束慧

摘 要 目的：觀察轉(zhuǎn)錄因子Dlx1對小鼠海馬神經(jīng)元細胞HT22細胞CRMP2（ Collapsin response mediator protein 2）基因的調(diào)控作用。方法： 構(gòu)建pcDNA3.1-HA-Dlx1質(zhì)粒及pGL3.0-Basic-CRMP2 promoter質(zhì)粒，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測Dlx1對CRMP2基因啟動子轉(zhuǎn)錄的影響; 檢測過表達Dlx1對內(nèi)源CRMP2基因表達的影響。結(jié)果：Dlx1直接結(jié)合在CRMP2啟動子上，促進CRMP2基因表達。結(jié)論： Dlx1促進CRMP2基因表達。

關(guān)鍵詞 Dlx1 腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白-2 啟動子 雙熒光素酶基因檢測

中圖分類號：R780.2文獻標識碼：A

腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2 （Collapsin response mediator protein 2， CRMP2）是CRMPs家族成員之一，均由564-572個氨基酸殘基組成。人源CRMP2基因定位于8p21.2，轉(zhuǎn)錄本Ⅱ與小鼠CRMP2基因編碼的蛋白氨基酸殘基長度均為572aa，只有兩個氨基酸不同。CRMP2表達量的下降和活性的降低均會引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森疾病、精神分裂癥和阿爾茨海默癥等。

Dlx1屬于Dlx基因家族成員之一，有研究表明Dlx家族基因在神經(jīng)元發(fā)育中有很重要的作用。本實驗通過觀察Dlx1對CRMP2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響，以及轉(zhuǎn)錄活性之間的關(guān)系，為進一步研究CRMP2基因表達的調(diào)控奠定了一定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

HT22細胞株（實驗室保留）;CRMP2質(zhì)粒構(gòu)建引物（蘇州金唯智生物科技有限公司）;二抗山羊抗兔（美國Abcam，ab6721）;CRMP2 siRNA（吉瑪基因股份有限公司）; CRMP2抗體（美國Abcam，ab129082）;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen， 11668019）;蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，p0012）;胎牛血清（美國Hyclone，Sh30370.03）;RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Hyclone，Sh30809.01）;Ripa裂解液（康為世紀， ?CW2334）;DNA質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司）;雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)（美國 Promega 公司）。

1.2質(zhì)粒構(gòu)建

采用PCR方法擴增得到鼠源Dlx1 cDNA片段，使用EcoR1/BamH1限制性內(nèi)切酶處理后插入pcDNA3.1-HA載體，構(gòu)建成pcDNA3.1-HA-Dlx1質(zhì)粒，PCR引物序列：上游引物序列- CCG GAATTC ATGACCATGACCACCATGCCAG，下游引物序列- GCG GGATCC TCACATCAGTTGAGGCTGCTGC。采用PCR方法擴增得到鼠源CRMP2啟動子片段，使用Kpn1/Mlu1限制性內(nèi)切酶處理后插入pGL3.0-Basic載體，構(gòu)建成pGL3.0-Basic-CRMP2 promoter質(zhì)粒，PCR引物序列：游引物序列-CGG GGTACCAAATATAAATATATATATATTTTAA，下游引物序列-GCACGCGT TCTCTCCGGGGGGCGGGAGGAAG。

1.3 ?Dlx1對CRMP2啟動子（-102- +1）103bp轉(zhuǎn)錄活性的影響

1.3.1不同濃度Dlx1對CRMP2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

HT22細胞株培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%霉素/鏈霉素雙抗），置 5% CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取生長狀態(tài)穩(wěn)定HT22細胞鋪板，培養(yǎng)過夜，待細胞豐度達到大約70%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。將pcDNA3.1-HA載體，pcDNA3.1-HA-Dlx1質(zhì)粒分別按不同的濃度（50ng，100ng，200ng）和pGL3-Basic -CRMP2 promoter質(zhì)粒（300ng），Renilla質(zhì)粒（10ng）共轉(zhuǎn)染到12孔板 HT22細胞，各轉(zhuǎn)染3個孔。48 h后收集細胞，分別使用100L 細胞裂解液裂解細胞，充分裂解，離心后取20L上清液用于雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測，具體步驟參考說明書。

1.3.2小鼠CRMP2基因啟動子特征性序列的定點突變

將小鼠CRMP2啟動子序列進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析（http：//jaspar. genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄因子Dlx1在預(yù)測得到的CRMP2啟動子區(qū)域具有潛在結(jié)合位點（tataaatata）。設(shè)計突變引物，將tataaatata序列突變掉構(gòu)建突變質(zhì)粒，將得到的突變質(zhì)粒送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序，將所得結(jié)果使用NCBI。

1.3.3檢測Dlx1對CRMP2野生型和突變型基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

將pcDNA3.1-HA載體，pcDNA3.1-HA-Dlx1質(zhì)粒分別和pGL3.0-Basic -CRMP2 promoter質(zhì)粒及突變質(zhì)粒，Renilla質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到12孔板HT22細胞，各轉(zhuǎn)染3個孔。按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。將pcDNA3.1-HA-Dlx1質(zhì)粒按不同的濃度（50ng，100ng，200ng）分別和pGL3.0-Basic -CRMP2 promoter質(zhì)粒/突變質(zhì)粒（300ng），Renilla質(zhì)粒（10ng）共轉(zhuǎn)染到12孔板 HT22細胞，各轉(zhuǎn)染3個復(fù)孔。48 h后收集細胞，分別使用100L 細胞裂解液裂解細胞，充分裂解，離心后取20L上清液用于雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測，具體步驟參考說明書。

