何灝龍，鄭慧娥，高音來，陳楚淘，田浩梅

針刺加亞低溫對MCAO大鼠缺血側(cè)海馬組織miRNA歸屬通路及mir-34c-5p表達(dá)的影響

何灝龍，鄭慧娥，高音來，陳楚淘，田浩梅

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

觀察針刺加亞低溫對腦缺血再灌注損傷（CIRI）大鼠缺血側(cè)海馬組織miRNA歸屬通路及mir-34c-5p表達(dá)的影響，探討mir-34c-5p在CIRI中的作用機(jī)制。將60只SPF級健康SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、針穴組、亞低溫組和針刺加亞低溫組，每組10只。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，造模成功后約2 h且大鼠生命體征穩(wěn)定后進(jìn)行干預(yù)。針穴組選取“人中”“百會”“大椎”進(jìn)行針刺，1次/12 h，共6次；亞低溫組連續(xù)72 h放入低溫代謝籠中，保持肛溫（33±1）℃、鼓膜溫度（31±1）℃；針刺加亞低溫組同時采用針刺與亞低溫進(jìn)行干預(yù)。實驗結(jié)束后，觀察大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積，采用miRNA微陣列芯片技術(shù)篩選出組間差異基因并歸納信號傳導(dǎo)通路，實時定量PCR檢測缺血側(cè)海馬組織mir-34c-5p的表達(dá)。與正常組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高，腦梗死面積比明顯增加（＜0.01），差異表達(dá)miRNA數(shù)量分別為4、5個，且主要?dú)w屬M(fèi)APK、p53、Calcium、Jak-STAT及Neurotrophin信號通路，mir-34c-5p表達(dá)量明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，各干預(yù)組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低，腦梗死面積比明顯減少（＜0.05，＜0.01），但干預(yù)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05），針穴組、亞低溫組、針刺加亞低溫組差異表達(dá)miRNA數(shù)量分別為16、7、23個，且主要?dú)w屬M(fèi)APK、p53、Calcium、Jak-STAT及Neurotrophin信號通路，各干預(yù)組上調(diào)mir-34c-5p表達(dá)趨勢較明顯（＜0.01）；與針穴組、亞低溫組比較，針刺加亞低溫組大鼠mir-34c-5p表達(dá)量明顯增加（＜0.05）。針刺加亞低溫可降低CIRI大鼠神經(jīng)功能缺損評分，減少腦梗死面積，其機(jī)制可能是針刺加亞低溫可靶向多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從多途徑、多網(wǎng)絡(luò)調(diào)控CIRI，并與上調(diào)mir-34c-5p的表達(dá)量有關(guān)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

針刺；亞低溫；腦缺血再灌注損傷；信號通路；mir-34c-5p；大鼠

腦血管疾病是威脅人類健康的主要疾病之一，國外研究指出缺血性腦卒中占所有腦血管意外疾病的87%[1]。在腦缺血恢復(fù)血流供應(yīng)后，可導(dǎo)致病理損害加劇或產(chǎn)生不可逆的腦組織損傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）[2]。有研究表明，miRNA在CIRI中存在差異性表達(dá)，miRNA可能成為CIRI的重要治療方向[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺可有效抗CIRI[4]，亞低溫亦可抑制腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡[5-6]，而針刺加亞低溫治療CIRI的研究卻鮮有報道。mir-34c分布在大腦皮質(zhì)、小腦皮質(zhì)、嗅球以及海馬中[7]，其過度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯[8-9]，加劇缺血性腦卒中的神經(jīng)細(xì)胞死亡，形成不可逆性腦損傷，然而亦有部分研究認(rèn)為，mir-34c過表達(dá)可上調(diào)抗凋亡基因Bcl2，降低促凋亡基因Bax與Caspase 3，從而實現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的作用[10]。因此，本實驗通過觀察針刺結(jié)合亞低溫對CIRI大鼠缺血側(cè)海馬組織差異miRNA的表達(dá)并歸屬通路，探討其高表達(dá)的mir-34c-5p在CIRI中的表達(dá)影響，為miRNA靶向治療CIRI提供實驗依據(jù)和新的臨床治療思路。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量250～280 g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于SPF級動物房，自由攝食飲水。

