李蔭展， 李軍生， 王靖婷， 李風(fēng)光， 閻柳娟， 黃國(guó)霞

（1．廣西科技大學(xué)廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州 545006；2．廣西高通食品科技有限責(zé)任公司，廣西柳州 545100）

大豆蛋白作為一種大宗的植物蛋白，具有潛在的乳化性和起泡性等表面活性性能。經(jīng)過分離提純之后的大豆分離蛋白經(jīng)常被用在食品工業(yè)中。大豆分離蛋白是球蛋白，疏水性基團(tuán)包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，從而限制了大豆分離蛋白質(zhì)的表面活性性能。因此采用綠色的化學(xué)方式對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行改性處理，提高其表面活性性能，從而擴(kuò)大其使用范圍是目前的研究焦點(diǎn)。

大豆11S蛋白組分是大豆分離蛋白質(zhì)中比例最高的成分，比例高達(dá)41%，其構(gòu)成組分基本是單一的11S球蛋白（Zhao等，2011）。研究表明，大豆球蛋白主要是由12個(gè)亞基按照A-SS-B基本模式構(gòu)成的兩個(gè)環(huán)狀六角形 （-SS-指二硫鍵）（Zhang等，2015）。12個(gè)亞基分別為6條N末端酸性 ɑ（約 30 kD）亞基（A1、A2、A3、A4、A5、A6）和6條堿性C末端 β （約 20 kD） 亞基（B1、B2、B3、B4、B5、B6），這些亞基之間通過氫鍵 、二硫鍵等分子間作用力構(gòu)成了不同種類的亞基對(duì)。大豆11S蛋白組分中半胱氨酸含量為1%左右 （立等，2010），分子內(nèi)含較多的二硫鍵，二硫鍵的存在限制了其表面活性性能展示。李軍生等（2012）提出通過控制性打開二硫鍵方式對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行改性，可改善其乳化性、起泡性等表面活性性能。董振等（2016）通過過氧乙酸對(duì)大豆11S蛋白進(jìn)行氧化改性，研究結(jié)果表明氧化處理后大豆11S蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性明顯提升。Wu等（2009）通過過氧化氫適度氧化大豆分離蛋白，研究結(jié)果表明氧化處理能夠提高大豆分離蛋白的乳化性以及凝膠性等性能。

故本研究采用不同濃度的過氧化氫氧化處理大豆11S蛋白，揭示氧化體系對(duì)大豆11S蛋白性能和結(jié)構(gòu)的影響，研究氧化斷開二硫鍵對(duì)大豆11S蛋白結(jié)構(gòu)和性能影響的機(jī)理。為氧化制備高表面活性的大豆11S蛋白提供理論依據(jù)，為制備蛋白質(zhì)基表面活性劑提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 大豆11S蛋白組分（自制）；過氧化氫（H2O2），AR，西隴化工股份有限公司；大豆油，嘉里糧油有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），CP，汕頭市光華化學(xué)廠；還原型谷胱甘肽，BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-巰基乙醇，99%，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；5,5"-二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB），98%，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 大豆11S蛋白的制備 采用Samoto等（2007）的方法稍作修改，脫脂大豆豆粕與水質(zhì)量體積比1:10混合。用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至8.0，室溫?cái)嚢?2 h，4 ℃、5000 g離心 10 min；上清液用 2 mol/L HCl溶液調(diào) pH 至 5.8，4℃、5000 g離心10 min，沉淀加水溶解冷凍干燥即為大豆11S蛋白。

1.3 氧化大豆11S蛋白的制備 采用梯度稀釋的方式配制 4 組濃度分別為 0、10、100、1000 mmol/L 過氧化氫溶液 180 mL，編號(hào) 1、2、3、4。取冷凍干燥后的大豆11S蛋白7.2 g溶解于上述溶液中，使蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度約為40 g/L，用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH至2.0。將溶解后的樣品置于4℃冰箱中，反應(yīng)3 h，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至8.0，冷凍干燥備用待測(cè)。

