shè)計了5因素［提取時間X1（min）、提取溫度X2（℃）、液料比X3（mL·g-1）、超聲功率X4（W）和乙醇濃度X5（%，體積分數(shù)）］5水平表（見表1）。以槲皮素提取率（PQ）、巖白菜素提取率（PB）和山奈酚提取率（PK）為基礎(chǔ)計算綜合因子C[11]：

式中，10，60，30 為相應(yīng)有效成分加權(quán)系數(shù)，CQ、CB、CK分別代表 C槲皮素、C巖白菜素和 C山奈酚，其中 Ci＝Pi/Pimax。

表1 因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

按1.2.1項色譜條件依次分析1.2.2項下對照品溶液，外標法定量，以峰面積A對質(zhì)量濃度ρ（mg·L-1）進行線性回歸，得到回歸方程：A槲皮素=-113+881.3 ρ槲皮素（r=0.999 6，線性范圍 0.287 5 ～ 23.0 mg·L-1，檢出限 0.005 2 μg），A山奈酚=-1.85+70 077.62 ρ山奈酚（r=0.999 5，線性范圍 0.60 ～ 24.0 mg·L-1，檢出限 0.011 μg），A巖白菜素=0.94+25 863.71 ρ巖白菜素（r=0.999 8，線性范圍 0.521 ～ 20.83 mg·L-1，檢出限 0.002 8μg），色譜圖如圖1。由圖1中3種有效成分保留時間的差異可見，在所建立的色譜分析下3種有效成分得到良好分離。

2.2 分析方法精密度和穩(wěn)定性試驗

按1.3項分析方法得到槲皮素、山奈酚和巖白菜素的色譜峰面積RSDs分別為2.11%、1.14%與1.87%，表明儀器精密度良好，三者理論板數(shù)均高于1 700。在0、2、4、6、8、12 h時按1.2.1項條件分別分析同一供試液得到槲皮素、山奈酚和巖白菜素峰面積的RSDs分別為2.71%、1.18%和1.64%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 矮地茶3種有效成分HPLC圖

2.3 回收率試驗

按1.4項獲得槲皮素、山奈酚和巖白菜素平均回收率分別為97.08%、107.2%、98.11%，峰面積RSDs分別為2.58%、1.47%和1.53%。

2.4 單因素試驗

單因素試驗結(jié)果見圖2。圖2顯示有效成分的提取率隨液料比、乙醇濃度、超聲功率、提取溫度、提取時間的增大先上升，然后分別在液料比30 mL·g-1、乙醇濃度75%、超聲功率225 W、40℃下提取60 min基本達到最大值。圖2中（a）、（c）、（e）圖顯示巖白菜素提取率隨提取時間、液料比和乙醇濃度增大而快速上升，說明上述3個因素對巖白菜素提取率的影響大于其他2種有效成分。從單因素試驗結(jié)果難于比較所考察的5個因素各自對PQ、PB和PK的貢獻大小，因素間交互作用對考察目標的貢獻不明確。

圖2 單因素試驗

2.5 CCD-RSM優(yōu)化

以表1各因素水平按表2試驗編號進行實驗，PQ、PB、PK和C結(jié)果見表2。對表2中C進行多元線性回歸擬合，結(jié)果顯示二階交互模型擬合好，以各因素實際數(shù)值擬合的回歸方程為：

C=179.9+6.438X1-8.553X2+2.282X3-1.441X4-1.104X5-0.0248X1X2-0.0709X1X3-0.0381X1X4-0.0111X1X5+0.0314X2X3+0.0888X2X4+0.0312X2X5-0.0218X3X4+0.0178X3X5-5.34×10-3X4X5。

回歸方程一次項各項系數(shù)絕對值的大小反映了各因素對綜合因子C的影響程度，系數(shù)的正負反映了影響的方向。由方程可知，對C的影響程度依次為X2＞X1＞X3＞X4＞X5，交互作用影響C的順序為X2X4＞X1X3＞ X1X4＞ X2X3＞ X2X5＞ X1X2＞ X3X4＞ X3X5＞ X1X5＞X4X5。從方程一次項系數(shù)可知，提取時間、液料比對槲皮素提取率、山奈酚提取率呈正相關(guān)性，提取溫度、超聲功率和乙醇濃度則呈負相關(guān)性，這與單因素試驗結(jié)果不同，說明了上述回歸方程是各因素綜合所得。對該模型進行方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗的結(jié)果見表3?；貧w方程中各變量對響應(yīng)值C影響的顯著性用F檢驗來判定，概率P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，即P＜0.01時影響為高度顯著，P＜0.05時影響顯著。由表3可知，模型P值均＜0.000 1、失擬項P＞0.05和模型的校正決定系數(shù)R2Adj為0.861 5，說明二階交互模型有極高的顯著性，模型擬合度良好；X5、X4、X3、X2和 X2X4、X1X3、X1X4、X2X5、X1X2的 P 值均＜0.05，表明它們對 C 有顯著影響。所以，為更清晰表達單個因素和兩因素交互作用對試驗影響，刪除擬合回歸方程中的非顯著項后得到的回歸方程為：

