劉莉莉，楊炳友

(黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

乳營養(yǎng)品質(zhì)低下對我國奶業(yè)造成了嚴重的影響，已成為我國奶業(yè)健康發(fā)展面臨的主要問題。乳蛋白作為乳營養(yǎng)品質(zhì)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，是一種營養(yǎng)價值很高的蛋白質(zhì)，主要包括酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白是乳中含量最高的蛋白質(zhì)，也是乳腺上皮細胞分泌的特有的磷酸化蛋白。酪蛋白主要分為4種：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白以及κ-酪蛋白。乳汁中αs-酪蛋白通常以多重磷酸化的形式存在，β-酪蛋白是乳中主要的酪蛋白，κ-酪蛋白是唯一含有乳糖成分的酪蛋白，起到穩(wěn)定酪蛋白微團的作用[1]。酪蛋白的分泌水平在一定程度上反映了產(chǎn)奶動物乳腺上皮細胞的泌乳能力[2]，故研究乳腺上皮細胞的泌乳功能常將酪蛋白作為一個評判指標。酪蛋白也是羊乳乳汁中的主要成分，不僅為山羊機體提供了豐富的氨基酸，而且還是生物活性肽的一種重要來源[3]。乳腺上皮細胞內(nèi)酪蛋白的合成主要受2條信號通路調(diào)控：JAK-STAT5 信號通路和mTOR信號通路[4]。JAK2-STAT5是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)乳蛋白合成的重要信號通路[5]。mTOR是在翻譯水平調(diào)節(jié)乳蛋白合成的重要信號通路。mTOR主要通過調(diào)節(jié)其下游的2個靶因子，即S6K1以及 4EBP1發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[6]。

在食品安全問題日益重視的今天，激素類及抗生素類藥物在畜牧業(yè)生產(chǎn)上的使用備受爭議，而中藥源自天然，并具有毒副作用小、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，用于泌乳動物增乳有其獨特優(yōu)勢[7-8]。鄭濤等[9]利用中藥通草處理乳腺上皮細胞，發(fā)現(xiàn)通草可以提高小鼠乳腺上皮細胞的泌乳量及乳中蛋白含量。孟海洋[10]證實，王不留行可以調(diào)控奶牛乳腺上皮細胞磷酸化mTOR和磷酸化STAT5等信號分子表達。

漏蘆來源于菊科植物祁州漏蘆[Rhaponticumuniflorum(L.) DC.]的干燥根，具有清熱、解毒、消癰、除腫等功效。含有漏蘆的復(fù)方中藥制劑能治療動物產(chǎn)后缺乳及促進產(chǎn)奶動物泌乳[11-12]，但有關(guān)漏蘆對奶山羊乳腺酪蛋白的合成及酪蛋白合成相關(guān)基因表達的影響國內(nèi)外尚未見報道。羊奶具有極其重要的營養(yǎng)價值，以奶山羊乳腺上皮細胞為模型，研究不同水平的漏蘆乙醇提取物對乳腺上皮細胞的活力、增殖能力以及酪蛋白合成相關(guān)基因表達的影響，旨在為進一步研究漏蘆對泌乳動物乳腺酪蛋白合成的調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

中藥漏蘆購自黑龍江省藥材公司，由黑龍江中醫(yī)藥大學于丹副教授鑒定為菊科藥用植物祁州漏蘆[Rhaponticumuniflorum(L.)DC.]的干燥根。奶山羊乳腺上皮細胞由東北農(nóng)業(yè)大學動物生物化學教研室提供。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自Gibco公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script RT Reagent Kit)、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(SYBR Primx ExTaq)購自TaKaRa公司。

1.3 漏蘆乙醇提取物的制備

將500 g祁州漏蘆切碎后，用90%乙醇回流提取2 h，共3次，合并濾液，經(jīng)減壓濃縮即得漏蘆乙醇提取物，得率為8.9%。使用前先用少量DMSO助溶，再用完全培養(yǎng)基配成試驗所需質(zhì)量濃度，過濾除雜除菌備用。