1.2 主要試劑與儀器

miRNAs芯片（miRCURYTM芯片，Exiqon公司），4%多聚甲醛（長沙維爾生物科技有限公司），10%水合氯醛（長沙維爾生物科技有限公司），Trizol試劑（賽默飛生物技術(shù)公司），DEPC（美國Sigma公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），PBS（長沙維爾生物科技有限公司），TTC溶液（長沙維爾生物科技有限公司），引物（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。微血管電凝器（上海醫(yī)用激光儀器廠），IMS-100全自動雪花制冰機(jī)（上海錦玟儀器設(shè)備有限公司），水浴箱（恒豐HH-W600），超低溫冰箱（美菱），肛溫溫度計，高分辨率芯片掃描儀（美國Affymetrix公司），單絲尼龍栓線（北京西濃科技有限公司），熒光定量PCR儀（美國Thermo公司），一次性0.25 mm×13 mm華佗牌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.3 分組及造模

實驗大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，采用隨機(jī)數(shù)字法選取20只分為正常組、假手術(shù)組，剩余大鼠隨機(jī)分為模型組、針穴組、亞低溫組、針刺加亞低溫組，每組10只。正常組不做任何處理。參照Zea Longa[11]線栓法并進(jìn)一步改進(jìn)操作步驟，制備大腦中動脈閉塞（MCAO）模型大鼠。實驗前禁食不禁水24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g），仰臥位固定，于頸前正中線剪毛消毒后作一小切口，充分暴露頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）及頸內(nèi)動脈（ICA），將ECA及ECA與ICA之間的交通支電凝，永久性結(jié)扎CCA下端，用彎鑷把CCA和ICA撐起拉直，暫時結(jié)扎阻斷ICA，用眼科剪在距ECA與ICA分叉近心端3 mm處CCA向上剪一斜形小口，夾持前端包被多聚賴氨酸的MCAO栓線從切口處插入，并解開ICA處活結(jié)，把栓線沿ICA方向推進(jìn)約18～20 mm后遇阻力即停，從而栓塞右側(cè)大腦中動脈，再逐層縫合創(chuàng)面并用細(xì)線固定MCAO栓線在體外的部分，確保線栓不從切口處脫出。在腦組織缺血約120 min后，用彎鑷夾持栓線尾端向外緩慢拔出約10 mm，從而實現(xiàn)CIRI模型。假手術(shù)組只從切口處將MCAO栓線插入約8～10 mm，不栓塞大腦中動脈，其余操作同造模組。造模后120 min，待大鼠生命體征穩(wěn)定，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分[11]，無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)為0分，提尾時腦缺血對側(cè)前肢不能伸直為1分，爬行時向腦缺血對側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分，爬行時向腦缺血對側(cè)傾倒為3分，無法自由活動、意識喪失為4分，評分在l～3分者納入實驗。剔除0分和4分大鼠，按相同造模步驟補(bǔ)足造模大鼠數(shù)量，本實驗動物死亡率約30%。

1.4 干預(yù)方法

造模大鼠于麻醉清醒后（造模后120 min）進(jìn)行干預(yù)。正常組常規(guī)飼養(yǎng)不作任何干預(yù)，假手術(shù)組和模型組只捆綁固定不針刺，每次捆綁30 min，1次/12 h。針穴組根據(jù)《實驗針灸學(xué)》[12]及大鼠實驗圖譜[13]并模擬人體腧穴骨度分寸法進(jìn)行取穴：“百會”位于大鼠頂骨正中，平刺2 mm；“大椎”位于大鼠第7頸椎與第1胸椎間，后背正中線上，直刺3 mm；“人中”位于大鼠鼻尖下1 mm正中處，向鼻中隔直刺2 mm。行捻轉(zhuǎn)手法1 min，頻率90次/min，15 min后捻轉(zhuǎn)1次，留針30 min，1次/12 h，共6次。亞低溫組參照舒鑫[14]改良亞低溫方法：大鼠置于帶有冰塊的低溫代謝籠中，維持鼓膜溫度（31±1）℃、肛溫（33±1）℃，持續(xù)干預(yù)72 h。針刺加亞低溫組則同時使用針刺與亞低溫干預(yù)72 h。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 神經(jīng)功能缺損評分