1.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳 參考Hu等（2013）的方法稍作修改，其中分離膠濃度13%，濃縮膠濃度5%。將每個(gè)樣品分為兩組，一組加入添加5%β-巰基乙醇的緩沖液，一組加入未添加β-巰基乙醇的緩沖液，每個(gè)樣品池上樣量15μL，進(jìn)行電泳分析。電泳條件：先采用90 V電泳30 min，后采用120 V電泳處理2.5 h。電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，然后脫色拍照。

1.5 二硫鍵含量測(cè)定 采用Ellman（1959）介紹的方法并稍作修改測(cè)定 （分光光度計(jì)法）。0.1%DTNB試劑：稱取 100 mg DTNB，溶于 100 mL、pH 8.0的磷酸緩沖液中。0.1%NTSB試劑：稱取100 mg DTNB，溶于10 mL 1 mol/L的 Na2SO3，再用 pH 8.0磷酸緩沖液定容至100 mL。2 mg/mL谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液：用pH 8.0的磷酸緩沖液溶解100 mg還原型谷胱甘肽，并定容至50 mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取上述配制的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液0~6 mL，用pH 8.0的磷酸緩沖液稀釋定容至50 mL，各取0.4 mL與0.4 mL DTNB試劑混合后利用蒸餾水定容至10 mL，采用Cary-60紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定待測(cè)溶液412 nm處的吸光度。濃度對(duì)吸光度值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如下：

y=0.0234x+0.0001（R2=0.9989）；

式中：x為所測(cè)樣品的吸光度；y為對(duì)應(yīng)還原型谷胱甘肽濃度；

1.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定 采用Luo等（2013）的方法，配制質(zhì)量濃度10 g/L的蛋白溶液，取20 mL蛋白液與大豆油體積比4:1混合，10000 r/min條件下高速剪切乳化1 min，取0 min和30 min乳化后的樣品溶液20μL與 5 mL 0.1%的SDS混合，采用Cary-60紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定待測(cè)溶液500 nm處的吸光度值。通過以下公式計(jì)算乳化性及乳化穩(wěn)定性。

式中：T=2.303；N：稀釋倍數(shù)，250；c：混合前蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL；φ：乳化液中的油相體積分?jǐn)?shù)，0.25；A0：0 min 時(shí)的吸光度值；A30：30 min 時(shí)的吸光度值。

1.7 起泡性和起泡穩(wěn)定性測(cè)定 配制質(zhì)量濃度10 g/L的蛋白溶液，取30 mL樣品溶液于250 mL燒杯中，利用高速剪切機(jī)在10000 r/min條件下均質(zhì)處理1 min。均質(zhì)結(jié)束后迅速將溶液及泡沫倒入100 mL量筒中，并記下此刻泡沫體積V0。室溫靜置30 min，并記錄30 min時(shí)的體積V30。分別利用以下公式計(jì)算起泡性和起泡穩(wěn)定性（Nishinari，2014）。

1.8 表面張力及臨界膠束濃度（CMC）測(cè)定 參照Bormashenko等（2013）的方法。配制10 g/L的氧化大豆蛋白溶液，分別取 1、3、5、7、9、11 mL 樣品溶液利用蒸餾水定容至50 mL（為保證每組樣品出現(xiàn)拐點(diǎn)，每組樣品測(cè)定時(shí)配制的濃度組數(shù)略有不同）。將蛋白質(zhì)溶液按照低濃度到高濃度順序，依次采用全自動(dòng)界面張力儀測(cè)定表面張力，每組樣品平行測(cè)定三次。采用表面張力對(duì)樣品濃度作對(duì)數(shù)圖，通過圖形拐點(diǎn)坐標(biāo)得出樣品的最低表面張力值和臨界膠束濃度CMC值（Sedev,2011）。

1.9 紅外光譜測(cè)定 參照Yan等（2014）的方法，取冷凍干燥后的氧化大豆11S蛋白10μg與0.1 mg硝酸鉀混合壓片，采用傅里葉紅外光譜儀測(cè)定各樣品的紅外光譜。

1.10 原子力顯微鏡掃描圖測(cè)定 參考Song等（2015）的方法，配制濃度為10μg/mL的氧化大豆蛋白溶液，取2μL樣品溶液置于新鮮剝離的云母片上，室溫干燥測(cè)定。測(cè)定條件：采用輕巧模式，頻率320 kHz；掃描速度1.0 Hz；硅尖長(zhǎng)度125μm，曲率半徑42 N/m；共振頻率290 KHz。

