陳啟旺，孫郁文，魏 珂，張 浩，李躍紅

骨膜具有較強的成骨能力，在骨折愈合修復(fù)方面扮演著重要角色，被認為是促進骨移植材料在移植區(qū)域發(fā)揮修復(fù)作用的始動因素。國內(nèi)外有較多關(guān)于臨床上骨膜移植治愈骨缺損、骨不愈合的報道，然而骨膜移植存在供體不足、供區(qū)結(jié)構(gòu)功能損害及免疫排斥反應(yīng)等問題。近年來，組織工程技術(shù)取得了長足的進步。有學(xué)者采用脫細胞技術(shù)制備了去細胞骨膜[1]，并證實這種生物材料體內(nèi)相容性較好。本研究探索基于豬骨膜去細胞支架的制備及檢測，觀察骨膜去細胞支架與細胞共培養(yǎng)的情況，旨在為建立載藥微球—復(fù)合支架及支架性能的研究及聯(lián)合體內(nèi)移植奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器 高壓滅菌鍋(STIK)；恒溫水浴鍋(易晨儀器)；臺式恒溫震蕩儀(蘇州培英實驗設(shè)備有限公司)；超純水制備系統(tǒng)(Millipore)；電子天平(Sartorius)；光學(xué)顯微鏡(鳳凰光學(xué)儀器有限公司)；熒光顯微鏡(OLYMPUS)；掃描電子顯微鏡(ZEISS)；紫外分光光度計(Shimadzu)；酶標(biāo)儀(Molecular Devices)； Heraeus Labofuge 400R低溫超高速離心機(Heraeus)；Eppendorf Centrifuge 5810R型低溫冷凍離心機、移液槍(Eppendorf)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.1.2實驗試劑 Triton-X 100、十二烷基硫酸鈉(SDS)、青/鏈霉素、苯甲基黃酰氟(PMSF)、DNA酶、RNA酶、Tris-HCl(pH=8.0)、哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒、MTT、胎牛血清(FBS)、胰酶細胞消化液(上海碧云天生物有限公司)；羥脯氨酸試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich)；過氧乙酸(山東瑞泰奇洗滌消毒科技有限公司)；其他均為常規(guī)分析純試劑。

1.1.3實驗細胞 HFLS滑膜成纖維細胞(蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司)在37 ℃、 5% CO2的CM1-1培養(yǎng)液(由90% DMEM-H+10% FBS 配制而成)條件下貼壁生長。細胞中間凸起，兩端細長。

1.1.4實驗材料 豬骨膜取自新鮮帶肉豬扇骨，購于聯(lián)華超市，生產(chǎn)企業(yè)為浙江華騰食品有限公司，屠宰企業(yè)為桐鄉(xiāng)市崇福食品有限公司屠宰加工廠。

1.2 骨膜去細胞支架的制備

1.2.1豬扇骨骨膜的剝離 取新鮮的帶肉豬扇骨，使用潔凈的鈍性牙科刀剔除豬扇骨的筋膜及結(jié)締等組織。使用無菌手術(shù)刀及鑷子仔細緩慢剝離骨膜組織，盡量保持骨膜組織的完整，分離過程中不斷用棉簽沾取適量PBS溶液濕潤剝離區(qū)域。將剝離下的骨膜組織放入含有PBS溶液的培養(yǎng)皿中，用PBS溶液多次沖洗剝離下的骨膜組織，以去除骨膜上殘留的雜質(zhì)。

1.2.2骨膜去細胞支架的制備 將清洗后的骨膜組織置入PBS溶液，放入-80 ℃冰箱內(nèi)物理凍融24～48 h，促進組織疏松降解。取出骨膜組織于室溫下解凍；用無菌PBS溶液反復(fù)清洗3次，每次3～5 min。再將骨膜組織浸泡在2% Triton-X 100和濃度為3.5×10-5mol/L PMSF脫細胞高滲透溶液中，置37 ℃ 恒溫箱以100 r/min震蕩12 h。倒掉脫細胞高滲透溶液，PBS溶液反復(fù)清洗后加入1% SDS溶液，置37 ℃恒溫箱震蕩2 h。再將骨膜組織浸泡在混合消化酶液(含0.05 U/L DNA酶和0.1 g/L RNA酶)中水浴6 h(37 ℃)，以進一步消化細胞外基質(zhì)中殘留的核酸成分。用PBS溶液清洗骨膜組織并置于0.1%過氧乙酸溶液中浸泡消毒。再將該骨膜標(biāo)本浸泡在含0.1 U/L雙抗的PBS溶液中預(yù)防細菌污染。4 ℃保存，備用。