參照Zea Longa[11]方法在大鼠造模麻醉清醒后與干預(yù)治療72 h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損5分制評分。

1.5.2 腦梗死面積比

干預(yù)72 h后，每組隨機(jī)選取5只大鼠，迅速麻醉取腦后放入超低溫冰箱內(nèi)冷凍20 min。去嗅球、小腦和低位腦干，每隔2 mm，然后連續(xù)切5個冠狀腦切片，將切片浸沒在2%TTC染色液中，于37 ℃水浴箱中避光孵育30 min，期間搖晃數(shù)次，使切片染色均勻。染色結(jié)束后，4%多聚甲醛溶液將腦切片固定24 h，肉眼觀察腦梗死部位，用數(shù)碼相機(jī)拍攝并將照片輸入電腦。篩選出缺血梗死面積最大的一片，采用圖像分析系統(tǒng)掃描獲取腦損傷對側(cè)總面積（S1）、腦損傷側(cè)非梗死面積（Sr）的數(shù)據(jù)，參考Swanson[15]公式計算腦梗死面積比，即IS（%）＝（S1－Sr）÷2S1×100%。

1.5.3 差異miRNA篩選

每組隨機(jī)抽取3只大鼠快速斷頭取腦，提取缺血側(cè)大腦海馬總RNA，用紫外分光光度計測定濃度，用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，按照試劑盒的順序標(biāo)記合格RNA后，再與miRNA芯片進(jìn)行雜交，再洗脫、離心，得到干燥芯片。使用高分辨率芯片掃描儀采集圖像，Genepix Pro 6.0分析數(shù)據(jù)輸出至Excel中，使用局部回歸方法扣除背景值，LOWESS方法[16]進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理，取熒光信號比值＞2者為上調(diào)，＜0.5者為下調(diào)，采用平均連接和歐氏距離的層級法進(jìn)行聚類分析，后進(jìn)行靶基因預(yù)測及GO和Pathway富集分析。

1.5.4 缺血側(cè)海馬mir-34c-5p表達(dá)

將剩余大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，在大腦變軟融化前快速取出缺血側(cè)海馬組織，置于凍存管內(nèi)，放入液氮罐中低溫保存。提取海馬組織總RNA，用紫外分光光度計測定濃度，取2 μL RNA與loading buffer premix按1∶5比例混勻后，進(jìn)行RNA變性瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察；按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟合成cDNA，用引物（上海生工提供）建立PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行實時定量PCR與定量PCR擴(kuò)增程序。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 針刺加亞低溫對模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響

與正常組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；各造模組神經(jīng)功能缺損評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；與模型組比較，針穴組、亞低溫組、針刺加亞低溫組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；組內(nèi)治療前后比較，針穴組、亞低溫組、針刺加亞低溫組治療后大鼠神經(jīng)功能缺損評分均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；針穴組、亞低溫組、針刺加亞低溫組組間比較，大鼠神經(jīng)功能缺損評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)前后神經(jīng)功能缺損評分比較[M（QR），分]

組別只數(shù)干預(yù)前干預(yù)后 正常組100.0（0）0.0（0） 假手術(shù)組100.0（0）0.0（0） 模型組101.5（1）**##1.5（1）**## 針穴組101.4（1）**##0.8（0）▲▲**##& 亞低溫組101.5（1）**##0.8（0）▲▲**##& 針刺加亞低溫組101.4（1）**##0.4（1）▲▲&&

2.2 針刺加亞低溫對模型大鼠腦梗死面積比的影響

經(jīng)切片、TTC染色后，顯示紅色為正常大腦組織，白色為缺血梗死灶。正常組和假手術(shù)組均未觀察到梗死灶。與正常組和假手術(shù)組比較，其余4組大鼠腦組織均出現(xiàn)不同程度的白色梗死灶（＜0.01）；與模型組比較，針穴組、亞低溫組、針刺加亞低溫組大鼠腦梗死面積均明顯縮?。ǎ?.05，＜0.01）；與亞低溫組比較，針刺加亞低溫組大鼠腦梗死面積明顯減少（＜0.05）。結(jié)果見圖1、表2。