2 結(jié)果與討論

2.1 二硫鍵的含量變化 過氧化氫等氧化劑可以將蛋白質(zhì)中二硫鍵氧化成磺酸基團(tuán)從而不可逆轉(zhuǎn)的斷開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵。氧化劑的氧化強(qiáng)度過大時(shí)則會(huì)將蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的游離巰基以及二硫鍵全部生成磺酸基團(tuán) （Ye等，2013），并且會(huì)造成部分氫鍵等分子鍵的破壞，蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)完全破壞，導(dǎo)致無法測(cè)定二硫鍵變化的情況。從表1可以看出，隨著過氧化氫濃度的增加，二硫鍵的含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，當(dāng)過氧化氫濃度高于10 mmol/L時(shí)，過氧化氫直接將游離巰基以及斷開的二硫鍵完全氧化成磺酸基團(tuán)，從而阻止了二硫鍵與游離巰基之間的轉(zhuǎn)化，氧化劑濃度越高二硫鍵斷開的越多。表1中磺酸基團(tuán)的變化規(guī)律也說明了當(dāng)過氧化氫濃度高于10 mmol/L時(shí)，二硫鍵以及游離巰基會(huì)在氧化劑作用下氧化生成磺酸基團(tuán)。

隨著過氧化氫濃度的增加大豆11S蛋白中的二硫鍵打開率迅速增加，且當(dāng)過氧化氫濃度過高時(shí)，二硫鍵打開率接近100%。表1說明過氧化氫的氧化處理可以使得大豆11S蛋白分子中游離巰基以及二硫鍵發(fā)生不可逆氧化。同時(shí)過量的氧化會(huì)造成蛋白質(zhì)分子中二硫鍵、氫鍵等分子鍵最大程度的破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)無規(guī)律改變，從而出現(xiàn)無法采用該法測(cè)定二硫鍵的現(xiàn)象。

表1 氧化大豆11S蛋白游離巰基和二硫鍵的含量

2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳 由SDS-PAGE凝膠電泳圖可以看出，未添加β-巰基乙醇時(shí)條帶大部分出現(xiàn)在分子量66.2 kDa的位置，分子量偏大，而添加β-巰基乙醇時(shí)條帶出現(xiàn)下調(diào)，說明大豆11S的酸性亞基AS與堿性亞基BS通過二硫鍵相連構(gòu)成分量較大的亞基聚集體，當(dāng)經(jīng)過β-巰基乙醇還原后，二硫鍵斷開，酸性亞基和堿性亞基分開，電泳圖出現(xiàn)低分子量條帶。通過圖1a對(duì)比各條帶可以發(fā)現(xiàn)隨著氧化程度的增強(qiáng)，31.0~43.0 kDa以及20.1 kDa附近條帶顏色加深，小分子量亞基增加。說明隨著氧化程度的增加，二硫鍵打開的程度增大，大豆11S蛋白中的酸性亞基AS以及堿性亞基BS降解程度增大，形成更多的小分量亞基組分。

圖1b是添加β-巰基乙醇的電泳圖譜，β-巰基乙醇可以還原蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵，使得大豆11S蛋白質(zhì)分子中酸性亞基AS與堿性亞基BS分散，從而通過電泳完整展示蛋白質(zhì)的亞基構(gòu)成。通過對(duì)比圖1b的各條帶與Samoto等（2007）結(jié)果中的大豆11S組分電泳圖發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)所提純制取的大豆11S蛋白基本滿足試驗(yàn)需求。圖1b中2~4條帶在20.1~31.0 kDa出現(xiàn)許多淺色條帶，說明適度的氧化不僅斷開蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，也造成部分游離巰基與二硫鍵之間相互轉(zhuǎn)化形成新的亞基組合方式，當(dāng)添加β-巰基乙醇時(shí)各樣品中二硫鍵幾乎全部被還原，從而產(chǎn)生許多新的分子量較小的條帶。而氧化過度的圖1a、1b中的4條帶基本沒有差別，說明過度氧化使得二硫鍵不可逆轉(zhuǎn)的斷開。