1.3 骨膜去細胞支架的鑒定

1.3.1掃描電鏡觀察 正常骨膜和經(jīng)去細胞處理的骨膜支架用3%的戊二醛固定24 h，用PBS溶液浸泡10 min，重復(fù)3次。經(jīng)乙醇梯度脫水，機械干燥后，送至浙江大學(xué)光電學(xué)院大型儀器有償服務(wù)平臺，真空鍍金后掃描觀察。

1.3.2DNA定性分析 HE染色：正常骨膜和去細胞骨膜經(jīng)4%多聚甲醛固定后，送樣至浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺進行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察攝片。DNA提取法：① 根據(jù)哺乳動物DNA提取試劑盒說明書，選取3組正常骨膜和6組去細胞骨膜進行DNA提取實驗。② 在液氮環(huán)境下研磨骨膜組織至粉末狀。③ 用電子天平稱取骨膜粉末，加入裂解液，渦旋混勻，50 ℃水浴過夜。④ 加入Tris水飽和酚，待溶液分層，丟棄下層酚相及中間相，重復(fù)操作1次。⑤ 加入氯仿分層后吸取上清液，加入醋酸銨和無水乙醇，上下輕柔顛倒混勻，觀察是否出現(xiàn)DNA絮狀沉淀。

1.3.3膠原定性和定量檢測 膠原定性檢測(Masson染色)：正常骨膜和去細胞骨膜由4%多聚甲醛溶液固定，送樣至浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺進行Masson染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察攝片。膠原定量檢測(羥脯氨酸測量法)： ① 根據(jù)羥脯氨酸試劑盒說明書，用電子天平稱取正常骨膜組織和去細胞骨膜組織。② 加入裂解液，于95 ℃水浴鍋中分解。③ 加入指示劑和pH調(diào)整液。④ 稀釋水解液，加入活性炭，3 500 r/min離心15 min，過程重復(fù)3次。⑤ 吸取上清液檢測吸光度，計算羥脯氨酸的含量，求出正常骨膜以及去細胞骨膜組織中膠原的含量。

1.4 滑膜成纖維細胞與骨膜去細胞支架共培養(yǎng)

1.4.1HFLS滑膜成纖維細胞的培養(yǎng) 選擇含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)原代HFLS滑膜成纖維細胞，隔2 d進行細胞換液，待HFLS滑膜成纖維細胞貼壁，細胞密度長至80%～90%后傳代。細胞和骨膜去細胞支架共培養(yǎng)實驗中使用第3代傳代細胞。

1.4.2細胞和支架共培養(yǎng)觀察 常規(guī)操作培養(yǎng)細胞，待第3代HFLS滑膜成纖維細胞長滿后加入胰蛋白酶消化，用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)制備細胞懸液，細胞計數(shù)，調(diào)整濃度為5×104～10×104/ml。取3塊96孔細胞板，每塊96孔板均設(shè)立4組，即無菌PBS空白對照組(無細胞，無培養(yǎng)基，加MTT和DMSO)、培養(yǎng)基對照組(無細胞，加培養(yǎng)基，加MTT和DMSO)、細胞實驗組(細胞，培養(yǎng)基，MTT和DMSO)以及細胞和骨膜去細胞支架共培養(yǎng)實驗組(細胞，骨膜去細胞支架，培養(yǎng)基，MTT和DMSO)，每組5個復(fù)孔。96孔板邊緣孔用無菌PBS填充。細胞實驗組、細胞和骨膜去細胞支架共培養(yǎng)實驗組每孔加入100 μl細胞懸液，每滴加3個孔，就重新吹打離心管中的細胞懸液，確保每孔接種的細胞密度相同。將這3塊96孔板分別置于5% CO237 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h和48 h。

1.4.3MTT檢測 采用培養(yǎng)至第3代的HFLS滑膜成纖維細胞和骨膜去細胞支架共培養(yǎng)以檢測骨膜去細胞支架的生物相容性。加入MTT檢測前吸除DMEM完全培養(yǎng)基，加入不含血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，避免血清對實驗結(jié)果的干擾。檢測時每孔加入20 μl 5 g/L MTT溶液，再將96孔板放回5% CO237 ℃恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 4 h后終止培養(yǎng)，取出96孔板，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，酶標(biāo)儀低速震蕩，使結(jié)晶充分溶解。OD490 nm處檢測各孔的吸光度。檢測細胞活性的時間點分別設(shè)定為24 h和48 h。由于MTT會和活細胞反應(yīng)生成藍紫色結(jié)晶甲瓚，則吸光度值越高，表明活細胞數(shù)量越多。

2 結(jié)果

2.1 骨膜去細胞支架鑒定評價

2.1.1掃描電鏡觀察 見圖1。豬骨膜組織經(jīng)去細胞處理后，組織表面的連續(xù)性并未中斷，并存在大小不等的孔隙。電鏡結(jié)果表明，去細胞操作對細胞外基質(zhì)成分以及骨膜結(jié)構(gòu)的完整性無明顯破壞效應(yīng)。

