陳新怡，曾梅艷，宋厚盼，陳小娟，林也，蔡雄，喻嶸，彭清華

左金丸抗幽門(mén)螺桿菌感染的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制研究

陳新怡1，2，曾梅艷2，宋厚盼1，2，陳小娟1，2，林也1，2，蔡雄1，喻嶸2，彭清華1

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法探究左金丸抗幽門(mén)螺桿菌（Hp）感染的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）檢索左金丸化學(xué)成分，篩選并預(yù)測(cè)其入血活性成分和作用靶點(diǎn)，檢索疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中與Hp感染相關(guān)的作用靶點(diǎn)，構(gòu)建左金丸成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交互網(wǎng)絡(luò)，獲得左金丸抗Hp的特征性基因；通過(guò)DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述特征性基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析；利用Cytohubba篩選出左金丸抗Hp感染的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過(guò)TCMSP篩選、預(yù)測(cè)得到左金丸32個(gè)入血活性成分和197個(gè)作用靶點(diǎn)。GO分析共得到199條富集結(jié)果，其中生物過(guò)程包含炎癥反應(yīng)、RNA信號(hào)轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)等152條，細(xì)胞組分包含細(xì)胞核、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白復(fù)合物等19條，分子功能包含細(xì)胞因子活性、DNA結(jié)合、ATP結(jié)合等28條。KEGG分析結(jié)果顯示，Jak-STAT信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞周期信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等65條通路與左金丸抗Hp感染密切相關(guān)。經(jīng)Cytohubba篩選得到CXCL8、IL10、IL4、VEGFA、MMP9等10個(gè)關(guān)鍵基因。左金丸抗Hp感染具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，可為其活性成分研究和抗Hp藥效及機(jī)制研究提供依據(jù)。

左金丸；幽門(mén)螺桿菌；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子機(jī)制；信號(hào)通路

幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種微需氧型革蘭陰性細(xì)菌，是目前已知的唯一一種生長(zhǎng)于人類胃部的細(xì)菌[1]。流行病學(xué)研究表明，我國(guó)自然人群Hp總感染率為56.22%，其中廣東地區(qū)Hp感染率最低（42.01%），西藏地區(qū)Hp感染率最高（84.62%）[2]。Hp感染已被證實(shí)與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、胃癌等多種胃腸疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并可通過(guò)飲食在人與人之間傳播[3]。目前，抗Hp感染是防治多種消化性系統(tǒng)疾病的重要指征和有效途徑，方案首選鉍劑四聯(lián)療法。但四聯(lián)療法存在靶向性單一、不良反應(yīng)大、患者個(gè)體差異大（依從性差）等缺點(diǎn)，Hp對(duì)抗生素的耐藥性增高已成為Hp根除率下降及根除失敗的主要原因[4]。此外，我國(guó)作為Hp感染率較高的國(guó)家，有研究表明，Hp對(duì)克拉霉素和甲硝唑等抗生素的原發(fā)耐藥率和多重耐藥率逐年上升[5]。中醫(yī)藥憑借其多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同調(diào)節(jié)效應(yīng)，具有抑菌效果顯著及不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，闡明中醫(yī)藥抗Hp可能涉及的分子機(jī)制對(duì)治療Hp感染性疾病具有重要的臨床意義。

左金丸源于朱丹溪《丹溪心法?火方》，由黃連和吳茱萸組成。本方重用黃連，苦寒清熱瀉火，主入心、肝、胃經(jīng)；少佐吳茱萸，辛熱以制黃連之寒，以止痛、止嘔見(jiàn)長(zhǎng)，主入足厥陰肝經(jīng)。兩藥相伍，具有清肝瀉火、和胃止痛的功效，是治療肝火犯胃證的中醫(yī)經(jīng)典方劑之一。本方臨床應(yīng)用廣泛，常用于治療急慢性胃炎、功能性胃腸疾病、反流性食管炎、消化性潰瘍等屬肝火犯胃者。藥理研究表明，左金丸抑殺Hp效果顯著，同時(shí)具有調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力、抑制胃酸分泌、抗?jié)?、?zhèn)痛、抗炎等作用[6]。目前左金丸抗Hp感染的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚未完全闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)作為藥物研究的新策略，基于“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，探究藥物與疾病的關(guān)聯(lián)性。其整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中醫(yī)整體觀、辨證論治、組方配伍的原則不謀而合[7]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法，對(duì)左金丸多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)進(jìn)行分析，以探究其治療Hp感染的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用于Hp相關(guān)性潰瘍等疾病的治療提供依據(jù)。