2.3 針刺加亞低溫對模型大鼠缺血側(cè)海馬組織miRNA表達(dá)譜的影響

通過隨機(jī)方差模型對每個miRNA的顯著性水平（即值）進(jìn)行計算，再按照＜0.05篩選差異表達(dá)miRNA，共62個。詳見圖2。

圖1 各組大鼠腦梗死面積（TTC染色）

表2 各組大鼠缺血側(cè)腦梗死面積比比較[M（QR）]

組別只數(shù)腦梗死面積比 正常組5 0.00（0.00） 假手術(shù)組5 0.00（0.00） 模型組533.46（9.00）**## 針穴組519.79（18.18）**##& 亞低溫組521.77（9.55）**##&& 針刺加亞低溫組5 8.91（13.39）**##&△

注：與正常組比較，**＜0.01；與假手術(shù)組比較，##＜0.01；與模型組比較，&＜0.05，&&＜0.01；與亞低溫組比較，△＜0.05

注：橫坐標(biāo)代表各組樣本（K.正常組；J.假手術(shù)組；M.模型組；Z.針穴組；Y.亞低溫組；ZY.針刺加亞低溫組）；縱坐標(biāo)表示差異miRNA；紅色表示高表達(dá)，綠色表示低表達(dá)

2.4 針刺加亞低溫對模型大鼠缺血側(cè)海馬組織差異基因表達(dá)數(shù)量的影響

與正常組比較，模型組有4個miRNA表達(dá)有差異；與假手術(shù)組比較，模型組有5個miRNA表達(dá)有差異；與模型組比較，針穴組有16個miRNA表達(dá)有差異，亞低溫組有7個miRNA表達(dá)有差異。針刺加亞低溫組有23個miRNA表達(dá)有差異。針刺加亞低溫組差異表達(dá)數(shù)量最多，恰好是針穴組與亞低溫組數(shù)量之和。

2.5 針刺加亞低溫對模型大鼠缺血側(cè)海馬組織差異miRNA歸屬信號通路的影響

與正常組比較，模型組差異miRNA主要?dú)w屬M(fèi)APK、p53、Calcium、Neurotrophin信號通路；與假手術(shù)組比較，模型組歸屬M(fèi)APK、p53、Calcium、Jak-STAT、Neurotrophin信號通路；與模型組比較，針穴組歸屬M(fèi)APK、p53、Calcium、Jak-STAT、Neurotrophin信號通路；亞低溫組歸屬M(fèi)APK、p53、Calcium、Jak-STAT、Neurotrophin信號通路；針刺加亞低溫組歸屬M(fèi)APK、p53、Calcium、Jak-STAT、Neurotrophin信號通路，且針刺加亞低溫組差異miRNA數(shù)量及其調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最為豐富。結(jié)果見表3。

表3 各組與模型組間差異miRNA數(shù)量及miRNA主要?dú)w屬信號通路（條）

組別MAPK信號通路p53信號通路Calcium信號通路Jak-STAT信號通路Neurotrophin信號通路 正常組 21 102 假手術(shù)組 12 222 針穴組 751285 亞低溫組 31 213 針刺加亞低溫組1561169

2.6 針刺加亞低溫對模型大鼠缺血側(cè)海馬組織mir-34c-5p表達(dá)的影響

與正常組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織海馬mir-34c-5p表達(dá)量明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，各治療組mir-34c-5p表達(dá)量明顯增加（＜0.01）；與針穴組比較，亞低溫組大鼠腦組織海馬mir-34c-5p表達(dá)量明顯增加（＜0.05），針刺加亞低溫組mir-34c-5p表達(dá)量進(jìn)一步增加（＜0.05）；與亞低溫組比較，針刺加亞低溫組大鼠腦海馬mir-34c-5p表達(dá)量明顯增加（＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠海馬mir-34c-5p相對表達(dá)量比較（±s）