C=179.9-8.553X2+2.282X3-1.441X4-1.104X5-0.0248X1X2-0.070 9X1X3-0.038 1X1X4+0.088 8X2X4+0.031 2X2X5。

對C有顯著影響的兩因素交互作用三維曲面圖見圖3。

表2 CCD-RSM試驗及其結(jié)果

表2 續(xù)表

表2 續(xù)表

表3 回歸統(tǒng)計方差分析結(jié)果

圖3 顯著交互項對C響應(yīng)面圖

優(yōu)選的提取工藝為1.0 g矮地茶粉末加65%乙醇20 mL，在32℃水浴、超聲功率162 W下提取48 min，預(yù)測槲皮素提取率0.003 71%、巖白菜素提取率0.736%、山奈酚提取率0.068 2%，綜合因子C為83.32。

2.6 驗證試驗

稱取1.000 g矮地茶粉末加65%乙醇20 mL，在30℃水浴、超聲功率150 W下提取50 min，平行5份，得到槲皮素、巖白菜素和山奈酚平均提取率分別為0.003 35%、0.741%、0.070 2%；RSD分別為3.1%、2.6%、2.8%，綜合因子83.75，驗證值和預(yù)測值誤差在±0.3%范圍內(nèi)，無顯著性差異，擬合方程可較好地描述評價指標與因素間關(guān)系，具有實際價值。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果顯示，應(yīng)用CCD-RSM優(yōu)選的矮地茶中槲皮素、巖白菜素和山奈酚3種有效成分提取參數(shù)具有實際操作性，平行性驗證試驗說明實驗結(jié)果與模型預(yù)測值無顯著性差異，優(yōu)化建立的數(shù)學模型可指導(dǎo)試驗實踐，為矮地茶中有效成分的綜合利用提供技術(shù)支持。

矮地茶是許多中藥復(fù)方制劑中的一味中藥，因此探討矮地茶有效成分的提取工藝有實際意義。由于超聲波輔助提取法具有提取效率高、快速、提取成分完全，故本實驗采用超聲輔助提取。槲皮素、巖白菜素和山奈酚的HPLC分析所用檢測波長是對相應(yīng)的適宜濃度標準品溶液進行190～700 nm全波長掃描后確定的。在制備供試品溶液時，若在測定指標成分含量時直接用提取液進樣，由于溶劑效應(yīng)導(dǎo)致峰變寬、分離效果差。故將提取液旋蒸、N2吹干后用甲醇溶解，既能保證浸膏可全部溶解，又能避免溶劑效應(yīng)。在以星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化矮地茶提取工藝中，本實驗采用綜合因子評價法，因為結(jié)合多個指標的綜合因子評價法更貼近中藥材的使用實際，避免了單一指標的優(yōu)選設(shè)計的局限性和不確定性。每味藥材含有多種化學組份，并且中醫(yī)理論研究表明，中藥材的功效是與其性味密切相關(guān)的，而藥材的性味是其中多個化學組份綜合表現(xiàn)出來的，因此，運用綜合因子評價法的提取工藝制備的制劑更符合實際。綜合因子C公式中槲皮素提取率（PQ）、巖白菜素提取率（PB）和山奈酚提取率（PK）的權(quán)重系數(shù)是依據(jù)各組份在矮地茶中含量并結(jié)合參考文獻［12-14］確定的，更具體詳實權(quán)重系數(shù)有待進一步研究。驗證實驗獲得的槲皮素、巖白菜素和山奈酚平均提取率和單因素實驗結(jié)果有所差異，這是由于驗證實驗是在多因素二次回歸優(yōu)化所得工藝條件下進行的，是綜合性的結(jié)果，而單因素試驗是線性的單一因素變化的實驗結(jié)果。