1 方法

1.1 左金丸化學(xué)成分篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http://5th.tcmspw.com/tcmsp.php），分別以“黃連”和“吳茱萸”為關(guān)鍵詞，檢索其全部化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)。根據(jù)各化學(xué)成分的吸收、分布、代謝及排泄（ADME）參數(shù)，將藥物口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18設(shè)置為篩選條件[8]，獲得左金丸中活性較高的化學(xué)成分。

1.2 左金丸作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)TCMSP檢索左金丸生物活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，并結(jié)合其他數(shù)據(jù)庫(kù)（如TCMID、HIT、NPACT等）查詢靶點(diǎn)的基因（蛋白）名稱。采用Cytoscape3.7.0軟件（http://www.cytoscape.org/）對(duì)上述活性成分和靶點(diǎn)之間的關(guān)系進(jìn)行構(gòu)建與分析，獲取左金丸生物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)表示分子和靶蛋白，邊表示成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.3 幽門(mén)螺桿菌相關(guān)疾病靶點(diǎn)檢索

以“Helicobacter pylori”為關(guān)鍵詞，檢索治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD，http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、遺傳關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)（GAD，https://geneticassociationdb. nih.gov/）、人類孟德?tīng)栠z傳在線數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，https://www.omim.org/）、藥物基因數(shù)據(jù)庫(kù)（PharmGKB，https://www.pharmgkb.org/）、藥物銀行（DrugBank，https://www.drugbank.ca/）中與Hp感染相關(guān)的作用靶點(diǎn)，并刪除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.4 左金丸抗幽門(mén)螺桿菌蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)Bisogenet插件和String數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// string-db.org/）分別構(gòu)建和分析左金丸生物活性成分-靶點(diǎn)蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)、疾病-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)及上述兩者的交集PPI網(wǎng)絡(luò)。交集PPI網(wǎng)絡(luò)即為左金丸抗Hp感染的特征性基因。采用Cytoscape3.7.0將上述PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，以初步分析左金丸治療Hp感染的基因靶點(diǎn)。

1.5 GO功能富集分析

GO分析適用于對(duì)各物種的基因和蛋白功能進(jìn)行限定和描述，其表征包含生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）。本研究采用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)交集PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO富集分析，以探究左金丸抗Hp感染的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用。

1.6 KEGG通路富集分析

采用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)交集PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，以探究左金丸治療Hp感染的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白所涉及的信號(hào)通路。KEGG通路富集程度以值、富集因子（rich factor）、富集到通路上的基因數(shù)目（gene number）為評(píng)價(jià)指標(biāo)。其中rich factor指差異表達(dá)的基因中位于該通路的基因數(shù)量與所有注釋基因中位于該通路的基因總數(shù)的比值。KEGG通路富集分析結(jié)果通過(guò)R語(yǔ)言limma包（ggplot2）可視化處理后以氣泡圖呈現(xiàn)。

1.7 左金丸抗幽門(mén)螺桿菌感染關(guān)鍵基因分析

左金丸抗Hp感染的特征性基因網(wǎng)絡(luò)中連接度高的基因稱為hub基因，其對(duì)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性起重要作用，是基因調(diào)控的核心。CytoHubba包含多種對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排名的拓?fù)浞治龇椒?，故可利用CytoHubba對(duì)關(guān)鍵基因（hub基因）進(jìn)行分析。其中，MCC算法是一種準(zhǔn)確度較高的分析方法，被廣泛應(yīng)用于PPI網(wǎng)絡(luò)中對(duì)關(guān)鍵蛋白的預(yù)測(cè)[9]。采用MCC算法篩選出特征性基因網(wǎng)絡(luò)中得分前10位的基因，即為左金丸抗Hp感染的關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 左金丸生物活性成分

通過(guò)TCMSP檢索得到48個(gè)黃連相關(guān)成分和176個(gè)吳茱萸相關(guān)成分。黃連相關(guān)成分中，OB≥30%的有26個(gè)，DL≥0.18的有31個(gè)；吳茱萸相關(guān)成分中，OB≥30%的有106個(gè)，DL≥0.18的有47個(gè)。綜合篩選條件OB≥30%和DL≥0.18，獲得左金丸中具有較高活性的化學(xué)成分41個(gè)。