3 討論

局限性腦缺血是臨床常見腦血管疾病，屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”范疇。臨床研究表明，針刺可有效改善腦缺血后神經(jīng)功能[17]。本實驗根據(jù)經(jīng)絡(luò)腧穴理論，選取督脈上具有熄風(fēng)、醒腦、開竅等作用的“百會”“大椎”“人中”?！镀諠?jì)方》提到“治中風(fēng)，氣塞涎上，不語昏危者，百會、風(fēng)池、大椎、肩井、曲池、間使、三里等七穴”。另《玉龍歌》云：“中風(fēng)之病癥非輕……先補(bǔ)后瀉如無應(yīng)，再刺人中立便輕?！爆F(xiàn)代實驗研究發(fā)現(xiàn)，針刺督脈“百會”“大椎”“人中”可有效促進(jìn)MCAO模型大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，改善神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的病理變化，促進(jìn)血管新生，減少腦梗死面積，從而達(dá)到一定程度的腦保護(hù)作用[18-20]。有研究顯示，亞低溫治療可明顯減輕CIRI，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，其機(jī)制可能是通過調(diào)控相關(guān)的凋亡因子，抑制CIRI后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，起到對神經(jīng)元的保護(hù)作用[21-23]。

miRNAs是一種非編碼單鏈小RNA分子，作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，miRNA控制大腦疾病不同方面，可改變?nèi)毖俟嘧p傷的反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞存活與凋亡過程中多種關(guān)鍵因子的表達(dá)[3]。mir-34c-5p與mir-34c-3p分別是mir-34c家族中一個成熟的miRNA，在細(xì)胞死亡、凋亡、遷移和侵襲中有著不可或缺的作用，且mir-34c-3p主導(dǎo)阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而mir-34c-5p的作用卻有別于mir-34c-3p[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，mir-34c-5p可通過激活JAK2/STAT3信號通路直接抑制細(xì)胞凋亡[25]；此外，mir-34c-5p亦可通過靶向抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)從而發(fā)揮抗凋亡作用[26]。本實驗通過采用基因微陣列技術(shù)，篩選出CIRI大鼠差異表達(dá)的miRNA中包括mir-34c-5p，且mir-34c-5p可能通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)，在局部腦缺血損傷的MCAO大鼠中發(fā)揮重要的腦保護(hù)作用[27]。

在本實驗研究中，造模后大鼠出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損狀態(tài)，腦梗死面積明顯擴(kuò)大，提示造模成功。針刺、亞低溫及針刺加亞低溫干預(yù)均可降低CIRI大鼠神經(jīng)功能缺損評分，減少腦梗死面積，說明3種不同干預(yù)方法均有效，且與亞低溫組比較，針刺加亞低溫組在改善神經(jīng)功能與腦梗死面積方面效果更好，這可能與針刺和亞低溫的疊加效應(yīng)有關(guān)。與模型組比較，針穴組、亞低溫組和針刺加亞低溫組差異miRNA的主要?dú)w屬信號通路包括MAPK信號通路、p53信號通路、Calcium信號通路、Jak-STAT信號通路及Neurotrophin信號通路，且3組差異miRNA數(shù)量均不相等，而針刺加亞低溫組數(shù)量最多，說明在CIRI過程中針刺結(jié)合亞低溫可激活更多miRNA的表達(dá)，靶向多條信號通路，從多途徑、多網(wǎng)絡(luò)調(diào)控CIRI。造模后，MCAO大鼠腦內(nèi)mir-34c-5p表達(dá)有下降趨勢，而經(jīng)干預(yù)后，針穴組、亞低溫組及針刺加亞低溫組mir-34c-5p表達(dá)量顯著增加，推測mir-34c-5p是修復(fù)CIRI所致腦組織損傷的表達(dá)基因。綜上，針刺加亞低溫療法可降低MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損評分，減少腦梗死面積，其機(jī)制可能是針刺加亞低溫療法可靶向多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從多途徑、多網(wǎng)絡(luò)調(diào)控CIRI，以及與上調(diào)mir-34c-5p的表達(dá)量有關(guān)，從而發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用。

[1] BENJAMIN E J, BLAHA M J, CHIUVE S E, et al. Heart disease and stroke statistics-2017 Update：a report from the American Heart Association[J]. Circulation,2017,135(10)：e146-e203.