1.4 ?Dlx1促進內(nèi)源性CRMP2基因表達

將pcDNA3.1-HA載體和pcDNA3.1-HA-Dlx1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到12孔板HT22細胞中，每孔轉(zhuǎn)染500ng，各轉(zhuǎn)染6個復(fù)孔;在HT22細胞中分別轉(zhuǎn)染10ul NC siRNA和siRNA CRMP2（濃度均為1nM）。48h后，提取mRNA和蛋白質(zhì)，分別做Q-PCR和Western Blot檢測CRMP2的mRNA和蛋白變化。Q-PCR引物序列：上游引物序列-GGGATCTGATGCTGACTTGGTC，下游引物序列-GGGAATGTAGCGTCCTGAGC。將收集的蛋白質(zhì)采用BCA試劑盒定量后，濃度調(diào)至一致，加入5咨涎撼逡海？5 ℃煮沸15 min。將30ug蛋白樣品加到10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠上樣孔中，80V電泳20min，120V電泳120min，使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜 （恒定電流：330 mA，70min）。室溫下5%的小牛血清封閉1 h，孵育CRMP2及GAPDH抗體（1：5000）室溫2h，TBST洗膜4次，每次5 min，孵育山羊抗兔二抗（1：10000）室溫下孵育1 h，洗膜4次，每次5 min，ECL發(fā)光液曝光收集結(jié)果。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和雙因素方差分析來進行顯著性分析，p<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，用Graph Pad Prism進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均值北曜嘉蟊硎盡？

2結(jié)果

2.1不同濃度Dlx1對CRMP2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

檢測不同濃度的轉(zhuǎn)錄因子Dlx1質(zhì)粒與pGL3.0-Basic -CRMP2 promoter質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HT22細胞時發(fā)現(xiàn)，隨著Dlx1濃度的增高，pGL3.0-Basic -CRMP2 promoter質(zhì)粒的熒光素酶活性顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P <0.001） ，結(jié)果如圖1所示。

圖1：pcDNA3.1-HA載體，不同濃度的轉(zhuǎn)錄因子Dlx1質(zhì)粒分別與pGL3.0-Basic -CRMP2 promoter質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HT22細胞，以Renilla為內(nèi)參，使用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測熒光酶的活性，結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)錄因子Dlx1濃度的增高，熒光素酶的活性也隨之增強，p<0.001。

2.2 ?Dlx1對CRMP2野生型和突變型啟動子質(zhì)粒熒光素活性的影響

通過生物信息學(xué)的分析，我們將Dlx1在預(yù)測得到的CRMP2啟動子區(qū)域具有潛在結(jié)合位點，通過PCR定點突變的方法去掉，構(gòu)建突變質(zhì)粒。然后將Dlx1分別與CRMP2野生型和突變型啟動子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，檢測熒光素酶的活性。Dlx1對野生型CRMP2啟動子質(zhì)粒熒光素活性有激活作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.001）;對CRMP2突變型啟動子質(zhì)粒熒光素活性無明顯激活作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），結(jié)果如圖2所示。

圖2：pGL3.0-Basic-CRMP2 promoter質(zhì)（下轉(zhuǎn)第293頁）（上接第288頁）粒中的Dlx1結(jié)合位點突變后，Dlx1不能促進光素酶的活性增強，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），說明Dlx1可以直接結(jié)合在CRMP2啟動子，并促進其轉(zhuǎn)錄。

2.3 ?Dlx1促進內(nèi)源性CRMP2基因表達

將不同濃度pcDNA3.1-HA-Dlx1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到HT22細胞，采用Q-PCR和Western Blot方法檢測CRMP2 mRNA和蛋白水平的變化，CRMP2 mRNA和蛋白水平均升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05，p<0.001），結(jié)果如圖3-A和3-B所示;在HT22細胞中Knock-down Dlx1，CRMP2 mRNA和蛋白水平均下降，有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）結(jié)果如圖3-C和3D所示，說明Dlx1可以促進CRMP2基因表達。

圖3-A：不同濃度過表達Dlx1組與對照組相比，CRMP2 mRNA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05，p<0.001）;圖3-B：不同濃度過表達Dlx1組與對照組相比，CRMP2 蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）;圖3-C：Knock-down Dlx1組與對照組相比，CRMP2 mRNA水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）;圖3-D：Knock-down Dlx1組與對照組相比，CRMP2 蛋白水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。

3討論

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)已得到廣泛應(yīng)用，為一些疾病發(fā)病機制的研究帶來了更寬廣的思路。諸多實驗已證明，CRMP2在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起到重要作用，其表達貫穿神經(jīng)元生命始終，發(fā)育階段達到高峰。同時CRMP2的表達量和神經(jīng)元位置也有相關(guān)性，例如，在小腦、海馬和嗅球等處CRMP2 表達較多。

本實驗通過采用生物信息學(xué)的方法，預(yù)測出轉(zhuǎn)錄因子Dlx1可能調(diào)控CRMP2的基因表達，并通過相關(guān)實驗加以驗證，首次發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子可以直接結(jié)合在CRMP2啟動子上，并促進CRMP2基因表達。基因轉(zhuǎn)錄過程十分復(fù)雜，通常情況下，許多轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物共同起調(diào)控作用，所以我們不能排除還有其他轉(zhuǎn)錄因子也參與這一調(diào)控過程，具體還有哪些轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控有待我們進一步研究探索。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子Dlx1與CRMP2啟動子相互結(jié)合從而調(diào)控其表達水平，為一些疾病發(fā)病研究和治療提供一定的理論支持。