2.2 左金丸化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)TCMSP獲得左金丸化學(xué)成分的潛在作用靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)靶點(diǎn)并剔除無(wú)對(duì)應(yīng)人源基因名稱的靶點(diǎn)，共得到197個(gè)靶點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的32個(gè)化學(xué)成分。具體化學(xué)成分及來(lái)源見(jiàn)表1。得到的化學(xué)成分中有10個(gè)黃連相關(guān)成分和24個(gè)吳茱萸相關(guān)成分。其中MOL001454（黃連素）和MOL000098（槲皮素）為兩者共有的化學(xué)成分。

通過(guò)Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建的左金丸化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示，左金丸生物活性成分與作用靶點(diǎn)存在576個(gè)不同程度的相互關(guān)系。其中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目從高到低的前10個(gè)活性成分依次為：MOL000098（槲皮素）、MOL000358（β-谷甾醇）、MOL000354（異鼠李素）、MOL002903（R-四氫小檗堿）、MOL003972（1-methyl-2-nonyl-4-quinolone）、MOL004018（吳茱萸酰胺Ⅰ）、MOL003958（吳茱萸堿）、MOL002904（氧化小檗堿）、MOL000785（黃藤素）、MOL001454（黃連素）。靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分越多，提示該靶點(diǎn)的相對(duì)重要性較高。對(duì)應(yīng)化學(xué)成分?jǐn)?shù)目從高到低的前10個(gè)靶點(diǎn)依次為PTGS2、AR、PTGS1、SCN5A、PARP1、ADRB2、HSP90AB1、RXRA、NOS3、CHRM1，表明這些具有較高重要性。左金丸生物活性成分-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖1。

2.3 幽門(mén)螺桿菌相關(guān)致病基因靶點(diǎn)

通過(guò)TTD、GAD、OMIM、PharmGKB、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索到與Hp相關(guān)的已知靶點(diǎn)1、99、53、5、17個(gè)，共175個(gè)。刪除重復(fù)基因后，獲得142個(gè)Hp相關(guān)致病靶點(diǎn)。

2.4 左金丸抗幽門(mén)螺桿菌感染蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建和分析左金丸化學(xué)成分-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)和Hp相關(guān)疾病-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)這2個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)提取交集網(wǎng)絡(luò)，獲得左金丸抗Hp感染的特征性基因。在左金丸化學(xué)成分-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中，有直接或間接與生物活性成分產(chǎn)生作用的靶點(diǎn)1610個(gè)，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系23 391個(gè)。在Hp相關(guān)疾病-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中，有直接或間接與疾病相關(guān)的基因靶點(diǎn)663個(gè)，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系6978個(gè)。上述兩者的交集PPI網(wǎng)絡(luò)即為左金丸抗Hp感染的特征性基因網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含直接或間接作用的靶點(diǎn)共272個(gè)，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的關(guān)系1636個(gè)。

2.5 GO功能富集分析結(jié)果

利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)左金丸治療Hp感染的特征性基因進(jìn)行GO富集分析，獲得富集分析結(jié)果199條。其中，生物過(guò)程相關(guān)條目152個(gè)，主要涉及炎癥反應(yīng)、RNA信號(hào)轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖凋亡等方面；細(xì)胞學(xué)組分相關(guān)條目19個(gè)，主要涉及細(xì)胞核、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白復(fù)合物等方面；分子功能相關(guān)條目28個(gè)，主要涉及細(xì)胞因子活性、受體活性、酶活性、ATP結(jié)合、DNA結(jié)合等方面。GO富集分析結(jié)果中各分類-log10值居前10位的條目見(jiàn)圖2。

