產(chǎn)地鮮切加工片姜黃HPLC指紋圖譜分析及4個成分含量測定

張立紅，岳顯可，張 云，馮婉紅，，吳秀紅2，

(1.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院，浙江 杭州 311201；2.杭州民泰中藥飲片有限公司，浙江 杭州 311201；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

片姜黃為姜科植物溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，具破血行氣、通經(jīng)止痛之功效[1]，主產(chǎn)于浙江溫州瑞安等地。片姜黃主要含揮發(fā)油[2]，化學(xué)成分組成有莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)酮、β-欖香烯，吉馬酮、呋喃二烯等[3]。具有抗腫瘤[4]、抗炎[5]、抗血栓[6]、抗病毒[7]、抗菌[8]、保肝[9]、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)等藥理作用。

對于片姜黃，由于現(xiàn)代有關(guān)著作記載的不一和變化，給教學(xué)、科研以及臨床用藥造成諸多困惑。1963年版《中國藥典》記載片姜黃為“姜科Zingiberaceae植物郁金CurcumaaromaticaSalish.的干燥地下根狀莖”；1985年版《中國藥典》稱“為莪術(shù)的縱切片”；1990-2015年版《中國藥典》則載“為姜科植物溫郁金C.wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根莖”；現(xiàn)行2015版《中國藥典》中片姜黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅收錄了來源、性狀、鑒別、總揮發(fā)油含量[1]，無水分、總灰分、HPLC含量測定等檢測項(xiàng)，這不利于片姜黃的質(zhì)量控制。筆者在研究過程中發(fā)現(xiàn)，市場上購買的片姜黃其來源、性狀、鑒別和總揮發(fā)油含量無顯著差別，但是通過HPLC含量測定和指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)指標(biāo)性成分莪術(shù)二酮、吉馬酮、呋喃二烯和β-欖香烯含量極低，有的甚至未檢出；不同批次市售片姜黃指紋圖譜的相似度也很低。

因此，本研究從片姜黃道地產(chǎn)區(qū)瑞安陶山、馬嶼等地收集2015年12月份采收加工的片姜黃飲片，對指標(biāo)性成分莪術(shù)二酮、吉馬酮、呋喃二烯和β-欖香烯含量進(jìn)行測定，并建立產(chǎn)地鮮加工片姜黃的指紋圖譜，為系統(tǒng)分析片姜黃質(zhì)量及其質(zhì)量的變化提供前期試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安U3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；Agilent Eclipse XDB -C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；FA1204B電子分析天平(濟(jì)南捷島分析儀器有限公司)；BP210S十萬分之一電子天平(Sartorius公司)；AXTG16G高速臺式離心機(jī)(鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 試藥

產(chǎn)地加工片姜黃共10批，采集自溫州瑞安市陶山、馬嶼等地，經(jīng)杭州民泰中藥飲片有限公司質(zhì)檢科鑒定為姜科植物溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根莖；呋喃二烯(批號：111824-201102，純度：99.4%)，莪術(shù)二酮(批號：111800-201302，純度：99.8%)，β-欖香烯(批號：100268-200401，純度：99.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院；吉馬酮(批號：160307，純度：98.57%)購自北京科量技術(shù)有限公司；甲醇、無水乙醇(廣東光華科技股份有限公司)為分析純；液相用乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Agilent Eclipse XDB -C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱，乙腈為流動相A，水為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫，0～10 min，20% ～32%A；10～15 min，32%～35% A；15～60 min，35%～80% A，60～66 min，80% ～83%A；66～76 min，83%～85% A；76～80 min，85%～90% A，80～90 min，90%～95% A；檢測波長為206 nm，流速1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，在此條件下，樣品中各待測組分與其相鄰色譜峰得到基線分離。見圖1。

注：1.片姜黃混合對照品；2.產(chǎn)地鮮加工片姜黃樣品；a.莪術(shù)二酮；b.吉馬酮；c.呋喃二烯；d.β-欖香烯

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品莪術(shù)二酮8.82 mg、吉馬酮9.75 mg、呋喃二烯10.21 mg、β-欖香烯10.54 mg置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，溶解搖勻，為對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液依次稀釋成濃度為莪術(shù)二酮880.24、440.12、176.05、88.02、44.01、35.21 μg/mL、吉馬酮961.06、480.53、192.21、96.11、48.05、38.44 μg/mL、呋喃二烯1 014.87、507.44、202.97、101.49、50.74、40.59 μg/mL、β-欖香烯1 045.57、522.79、209.11、104.56、52.27、41.82 μg/mL的對照品溶液，進(jìn)行測定分析。

2.3 供試品溶液的制備

稱取片姜黃粉末(過三號篩)0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇溶液，稱定重量，于頻率50 Hz超聲提取1 h后，冷卻，補(bǔ)重，搖勻靜置，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 產(chǎn)地鮮加工片姜黃指標(biāo)性成分含量測定