2.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性 由圖2可知，過氧化氫的氧化可以改變大豆11S蛋白的乳化性能，且合適的氧化強(qiáng)度可以明顯提升大豆11S蛋白的乳化性能。天然的大豆11S蛋白本身具有一定的乳化性能，這也是對(duì)其進(jìn)行改性處理的基礎(chǔ)，所以未經(jīng)處理的1號(hào)樣品具有一定乳化性和乳化穩(wěn)定性。隨著氧化強(qiáng)度的增強(qiáng)，巰基被氧化成磺酸基團(tuán)，二硫鍵被不可逆轉(zhuǎn)的斷開，蛋白分子中各亞基之間的作用力減弱，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，較多的疏水性基團(tuán)暴露至分子表面，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)行均質(zhì)乳化時(shí)，暴露表面的疏水性殘基分散在油水表面，增加蛋白質(zhì)在此界面上的吸附量，蛋白質(zhì)分子中疏水殘基與油相結(jié)合定向排列在油/水界面形成較為致密的吸附膜，同時(shí)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變得松散，分子柔性增加，從而使蛋白質(zhì)的乳化性以及乳化穩(wěn)定性提高 （Ishii等，2016）。但當(dāng)氧化強(qiáng)度過大時(shí)不僅會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵等不可逆轉(zhuǎn)斷開，同時(shí)也會(huì)使得蛋白質(zhì)分子間的其他化學(xué)鍵斷開，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解成較小的亞基基團(tuán)，這些基團(tuán)在均質(zhì)乳化過程中，會(huì)因?yàn)槭杷嗷プ饔眯纬删奂w，導(dǎo)致疏水基團(tuán)的重新包埋，減少蛋白質(zhì)分子在油/水界面上的分布，分解成較小的殘基之后的蛋白質(zhì)分子柔性降低，從而導(dǎo)致大豆11S蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性降低。

2.4 起泡性及起泡穩(wěn)定性 由圖3可知，未經(jīng)氧化的大豆11S蛋白具有一定的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，但起泡性較弱。經(jīng)過過氧化氫氧化之后大豆11S蛋白的起泡性能有了不同程度的提升，當(dāng)過氧化氫濃度達(dá)到100 mmol/L時(shí)起泡性達(dá)到最高值，起泡性能提高了約150%，而隨著過氧化氫濃度繼續(xù)增加起泡性下降。起泡穩(wěn)定性的變化規(guī)律與起泡性略微不同，未經(jīng)氧化的大豆11S蛋白具有一定泡沫穩(wěn)定性，且高于低濃度氧化樣品的泡沫穩(wěn)定性，低于較高氧化強(qiáng)度的樣品的泡沫穩(wěn)定性。除此之外，過氧化氫濃度達(dá)到1000 mmol/L時(shí)泡沫穩(wěn)定性明顯增高。

隨著氧化程度的增強(qiáng)，蛋白質(zhì)中二硫鍵與游離巰基發(fā)生轉(zhuǎn)移，二硫鍵發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)斷開，在此過程中蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊、重組裝等變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子中疏水基團(tuán)之間的相互作用增強(qiáng)，從而提高起泡性（Vatanparast等，2017）。當(dāng)氧化程度增加，二硫鍵被大部分?jǐn)嚅_后蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)時(shí)親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)比例接近平衡，蛋白質(zhì)分子在溶液表面的定向排列更加有序，大豆11S蛋白的起泡性能明顯提高。氧化強(qiáng)度過強(qiáng)時(shí)蛋白質(zhì)分子降解為各種小分子量亞基組分，從而增大了蛋白質(zhì)在溶液中分子數(shù)目，較小的亞基也較易在水中定向排列，從而泡沫穩(wěn)定性增加，但由于亞基在水溶液狀態(tài)會(huì)受到疏水相互作用從而使得部分疏水基團(tuán)包埋，所以過度氧化，起泡性下降。從圖2整體來看氧化能明顯提高大豆11S蛋白的起泡性但對(duì)大豆11S蛋白的泡沫穩(wěn)定性影響不大。