表1 左金丸活性化學(xué)成分及來(lái)源

TCMSP編碼化學(xué)成分OB/%DL來(lái)源對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù) MOL000098Quercetin（槲皮素）46.430.28黃連、吳茱萸143 MOL000358beta-sitosterol（β-谷甾醇）36.910.75吳茱萸 34 MOL000354Isorhamnetin（異鼠李素）49.600.31吳茱萸 32 MOL002903(R)-Canadine（R-四氫小檗堿）55.370.77黃連 30 MOL0039721-methyl-2-nonyl-4-quinolone48.420.20吳茱萸 22 MOL004018GoshuyuamideⅠ（吳茱萸酰胺Ⅰ）83.190.39吳茱萸 21 MOL003958Evodiamine（吳茱萸堿）86.020.64吳茱萸 20 MOL002904Berlambine（氧化小檗堿）36.680.82黃連 19 MOL000785Palmatine（黃藤素）64.600.65黃連 17 MOL001454berberine （黃連素）36.860.78黃連、吳茱萸 16 MOL004019GoshuyuamideⅡ（吳茱萸酰胺Ⅱ）69.110.43吳茱萸 16 MOL002662rutaecarpine （吳茱萸次堿）40.300.60吳茱萸 15 MOL003943Rutalinidine40.890.22吳茱萸 15 MOL0039641-methyl-2-undecyl-4-quinolone47.590.27吳茱萸 14 MOL004014Evodiamide（穆茱萸酰胺）73.770.28吳茱萸 14 MOL0039571-methyl-2-pentadecyl-4-quinolone44.520.46吳茱萸 13 MOL002894Berberrubine（小檗紅堿）35.740.73黃連 12 MOL003956Dihydrorutaecarpine（二氫吳茱萸次堿）42.270.60吳茱萸 12 MOL0039601-(5,7,8-trimethoxy-2,2-dimethylchromen-6-yl)ethanone30.390.18吳茱萸 12 MOL003963Hydroxyevodiamine（羥基吳茱萸堿）72.110.71吳茱萸 12 MOL003974Evocarpine（吳茱萸卡品堿）48.660.36吳茱萸 11 MOL004025N-(2-Methylaminobenzoyl)tryptamine56.960.26吳茱萸 11 MOL002897Epiberberine（表小檗堿）43.090.78黃連 10 MOL001458Coptisine（硫酸黃連堿）30.670.86黃連 9 MOL0039471-methyl-2-[(Z)-pentadec-10-enyl]-4-quinolone48.450.46吳茱萸 8 MOL004020Gossypetin（棉花素）35.000.31吳茱萸 8 MOL002668Worenine（甲基黃連堿）45.830.87黃連 6 MOL0039882-Hydroxy-3-formyl-7-methoxycarbazole83.080.18吳茱萸 6 MOL004021Gravacridoneshlirine63.730.54吳茱萸 6 MOL0040046-OH-Luteolin46.930.28吳茱萸 5 MOL000622Magnograndiolide（廣玉蘭內(nèi)酯）63.710.19黃連 4 MOL000359Sitosterol（β-谷甾醇）36.910.75吳茱萸 3

注：淺紫色為黃連相關(guān)成分，深紫色為吳茱萸相關(guān)成分，藍(lán)色為對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

圖2 左金丸抗Hp感染特征性基因GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果

利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得65條富集結(jié)果。根據(jù)值判斷可靠性，篩選前30條信號(hào)通路。①與細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)的通路有12條：Jak-STAT信號(hào)通路（Jak-STAT signaling pathway）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、細(xì)胞周期（Cell cycle）、Wnt信號(hào)通路（Wnt signaling pathway）、FoxO信號(hào)通路（FoxO signaling pathway）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路（Neurotrophin signaling pathway）、p53信號(hào)通路（p53 signaling pathway）、Hippo信號(hào)通路（Hippo signaling pathway）、黏著斑（Focal adhesion）、細(xì)胞黏附分子（Cell adhesion molecules）、黏附連結(jié)（Adherens junction）；②與炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路有8條：T細(xì)胞受體信號(hào)通路（T cell receptor signaling pathway）、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、NOD樣受體信號(hào)通路（NOD-like receptor signaling pathway）、炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease）、同種異體移植物排斥反應(yīng)通路（Allograft rejection）、HTLV-I感染（HTLV-I infection）、腸道免疫網(wǎng)絡(luò)IgA生產(chǎn)（Intestinal immune network for IgA production）、原發(fā)性免疫缺陷（Primary immunodeficiency）；③與癌癥相關(guān)的通路有7條：癌癥的中心碳代謝（Central carbon metabolism in cancer）、結(jié)腸直腸癌（Colorectal cancer）、癌癥中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、癌癥通路（Pathways in cancer）、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)（Transcriptional misregulation in cancer）、基底細(xì)胞癌（Basal cell carcinoma）、癌癥中的微小RNA（MicroRNAs in cancer）；④與其他疾病相關(guān)的通路有3條：阿米巴病（Amoebiasis）、沙門(mén)氏菌感染（Salmonella infection）、弓形蟲(chóng)?。═oxoplasmosis）。左金丸的生物活性成分可能作用于以上信號(hào)通路，達(dá)到抗Hp感染的效應(yīng)，見(jiàn)圖3。圖中氣泡面積大小表示目標(biāo)基因集中屬于這條pathway的基因數(shù)量，氣泡顏色代表富集顯著性，即值的大小。