1.4 奶山羊乳腺上皮細胞培養(yǎng)

采用生長培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%FBS)于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)奶山羊乳腺上皮細胞，每隔24 h更換新鮮培養(yǎng)基。

1.5 漏蘆乙醇提取物對奶山羊乳腺上皮細胞活力和增殖能力影響的測定

將對數(shù)生長期的奶山羊乳腺上皮細胞接種于48孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞融合度達到70%～80%時，更換新鮮培養(yǎng)基。對照組細胞添加正常細胞培養(yǎng)基，各處理組細胞在添加正常細胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，同時添加不同劑量(質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400、600、800 μg/mL)的漏蘆乙醇提取物，每組5 個平行。細胞培養(yǎng)48 h，消化不同試驗組的乳腺上皮細胞，制成單細胞懸液，加入CASY 杯中，用 CASY 緩沖液對細胞懸液進行1∶1 000倍稀釋，利用CASY細胞活力分析儀測定細胞活力及增殖能力[13]。

1.6 漏蘆乙醇提取物對奶山羊乳腺上皮細胞酪蛋白合成相關(guān)基因表達影響的檢測

將處于對數(shù)生長期的奶山羊乳腺上皮細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞融合度達到70%～80%時，更換新鮮培養(yǎng)基，對照組細胞添加正常細胞培養(yǎng)基，各試驗組細胞在添加正常細胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，同時添加不同劑量(質(zhì)量濃度分別為25、50、100 μg/mL)的漏蘆乙醇提取物，每個處理5個平行。漏蘆乙醇提取物作用奶山羊乳腺上皮細胞48 h，收集細胞，TRizol法提取奶山羊乳腺上皮細胞RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script RT Reagent Kit)說明書進行反轉(zhuǎn)錄，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(SYBR Primx ExTaq)檢測奶山羊乳腺上皮細胞CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、STAT5、JAK2、mTOR、4EBP1和S6K1基因的mRNA表達水平。 試驗所用基因的引物序列見表1，選用β-actin作為內(nèi)參基因。采用 2-ΔΔCT相對定量的方法計算目的基因的mRNA表達豐度[13]。

表1 qRT-PCR中基因引物序列Tab.1 Sequences of gene primers for qRT-PCR

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示；采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 漏蘆乙醇提取物對奶山羊乳腺上皮細胞活力和增殖能力的影響

漏蘆乙醇提取物對奶山羊乳腺上皮細胞活力和增殖能力影響的試驗結(jié)果見圖1和圖2。與未添加漏蘆乙醇提取物的對照組相比，25、50、100 μg/mL漏蘆乙醇提取物處理的乳腺上皮細胞活力和增殖能力無顯著性變化(P>0.05)；而較高劑量(200～800 μg/mL)的漏蘆乙醇提取物明顯抑制了細胞的活力和增殖能力(P<0.05)。故本試驗后續(xù)選擇不抑制細胞生長增殖的添加質(zhì)量濃度(25、50、100 μg/mL)，研究漏蘆對奶山羊乳腺上皮細胞酪蛋白合成相關(guān)基因表達的影響。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同 The different lowercase letters show significant differences(P<0.05).The same below圖1 漏蘆乙醇提取物對奶山羊乳腺上皮細胞活力的影響Fig.1 The effects of ethanol extract from Rhaponticum uniflorum(L.)DC.on the viability of mammary epithelial cells in dairy goat

圖2 漏蘆乙醇提取物對奶山羊乳腺上皮細胞增殖能力的影響Fig.2 The effects of ethanol extract from Rhaponticum uniflorum(L.)DC.on the proliferation ability of mammary epithelial cells in dairy goat