[2] ELTZSCHIG H K, ECKLE T.Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation[J]. Nat Med,2011,17(11)：1391-1401.

[3] DI Y, LEI Y, YU F, et al. MicroRNAs expression and function in cerebral ischemia reperfusion injury[J]. Journal of Molecular Neuroscience,2014,53(2)：242-250.

[4] 張晨蕾,李永峰,惠建榮,等.針刺調(diào)控不同信號通路防治缺血性腦血管病的研究進(jìn)展[J].針刺研究,2018,43(8)：531-536.

[5] 黃杰,李麗茹,張斌.亞低溫對大鼠局灶性腦缺血再灌注后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及保護(hù)作用[J].中國老年學(xué)雜志,2016,36(17)：4153-4154.

[6] 林亞平,劉琴,陳楚淘,等.針刺聯(lián)合亞低溫對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織MAPK/ERK通路及凋亡相關(guān)因子的影響[J].中南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2017,42(4)：380-388.

[7] TIAN H M, HE P, ZHANG Y C, et al. Effects of acupuncture on the number of associated protein phosphorylation in brain tissues of MCAO rats based on protein microarray technique[J]. J Acupunct Tuina Sci,2017,15(2)：74-80.

[8] HE L, HE X, LIM L P, et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network[J]. Nature,2007,447(7148)：1130-1134.

[9] TARASOV V, JUNG P, VERDOODT B, et al. Differential regulation of microRNAs by p53 revealed by massively parallel sequencing：miR-34a is a p53 target that induces apoptosis and G1-arrest[J]. Cell Cycle,2007,6(13)：1586-1593.

[10] LIU X D, ZHANG L Y, ZHU T C, et al. Overexpression of miR-34c inhibits high glucose-induced apoptosis in podocytes by targeting Notch signaling pathways[J]. International Journal of Clinical and Experimental Pathology,2015,8(5)：4525-4534.

[11] LONGA E Z, WEINSTEIN P R, CARLSON S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1)：84-91.

[12] 李忠仁.實驗針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社,2007：1-31.

[13] 華興邦,周浩良.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗，1991(1)：1-5.

[14] 舒鑫.亞低溫對腦出血大鼠HIF-1α、SOCS-3、Caspase-3表達(dá)影響的實驗研究[D].瀘州：瀘州醫(yī)學(xué)院,2013.

[15] SWANSON R A. A Semiautomated method for measuring brain infarct volurne[J]. J Ceveb Blood Flow Metab,1990,10(2)：293-295.

[16] BOLSTAD B M, IRIZARRY R A, ASTRAND M, et al. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias[J]. Bioinformatics,2003,19(2)：185- 193.

[17] 劉雪珂,李夢,祝金豹,等.針灸治療缺血性腦卒中研究進(jìn)展[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2018,19(4)：76-79.

[18]鄧容,皮敏,楊卓欣,等.電針任督脈對腦缺血再灌注大鼠應(yīng)激-損傷-修復(fù)相關(guān)信號的影響(英文)[J].世界針灸雜志：英文版,2016,26(3)：22-30.

[19] 賀平,顏虹,蔣素容,等.針刺大椎、人中、百會穴對腦缺血再灌注損傷大鼠腦線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2018,38(1)：55-58.

[20] 蔣素容,武姿含,高音來,等.針刺大椎、百會、人中穴對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織p-VEGF蛋白表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2018,38(11)：1262-1266.

[21] 鄒瑜,周迎,高瑋.淺低溫聯(lián)合艾芬地爾對大鼠全腦缺血再灌注后凋亡誘導(dǎo)因子的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2014,94(17)：1353-1356.

[22] YU D, WANG X, ZHOU F, et al. Mild hypothermia modulates the expression of nestin and caspase-3 in the sub-granular zone and improves neurological outcomes in rats with ischemic stroke[J]. Oncotarget,2017,8(65)：109191-109200.

[23] 陳楚淘,陳文,林亞平,等.針刺聯(lián)合亞低溫對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織相關(guān)miRNA功能表達(dá)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2018, 38(5)：574-578.