圖1 去細胞骨膜掃描電鏡觀察 ×1 000 組織表面的連續(xù)性未中斷(箭頭所示)，存在大小不等的孔隙(圓圈所示)

2.1.2HE染色和DNA抽提檢測 正常骨膜組織具有雙層結(jié)構(gòu)(疏松的形成層和致密的纖維層)，細胞核內(nèi)的染色質(zhì)以及胞質(zhì)的核酸經(jīng)HE染色后表現(xiàn)為藍紫色(見圖2A)。骨膜去細胞支架中未見明顯藍紫色的成分(見圖2B)，表明DNA成分去除干凈。利用DNA提取試劑盒抽提正常骨膜和骨膜去細胞支架的DNA，輕柔顛倒EP管后，可觀察到正常骨膜組織中產(chǎn)生DNA絮狀沉淀。而骨膜去細胞支架組織澄清，未見明顯沉淀現(xiàn)象。說明經(jīng)去細胞操作后，骨膜支架中無殘留DNA成分，細胞去除徹底。

2.1.3膠原含量的定性(Masson染色)與定量(羥脯氨酸試劑)檢測 正常骨膜組織大量膠原纖維排列緊密(見圖3A)，骨膜去細胞支架膠原纖維交錯連接，纖維的連續(xù)性良好，分布排列與處理前正常骨膜組織相似(見圖3B)。提示去細胞操作并沒有破壞細胞外基質(zhì)中的膠原成分。進一步檢測正常骨膜組織以及骨膜去細胞支架組織的羥脯氨酸含量。正常骨膜組織膠原含量為(5.55～7.85)×10-3/g，骨膜去細胞支架組織膠原含量為(6.26～9.86)×10-3/g。兩者膠原含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 兩種骨膜HE染色結(jié)果比較 ×20 A.正常骨膜組織；B.骨膜去細胞支架組織 圖3 兩種骨膜Masson染色結(jié)果比較 ×20 A.正常骨膜組織；B.骨膜去細胞支架組織

2.2 骨膜和細胞共培養(yǎng)結(jié)果利用培養(yǎng)基對照組吸光度數(shù)值調(diào)零，計算得到各吸光度值如下：24 h細胞實驗組吸光度值為0.735～1.832(1.284±0.549)，細胞和骨膜去細胞支架共培養(yǎng)實驗組吸光度值為1.106～1.839(1.473±0.366)；兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。48 h細胞實驗組吸光度值為1.417～1.598(1.508±0.090)，細胞和骨膜去細胞支架共培養(yǎng)實驗組吸光度值為1.043～1.668(1.356±0.313)；兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。細胞實驗組、細胞和骨膜去細胞支架共培養(yǎng)實驗組24 h與48 h組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

骨膜去細胞支架在制備過程中去除細胞的同時要能夠保證支架的完整性，由于制備過程復(fù)雜、參數(shù)眾多，不同學(xué)者采用不同的骨膜供體，探究了不同的優(yōu)化方法[2-3]。本實驗中，我們采用豬扇骨處骨膜，獲得骨膜去細胞支架。在制備方法上，增加了Triton-X 100孵育時間(24 h)，減少了SDS孵育時間(2 h)，并且適度調(diào)整了RNA/DNA酶的濃度與裂解時間。本研究通過掃描電鏡觀察、HE染色、Masson染色、DNA和膠原含量測定等一系列實驗進行鑒定，結(jié)果表明，獲得的骨膜去細胞支架保持了連續(xù)的細胞外基質(zhì)且達到去除DNA但保留膠原蛋白的要求。

本研究骨膜去細胞支架與成纖維細胞的體外培養(yǎng)證明了其具有良好的生物相容性，24 h細胞和骨膜去細胞支架共培養(yǎng)實驗組吸光度高于細胞實驗組，說明骨膜本身沒有毒性，對共培養(yǎng)的細胞沒有殺傷作用。48 h 吸光度兩實驗組之間沒有差別，進一步說明骨膜本身沒有毒性。從單個組來看，細胞實驗組48 h吸光度比24 h略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。細胞和骨膜去細胞支架共培養(yǎng)實驗組48 h吸光度略低于24 h，但同樣差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明制備的骨膜暫不適于細胞的快速生長繁殖，制備條件仍需要進一步完善。

具有良好生物相容性的骨膜去細胞支架的成功制備可以作為組織工程的支架材料，為種子細胞黏附、增殖、長入和分化提供良好的三維空間支持[4]，也可為復(fù)合生長因子發(fā)揮生物效應(yīng)提供平臺。