2.2 漏蘆乙醇提取物對奶山羊乳腺上皮細胞酪蛋白基因mRNA表達的影響

漏蘆乙醇提取物對奶山羊乳腺上皮細胞酪蛋白基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3mRNA表達水平影響如圖3所示。與對照組細胞相比，漏蘆乙醇提取物(25、50、100 μg/mL)以劑量依賴的方式明顯促進乳腺上皮細胞CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3酪蛋白基因的mRNA表達(P<0.05)。

2.3 漏蘆乙醇提取物對奶山羊乳腺上皮細胞酪蛋白合成相關(guān)基因mRNA表達的影響

漏蘆乙醇提取物對奶山羊乳腺上皮細胞酪蛋白合成相關(guān)基因STAT5、JAK2、mTOR、4EBP1、S6K1mRNA表達水平影響如圖4所示。與對照組相比，25、50、100 μg/mL漏蘆乙醇提取物同樣以劑量依賴的方式顯著上調(diào)酪蛋白合成相關(guān)基因STAT5、JAK2、mTOR、S6K1的mRNA表達水平(P<0.05)，以劑量依賴方式顯著抑制4EBP1基因的mRNA表達(P<0.05)。

圖3 漏蘆乙醇提取物對奶山羊乳腺上皮細胞酪蛋白基因mRNA表達的影響Fig.3 The effects of ethanol extract from Rhaponticum uniflorum(L.)DC.on the mRNA expression of casein genes of mammary epithelial cells in dairy goat

3 結(jié)論與討論

動物乳腺的基本組成單位是上皮細胞，其活力和數(shù)量能影響乳腺的泌乳量。高云航等[18]將不同方法提取的復(fù)方中藥提取物體外作用于小鼠乳腺上皮細胞，結(jié)果顯示，適當劑量的中藥復(fù)方提取物可促進細胞增殖。孟海洋[10]利用王不留行提取液處理奶牛乳腺上皮細胞，發(fā)現(xiàn)其能顯著提高乳腺細胞的活力及增殖能力。周凡[19]研究表明，單味中藥重樓、澤蘭葉、半枝蓮在適當?shù)乃幜肯履艽龠M小鼠乳腺上皮細胞增殖，但藥物劑量過高或作用時間過長會抑制乳腺細胞活力。本試驗結(jié)果表明，較高劑量(200～800 μg/mL)漏蘆乙醇提取物抑制了奶山羊乳腺上皮細胞的活力和增殖能力，而低劑量(25～100 μg/mL)的漏蘆乙醇提取物對乳腺細胞活力和增殖能力無明顯的影響，這為后續(xù)試驗摸索出適當?shù)乃幬锾砑觿┝?，即選取對乳腺細胞無抑制作用的添加劑量(25～100 μg/mL)進行研究，但漏蘆對乳腺上皮細胞活力影響的機制還有待進一步研究。

前人研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥復(fù)方灌注液或單味中藥提取物能促進乳腺上皮細胞β-酪蛋白的表達。羅瑩[20]報道，采用適宜劑量的紫花地丁、黃芪、澤蘭、訶子中藥提取物處理奶牛乳腺上皮細胞，可以顯著促進β-酪蛋白的分泌。劉杰等[21]研究表明，甲珠、蒲公英水煎劑能以一定劑量依賴效應(yīng)提高奶牛乳腺細胞β-酪蛋白和乳糖的分泌。毛智斌等[22]發(fā)現(xiàn)，葎草黃酮作用的奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白表達量明顯上調(diào)。但前人研究多數(shù)集中于中藥對乳腺上皮細胞合成分泌β-酪蛋白能力的影響，而對其他酪蛋白基因表達能力的影響卻鮮有報道。本研究檢測了漏蘆乙醇提取物體外作用奶山羊乳腺細胞后，CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3等4種酪蛋白基因mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)漏蘆不僅能明顯促進CSN2基因的mRNA表達，而且也顯著上調(diào)其他酪蛋白基因CSN1S1、CSN1S2和CSN3mRNA的表達水平。