2.7 左金丸抗幽門(mén)螺桿菌感染關(guān)鍵基因

采用Cytohubba對(duì)左金丸抗Hp感染的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到排名前10位的關(guān)鍵基因，分別為CXCL8、IL10、IL4、VEGFA、MMP9、MMP2、TIMP1、IL2、TP53、MYC，見(jiàn)圖4。在hub基因中，CXCL8、IL10、IL4、IL2為與炎癥相關(guān)的基因，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起著重要作用；MMP9、MMP2參與了血管形成、免疫炎癥、細(xì)胞增殖和凋亡等生理病理過(guò)程；TIMP1是可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性的多基因家族成員之一，對(duì)調(diào)控MMPs的活性具有重要作用[10]；VEGFA為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，與血管新生相關(guān)；TP53通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)DNA損傷修復(fù)等過(guò)程抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]；MYC為重要的原癌基因，參與調(diào)控腫瘤的增殖、凋亡和遷移[12]。利用CytoHubba對(duì)hub基因進(jìn)行分析，得到相關(guān)拓?fù)鋮?shù)，見(jiàn)表2。度值（Degree）為網(wǎng)絡(luò)中某個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)目，節(jié)點(diǎn)連接數(shù)目越多，度值越大，影響力就越大。hub基因平均度值為62，其中靶點(diǎn)TP53的度值最大，提示hub基因在左金丸抗Hp感染的PPI網(wǎng)絡(luò)中具有較為關(guān)鍵的作用。

圖3 左金丸抗Hp感染特征性基因KEGG通路富集分析

注：顏色深淺表示排名先后

表2 左金丸抗Hp感染的hub基因相關(guān)拓?fù)鋮?shù)

序號(hào)基因名稱度值介數(shù)最短路徑 1CXCL8 62 3 224.95159.87 2IL10 67 3 100.04161.04 3IL4 62 2 461.89157.54 4VEGFA 64 2 905.24161.21 5MMP9 54 997.35154.87 6MMP2 39 791.83146.87 7TIMP1 32 3 535.78140.20 8IL2 6420 426.20157.79 9TP53109 5 816.60186.42 10MYC 72 4 698.82165.87

3 討論

目前普遍認(rèn)為，Hp致病過(guò)程主要通過(guò)細(xì)菌毒力因子、宿主和環(huán)境因素之間復(fù)雜的相互作用調(diào)節(jié)[13-14]。其感染致病的前提條件是胃內(nèi)定植。定植因子包括有毒性作用的酶、鞭毛動(dòng)力、多種毒素及黏附素。如Hp脲酶水解尿素生成的氨可緩解胃內(nèi)酸性環(huán)境，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促使胃黏膜損傷及潰瘍形成。Hp的黏附素還可與宿主細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)特異性結(jié)合，助其在胃內(nèi)的黏附與定植。Hp重要的毒素因子VacA、CagA及其他致病因子在定植后與宿主相互作用，造成胃腸黏膜局部的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致局部組織損傷，使其更容易受胃酸及胃蛋白酶的侵襲，從而引起胃腸疾病的發(fā)生。Hp相關(guān)性胃腸疾病以根除Hp、抑制胃酸和保護(hù)胃黏膜為主要治療原則。但隨著抗生素濫用，Hp的耐藥性日益增加，導(dǎo)致Hp根除率逐漸下降。中醫(yī)藥治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同調(diào)節(jié)效應(yīng)，其抗菌效果顯著、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)使其在治療Hp感染方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，Hp感染引起的胃腸道疾病的病因?yàn)樾岸緝?nèi)犯，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，升降失調(diào)[15]。邪毒主要指Hp，本虛主要指脾胃虛弱，標(biāo)實(shí)主要指由邪毒所致的濕熱、寒濕、氣滯、血瘀、瘀熱等。升降失調(diào)常導(dǎo)致胃脘脹痛、惡心嘔吐、噯氣泛酸等癥狀。肝氣具有疏通暢達(dá)全身氣機(jī)的作用，有助于胃氣通降。故肝火犯胃有2種情況：一是肝的疏泄不及，肝氣郁久而化火，木不疏土，胃氣壅滯，則胃受納傳導(dǎo)失常；二是肝的疏泄太過(guò)，陽(yáng)氣亢盛而化火，木旺乘土，胃失和降，胃氣上逆，則臟腑功能失調(diào)而發(fā)病[16]。肝火犯胃證臨床可見(jiàn)胃脘痛、反酸嘈雜、口苦、脅痛、口干、舌紅等癥狀。現(xiàn)代研究表明，左金丸具有抑殺Hp、調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力、抑制胃酸分泌、抗?jié)兒玩?zhèn)痛抗炎等作用。因此，左金丸可用于治療肝火犯胃型Hp相關(guān)性消化性潰瘍。