2.5 表面張力（γCMC）及 CMC值 表面活性劑水溶液的表面張力會(huì)隨著濃度的升高而下降，且會(huì)在較低濃度范圍內(nèi)急劇下降，隨著濃度的不斷增加，表面活性劑在水溶液中會(huì)逐漸形成穩(wěn)定的膠束或膠團(tuán)，一定膠束形成后的溶液其表面張力基本保持穩(wěn)定，不會(huì)隨濃度的增加而改變。表面活性劑溶液膠束大量形成對(duì)應(yīng)的濃度即為溶液的臨界膠束濃度（CMC）（Wang等，2013）。因此可以采用表面張力對(duì)濃度作對(duì)數(shù)圖，圖形上出現(xiàn)的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的濃度即為表面活性劑的CMC值（Kuperkar，2016）。

從圖4可以看出，各組樣品的表面張力-濃度對(duì)數(shù)圖均出現(xiàn)類似拐點(diǎn)，但拐點(diǎn)出現(xiàn)的趨勢(shì)以及所對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)不同。隨著氧化程度的增加拐點(diǎn)趨勢(shì)逐漸明顯，但氧化程度過高時(shí)拐點(diǎn)趨勢(shì)略微平緩，所以氧化處理后的大豆11S蛋白都具有一定的表面活性劑特征，而未經(jīng)氧化的大豆11S蛋白特征不明顯。根據(jù)圖4可得各組樣品的γCMC和CMC值（表2）。由表2可知，經(jīng)過氧化處理之后大豆11S蛋白的γCMC均降低，且拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度（CMC）也隨氧化程度的增加而減小，說明氧化改性可以降低大豆11S蛋白的界面張力，提升其在溶液空氣界面形成膠束的能力，從而提高其表面活性性能。這一結(jié)果主要因?yàn)檠趸男蕴幚頃r(shí)氧化斷開了蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵等分子鍵，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)被打開，結(jié)構(gòu)變的松散，柔性增強(qiáng)，分子中親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)從新分布排列，從而使蛋白質(zhì)展示更明顯的表面活性劑特征。當(dāng)然合適的氧化更有利于提升大豆11S蛋白的表面活性性能，過度氧化會(huì)使蛋白質(zhì)分子亞基在水溶液中會(huì)受到疏水相互作用而再次折疊，從而使得表面活性性能降低。

表2 各組樣品的γCMC和CMC值

2.6 紅外光譜測(cè)定 由圖5可知，高波段樣品在3266 cm-1的吸收峰經(jīng)過氧化向低波段移動(dòng)，該波段主要涉及蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵，通過峰位的藍(lán)移和峰強(qiáng)的變化可以看出經(jīng)過氧化之后蛋白質(zhì)分子中的氫鍵增加，其有利于蛋白質(zhì)重新折疊，從而增強(qiáng)內(nèi)部疏水基團(tuán)與外界物質(zhì)的相互作用，提高蛋白質(zhì)的表面活性（Guo等，2015）。樣品在1664 cm-1的吸收峰經(jīng)過氧化之后藍(lán)移至1646 cm-1，該波段藍(lán)移對(duì)應(yīng)的是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋向無規(guī)卷曲的轉(zhuǎn)變（Tang等，2009）。說明經(jīng)過氧化之后由于二硫鍵等分子間的斷裂，以及新的氫鍵形成導(dǎo)致蛋白質(zhì)的高級(jí)有序結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的無序結(jié)構(gòu)增加，分子的柔性增加，從而提高了蛋白質(zhì)的表面活性性能。樣品1540 cm-1處的吸收峰歸屬于酰胺Ⅱ帶氧化之后藍(lán)移至1537 cm-1，結(jié)合圖中的峰型可以看出，蛋白質(zhì)內(nèi)的氫鍵增多，重新折疊內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面，氫鍵重新穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。1238 cm-1處的吸收峰歸屬于β-折疊經(jīng)過氧化之后藍(lán)移至1230 cm-1處，結(jié)合圖中各組樣品的峰強(qiáng)可以看出經(jīng)過氧化之后β-折疊增加。β-折疊這種片層結(jié)構(gòu)需要?dú)滏I等作用力將兩條以上的肽鏈連接起來，在形成這種結(jié)構(gòu)的過程中氫鍵的含量會(huì)增加，并且蛋白質(zhì)分子中的垂直結(jié)構(gòu)會(huì)增加，從而減少維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)所需要的能量，其次片層狀的平行或反平行結(jié)構(gòu)可以減少側(cè)鏈基團(tuán)的阻礙作用，使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)伸展?fàn)顟B(tài)，從而增加蛋白質(zhì)的表面活性性能。1068 cm-1和620 cm-1處的吸收峰位是磺酸基團(tuán)的歸屬峰，通過圖中各組樣品的峰型可以看出經(jīng)過氧化處理之后磺酸基團(tuán)增加。