2.4.1 線性范圍考察 取“2.2”項(xiàng)制備的對照品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測得峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，各對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，莪術(shù)二酮：Y=9.108 2x+0.126 3(r=0.999 9)，吉馬酮Y=35.601x+4.815 6(r2=0.999 7)，呋喃二烯：Y=25.941x+4.930 7(r=0.999 7)，β-欖香烯：Y=15.748x+2.319 8(r=0.999 6)。由結(jié)果可知，在線性范圍莪術(shù)二酮0.352 1～8.802 4 μg、吉馬酮0.384 4～9.610 6 μg、呋喃二烯0.405 9～10.148 7 μg、β-欖香烯0.418 2～10.455 7 μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取濃度為莪術(shù)二酮176.05 μg/mL、吉馬酮192.21 μg/mL、呋喃二烯202.97 μg/mL、β-欖香烯209.11 μg/mL對照品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，進(jìn)樣6次，每次10 μL，測定峰面積，并計算RSD分別為莪術(shù)二酮0.74%、吉馬酮1.02%、呋喃二烯1.37%、β-欖香烯0.93%，表明儀器精密度符合試驗(yàn)要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取片姜黃供試品溶液分別于0、6、12、18、24、30 h進(jìn)樣，測定莪術(shù)二酮、吉馬酮、呋喃二烯、β-欖香烯峰面積值，計算RSD值分別為1.34%、1.18%、1.63%、0.82%，表明供試品溶液中各生物堿類成分在30 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取片姜黃粉末(過三號篩)按照“2.3”項(xiàng)下進(jìn)行供試品溶液制備(n=6)，測定并計算。結(jié)果樣品中莪術(shù)二酮平均含量15.458 mg/g，RSD為1.21%；吉

馬酮平均含量3.08 mg/g，RSD為0.72%；呋喃二烯平均含量11.383 mg/g，RSD為1.42%；β-欖香烯平均含量3.829 mg/g，RSD為1.73%，重復(fù)性符合試驗(yàn)要求。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知含量片姜黃粉末(過三號篩)6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品，測得峰面積積分值并計算含量與回收率。結(jié)果：莪術(shù)二酮平均回收率為98.37%，RSD=1.57%(n=6)；吉馬酮平均回收率為97.82%，RSD=1.73%(n=6)；呋喃二烯平均回收率為101.48%，RSD=1.69%(n=6)；β-欖香烯平均回收率為99.03%，RSD=1.46%(n=6)，表明準(zhǔn)確度良好，符合試驗(yàn)要求。

2.4.6 樣品含量測定 按“2.3”項(xiàng)下方法對片姜黃供試品溶液進(jìn)行制備，精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定并計算，結(jié)果如表1所示。

表1 產(chǎn)地鮮加工片姜黃4個指標(biāo)性成分含量 (mg/g)

2.5 不同批次產(chǎn)地鮮加工片姜黃指紋圖譜的建立

將收集的瑞安市陶山鎮(zhèn)、馬嶼鎮(zhèn)等地2015年12月份采收加工的10批片姜黃飲片，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”，對10批產(chǎn)地鮮加工片姜黃指紋圖譜進(jìn)行分析。經(jīng)多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配，生成片姜黃共有峰指紋圖譜(圖2)，發(fā)現(xiàn)10批產(chǎn)地鮮加工片姜黃共有峰26個(圖3)。并指認(rèn)出莪術(shù)二酮(13號峰)、吉馬酮(19號峰)、呋喃二烯(22號峰)、β-欖香烯(23號峰)，22號峰呋喃二烯為參照峰。10批片姜黃樣品共有峰相對保留時間RSD值為0.03%～0.18%，相對峰面積RSD值為6.84%～54.87%，說明不同批次片姜黃化學(xué)成分含量有一定差異(表2)。

圖2 不同批次產(chǎn)地鮮加工片姜黃指紋圖譜疊加

注：13(a)莪術(shù)二酮；19(b)吉馬酮；22(c)呋喃二烯；23(d)β-欖香烯

表2 不同批次產(chǎn)地鮮加工片姜黃指紋圖譜共有峰信息

2.6 不同批次產(chǎn)地鮮加工片姜黃指紋圖譜相似度評價

用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”對所得片姜黃指紋圖譜進(jìn)行分析，各批產(chǎn)地鮮加工片姜黃HPLC指紋圖譜的相似系數(shù)為0.991～1.000，說明片姜黃為溫郁金干燥根莖，來源單一，且地域局限，各化學(xué)成分組成無明顯差異。

編號S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10DZS110.9990.9990.9990.9990.9960.9970.9990.9970.9980.999S20.99910.9990.9990.9990.9980.9980.9990.9950.9990.999S30.9990.999110.9980.9980.9990.9990.9960.9990.999S40.9990.999110.9980.9980.9980.9990.9960.9991S50.9990.9990.9980.99810.9970.9980.9990.9950.9990.999S60.9960.9980.9980.9980.99710.9990.9980.9910.9970.998S70.9970.9980.9990.9980.9980.99910.9980.9920.9980.999S80.9990.9990.9990.9990.9990.9980.99810.9960.9991S90.9970.9950.9960.9960.9950.9910.9920.99610.9960.997S100.9980.9990.9990.9990.9990.9970.9980.9990.99610.999DZ0.9990.9990.99910.9990.9980.99910.9970.9991

3 討論

產(chǎn)地鮮加工片姜黃其化學(xué)成分含量也存在較大的差異。不同的種植地、不同的田間管理方式、不同的采收時間和不同的加工方式也會導(dǎo)致片姜黃品質(zhì)間的差異。

歷版《中國藥典》和各省市的炮制規(guī)范對片姜黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的記載都非常有限，本研究中得到的片姜黃指標(biāo)性成分是否能成為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而對片姜黃質(zhì)量進(jìn)行評價，還需進(jìn)一步對片姜黃飲片的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，分析不同儲存條件、不同儲存時間對片姜黃品質(zhì)的影響。

基于上述情況，筆者初步分析市場上流通的片姜黃：①來源不一，除溫郁金外，可能把其他產(chǎn)地如廣西莪術(shù)、蓬莪術(shù)也加工作為片姜黃用；②來源都為溫郁金，但是在儲存過程中，由于儲存條件不同，片姜黃化學(xué)成分發(fā)生了不定性變化。