[24] WU Z, WU Y, TIAN Y, et al. Differential effects of miR-34c-3p and miR-34c-5p on the proliferation, apoptosis and invasion of glioma cells[J]. Oncology Letters,2013,6(5)：1447-1452.

[25] NING L, DONG M, YANSHA C, et al. Downregulation of SIRT6 by miR-34c-5p is associated with poor prognosis and promotes colon cancer proliferation through inhibiting apoptosis via the JAK2/STAT3 signaling pathway[J]. International Journal of Oncology,2018,52(5)：1515-1527.

[26] CATUOGNO S, CERCHIA L, ROMANO G, et al. miR-34c may protect lung cancer cells from paclitaxel-induced apoptosis[J]. Oncogene,2013,32(3)：341-351.

[27] 張淑藝,秦紅亞,商溪溪,等.miR-34c在大鼠局灶性腦缺血模型中的表達(dá)[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2017,40(1)：72-76.

Effects of Acupuncture Plus Mild Hypothermia on miRNA Belonged Pathway and Expression of mir-34c-5p in Ischemic Hippocampal Tissues of MCAO Rats

HE Haolong, ZHENG Huie, GAO Yinlai, CHEN Chutao, TIAN Haomei

To observe the effects of acupuncture plus mild hypothermia on the miRNA attribution pathway and mir-34c-5p expression in the ischemic hippocampal tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion injury (CIRI); To explore the mechanism of action of mir-34c-5p in CIRI.Totally 60 healthy SPF SD rats were randomly divided into normal group, sham-operation group, model group, acupuncture group, mild hypothermia group, acupuncture plus mild hypothermia group (A+MH group), with 10 rats in each group. Middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was established by suture method. The model was successfully constructed for about 2 h and the vital signs of the rats were stable for intervention. The acupuncture group received acupuncture treatment at the acupoints of Renzhong, Baihui, and Dazhui, once per 12 hours, a total of 6 times. The mild hypothermia group were put into the cryogenic metabolic cage and maintained the rectal temperature at (33±1)℃and tympanic temperature at (31±1)℃ for 72 hours. The A+MH group adopted both acupuncture and mild hypothermia intervention. After the treatment, neurological function deficit score and cerebral infarct area were observed. miRNA microarray chip technology was used to screen out differentially expressed genes and signal transduction pathways. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression level of mir-34c-5p in the hippocampal tissue of the ischemic side.Compared with the normal group and the sham-operation group, neurological function deficit score and cerebral infarct area ratio in the model group significantly increased (<0.01). The number of differentially expressed miRNAs was 4 and 5, respectively, and mainly belonged to MAPK, p53, Calcium, Jak-STAT and Neurotrophin signaling pathways, and the expression of mir-34c-5p significantly decreased (<0.05). Compared with the model group, the acupuncture group, the mild hypothermia group, the A+MH group had significantly reduced neurological function deficit score and cerebral infarct area ratio (<0.05,<0.01). However, there was no statistical significance among the treatment groups. The number of differentially expressed miRNAs was 16, 7 and 23 in acupuncture group, the mild hypothermia group, the A+MH group, respectively, and mainly belonged to MAPK, p53, Calcium, Jak-STAT and Neurotrophin signaling pathways, and the expression of mir-34c-5p significantly increased significantly (<0.05). Compared with acupuncture group and mild hypothermia group, mir-34c-5p expression increased significantly in A+MH group (<0.05).Acupuncture plus mild hypothermia therapy can reduce the neurological function deficit score and cerebral infarction area of CIRI rats, possibly by targeting multiple signal transduction pathways and regulating CIRI from multiple channels and networks, and is related to the up-regulation of mir-34c-5p expression, so as to play an important neuroprotective role.

acupuncture; mild hypothermia; cerebral ischemia reperfusion injury; signaling pathway; mir-34c-5p; rats

R245

A

1005-5304(2020)05-0042-06

10.3969/j.issn.1005-5304.201910008

國家自然科學(xué)基金（81874508、81303051）；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃（2017-287）；湖南省中醫(yī)藥管理局課題（201961）

田浩梅，E-mail：451358104@qq.com

（2019-10-02）

（2019-10-27；編輯：華強(qiáng)）