為進(jìn)一步探究左金丸治療Hp感染的綜合作用機(jī)制，本研究通過(guò)TCMSP篩選獲得左金丸化學(xué)成分32個(gè)，并在此基礎(chǔ)上挖掘出197個(gè)靶點(diǎn)和576個(gè)關(guān)系。槲皮素、異鼠李素、R-四氫小檗堿、黃藤素、黃連素為活性較高的成分，且能同時(shí)作用多個(gè)靶點(diǎn)。槲皮素是左金丸中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)最多的成分，是一種具有較強(qiáng)抗炎能力的長(zhǎng)效抗炎物質(zhì)，可穩(wěn)定肥大細(xì)胞及保護(hù)胃腸道細(xì)胞的活性，對(duì)炎癥和免疫反應(yīng)具有雙向調(diào)節(jié)作用。槲皮素對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞還具有免疫抑制作用[17]。異鼠李素具有抗炎、抗凋亡及抗氧化作用。黃藤素與抑制炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，可抑制疾病部位的炎癥因子表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。黃連素又稱小檗堿，是黃連主要化學(xué)成分之一，可通過(guò)抑制炎癥因子的生成和活性發(fā)揮抗炎作用；也可通過(guò)減少活性氧的生成、清除氧自由基等途徑達(dá)到抗氧化作用，進(jìn)而發(fā)揮治療Hp相關(guān)性消化性潰瘍的作用[18]。此外，黃連素在體內(nèi)外均有抑殺Hp作用，其機(jī)制可能是抑制Hp的轉(zhuǎn)移酶活性，并破壞Hp的定植因子和毒力因子[19]。化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，靶點(diǎn)PTGS2、AR、PTGS1、SCN5A、PARP1等對(duì)應(yīng)多個(gè)化學(xué)成分，提示左金丸的生物活性成分之間不僅存在緊密的協(xié)同關(guān)系，而且其作用靶點(diǎn)也在整個(gè)疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

采用Cytohubba分析左金丸治療Hp感染的PPI網(wǎng)絡(luò)，排名前10的關(guān)鍵基因分別為CXCL8、IL10、IL4、VEGFA、MMP9、MMP2、TIMP1、IL2、TP53、MYC。據(jù)此推測(cè)，左金丸通過(guò)多種成分與這些關(guān)鍵靶點(diǎn)直接或間接相互作用，達(dá)到治療Hp感染的效果。如Hp感染造成胃腸黏膜局部產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷，進(jìn)而形成潰瘍。其中，IL2等促炎因子增多可加重炎癥的發(fā)展，而IL10、IL4等抗炎因子增多則發(fā)揮炎癥消除作用[6，20]。左金丸可通過(guò)抑制促炎因子和促進(jìn)抗炎因子釋放而減輕炎癥反應(yīng)。MMP9、MMP2屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，有研究表明，左金丸活性成分鹽酸小檗堿抑制人胃癌SNU-5細(xì)胞遷移的機(jī)制與下調(diào)MMP1、MMP2、MMP9表達(dá)有關(guān)[21]。