乳腺乳蛋白合成的一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是JAK2-STAT5通路，當乳腺細胞中催乳素等配體與其受體結(jié)合后，誘導(dǎo)受體二聚體化并激活JAK2。然后，JAK2使轉(zhuǎn)錄因子STAT5磷酸化，STAT5被激活并形成單體或多聚體轉(zhuǎn)位到細胞核中，與目的基因的啟動子區(qū)域特異性結(jié)合以激活轉(zhuǎn)錄，該通路對乳腺中乳蛋白的合成及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄有激活作用[23]。李萌等[24]報道，王不留行活性成分可能通過激活催乳素受體，進而激活STAT5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進其下游β-酪蛋白相關(guān)基因的表達。鄭濤等[9]發(fā)現(xiàn)，通草可能通過增強小鼠乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)錄激活因子STAT5的磷酸化水平，從而促進小鼠乳汁分泌。本試驗結(jié)果顯示，漏蘆乙醇提取物除能促進奶山羊乳腺上皮細胞酪蛋白基因的mRNA表達，該提取物也能以劑量依賴方式顯著提高乳腺細胞JAK2-STAT5通路關(guān)鍵信號分子JAK2和STAT5的mRNA表達。推測中藥漏蘆所含活性成分可能發(fā)揮一定的類雌激素作用，進而調(diào)節(jié)其他泌乳相關(guān)激素如催乳素而激活JAK2-STAT5通路；或者漏蘆能促進催乳素與其受體結(jié)合，進而激活JAK2并進一步活化STAT5，被激活的STAT5進入奶山羊乳腺細胞核啟動其下游乳蛋白合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活。

乳蛋白合成的另一條信號通路是mTOR通路，其下游S6K1、4EBP1蛋白的磷酸化水平增強能調(diào)節(jié)反芻動物乳腺上皮細胞乳蛋白合成[25]。S6K1可激活核糖體S6蛋白，S6蛋白能提高5′端含寡聚嘧啶的mRNA翻譯效率[26]。研究發(fā)現(xiàn)，S6K1在細胞增殖及周期進程中具有重要調(diào)節(jié)作用，它的活性可被mTOR上調(diào)[27]，但mTOR對4EBP1表達起負調(diào)節(jié)作用[28]。王不留行水浸提液可以提高奶牛乳腺上皮細胞磷酸化STAT5、S6K1及磷酸化mTOR的表達，進而促進乳蛋白合成[19]。本試驗結(jié)果也表明，漏蘆乙醇提取物能明顯上調(diào)mTOR通路中mTOR、S6K1的基因表達，并能引起4EBP1基因的表達量顯著降低。由此推斷，漏蘆乙醇提取物作用的奶山羊乳腺上皮細胞中mTOR信號通路對乳蛋白合成的調(diào)節(jié)不是通過4EBP1，而是通過促進乳腺細胞mTOR的表達，進而增強S6K1的磷酸化，提高其下游酪蛋白合成相關(guān)基因的翻譯表達；漏蘆乙醇提取物作用于奶山羊乳腺上皮細胞后，與酪蛋白合成有關(guān)的JAK2-STAT5及mTOR信號途徑可能存在一定的協(xié)同效應(yīng)，更有利于乳腺上皮細胞酪蛋白的合成。

綜上，漏蘆乙醇提取物的添加劑量為25、50、100 μg/mL時，各處理組細胞活力和增殖能力無明顯變化，而較高劑量(200～800 μg/mL)的漏蘆乙醇提取物明顯抑制乳腺上皮細胞的活力和增殖能力；漏蘆乙醇提取物可能通過調(diào)節(jié)奶山羊乳腺上皮細胞JAK2-STAT5 和mTOR信號通路相關(guān)基因的表達，進而促進細胞內(nèi)αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的合成。