從KEGG通路富集分析結(jié)果可知，左金丸主要通過(guò)影響細(xì)胞增殖分化和凋亡、炎癥反應(yīng)、癌癥等相關(guān)通路而發(fā)揮抗Hp感染作用。與細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)的通路主要有Jak-STAT信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。研究表明，Jak-STAT信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)等生物過(guò)程。IL4、IL2、IL10等多種細(xì)胞因子刺激信號(hào)可誘導(dǎo)激活Jak-STAT信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)特定基因的表達(dá)，引發(fā)相關(guān)細(xì)胞反應(yīng)，該過(guò)程與炎癥性腸病等多種消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22]。與炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路主要包括T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路等。Hp的致病機(jī)制具有炎癥特性，調(diào)控病變周?chē)难装Y環(huán)境對(duì)于疾病轉(zhuǎn)歸有重要意義。T細(xì)胞受體信號(hào)通路是將T細(xì)胞表面與TCR結(jié)合的抗原信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)的重要途徑，可直接調(diào)節(jié)機(jī)體免疫而發(fā)揮直接殺傷靶細(xì)胞、參加免疫應(yīng)答及產(chǎn)生細(xì)胞因子等多種生物學(xué)功能。與癌癥通路相關(guān)的分子機(jī)制主要涉及癌癥中的蛋白多糖、癌癥通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等。該結(jié)果可為左金丸及其單體防治胃癌的研究提供研究思路。與其他疾病相關(guān)的研究結(jié)果還包括阿米巴病、沙門(mén)氏菌感染等，說(shuō)明疾病之間調(diào)控機(jī)制相互聯(lián)系、相互交叉、相互影響。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法，基于化學(xué)成分-基因靶點(diǎn)-信號(hào)通路的研究模式，初步探索了左金丸治療Hp感染的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。由于數(shù)據(jù)檢索具有主觀性，未考慮黃連與吳茱萸的配比、藥物劑量選擇、給藥途徑及藥物在體內(nèi)的代謝狀況等因素，本課題組后續(xù)將開(kāi)展相應(yīng)的左金丸抗Hp感染的藥效及分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果。

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Study on Molecular Network Regulation Mechanism ofPills Against Helicobacter Pylori Infection

CHEN Xinyi1,2, ZENG Meiyan2, SONG Houpan1,2, CHEN Xiaojuan1,2, LIN Ye1,2, CAI Xiong1, YU Rong2, PENG Qinghua1

To study the molecular network regulation mechanism ofPills against Helicobacter pylori (Hp) infection based on network pharmacology and bioinformatics.By searching all the components ofPills in TCMSP, the possible active components and targets were screened and predicted. The targets related to Hp infection were selected in 5 major disease databases, and then the interaction network between component targets and disease targets was constructed to obtain the characteristic gene ofPills against Hp infection. GO functional enrichment and KEGG pathway enrichment analysis were performed on the above characteristic genes through DAVID6.8 database. Cytohubba was used to screen the key anti-Hp targets ofPills.Totally 32 active components and 197 action targets ofPills were screened and predicted by TCMSP. A total of 199 enrichment results were obtained by GO analysis, including 152 biological process of inflammatory response, RNA signal transcription and signal transduction, 19 cellular components of nucleus, extracellular matrix and protein complexes, and 28 molecular function of cytokine activity, DNA binding and ATP binding. KEGG analysis showed that 65 signaling pathways, such as Jak-STAT signaling pathway, T cell receptor signaling pathway, cell cycle signaling pathway and Wnt signaling pathway, were closely related to anti-Hp infection ofPills. 10 key genes such as CXCL8, IL10, IL4, VEGFA and MMP9 were screened by Cytohubba.Pills have the characteristics of multi-components, multi-targets, and integral regulation for the treatment of Hp infection, which can provide basis for the study of active components and efficacy and mechanism of anti-Hp infection.

Pills; Helicobacter pylori; network pharmacology; molecular mechanism; signaling pathway

R259.733；R285

A

1005-5304(2020)05-0090-07

10.3969/j.issn.1005-5304.201905115

國(guó)家自然科學(xué)基金（81703920）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（2019M662790）；湖南省自然科學(xué)基金（2019JJ50442）；湖南省中醫(yī)藥管理局科研一般項(xiàng)目（201780）；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃（2017280、201908）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研基金（2018XJJJ28）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)青年教師科研基金（201610）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)一流學(xué)科開(kāi)放基金（2018ZYX20）

宋厚盼，E-mail：hpsong2015@126.com

（2019-05-08）

（2019-06-18；編輯：陳靜）