綜上所述，大豆11S蛋白經(jīng)過氧化之后無規(guī)卷曲和β-折疊片層增多，蛋白質(zhì)在氫鍵作用下重新折疊形成結(jié)構(gòu)伸展柔性更強(qiáng)的蛋白質(zhì)分子，從而增加了表面活性性能。除此之外磺酸基團(tuán)的增加也證實(shí)了經(jīng)過氧化之后大豆11S蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵發(fā)生了不可逆斷開，這一結(jié)果表明蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水性基團(tuán)不可逆轉(zhuǎn)地暴露至分子表面，大豆11S蛋白的表面活性性能提升。

2.7 原子力顯微鏡掃描結(jié)果 采用原子力顯微鏡（AFM）對(duì)各樣品的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，可以直觀地看出經(jīng)過氧化處理之后各組樣品的形貌變化。從而推斷氧化作用對(duì)大豆11S蛋白形貌的影響，進(jìn)而推斷對(duì)其結(jié)構(gòu)和表面活性的影響。

大豆11S蛋白經(jīng)過不同濃度的過氧化氫處理后的原子力顯微鏡掃描結(jié)果顯示，掃描范圍分別為10.00μm×10.00μm，未經(jīng)處理的大豆11S蛋白質(zhì)顆粒大小不均一，顆粒較大，約為1000~2000 nm；過氧化氫濃度為10 mmol/L時(shí)，蛋白質(zhì)分子間作用力破壞，分子解聚，大顆粒蛋白減少，均勻度增加，約為500~800 nm；過氧化氫濃度為100 mmol/L時(shí)與未處理樣品對(duì)比發(fā)現(xiàn)，顆粒均一性增強(qiáng)，適度氧化使蛋白質(zhì)分子高級(jí)結(jié)構(gòu)改變，而亞基結(jié)構(gòu)未發(fā)生較大改變，從而使得蛋白質(zhì)顆粒變小，均一度增加，顆粒約為50~100 nm；過氧化氫濃度為1000 mmol/L時(shí)出現(xiàn)較大顆粒蛋白，且顆粒不均勻度增加，說明過度的氧化完全破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子降解為小分量的亞基組分，顆粒約為800~1500 nm，在脫水自然干燥時(shí)，不均一的小顆粒重新發(fā)生聚集形成較大的聚集顆粒（Mcclements，2007）。由此可知經(jīng)適當(dāng)氧化斷開部分二硫鍵可使蛋白質(zhì)分子適度解聚，形成均一度較好的小顆粒蛋白，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)的表面活性性能。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的過氧化氫會(huì)誘導(dǎo)游離巰基與二硫鍵的轉(zhuǎn)化從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的重新折疊形成集聚體，再次包埋暴露的疏水性殘基；隨著氧化程度的增加，二硫鍵被不可逆轉(zhuǎn)地?cái)嚅_生成磺酸基團(tuán)，從而使得蛋白質(zhì)分子不可逆轉(zhuǎn)的解聚，疏水性殘基暴露，蛋白質(zhì)表面活性性能增加；而過量氧化會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子分解成小分量亞基，這些亞基由于疏水相互作用發(fā)生聚集形成不溶性大顆粒蛋白，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的表面活性性能降低。

通過測(cè)定各組樣品的表面活性性能如乳化性能、起泡性能的結(jié)果可以得出，經(jīng)過濃度100 mmol/L的過氧化氫處理的大豆11S蛋白表面活性最好，HLB值、γCMC和CMC值也表明該濃度過氧化氫氧化處理之后的大豆11S蛋白具有更好的表面活性劑的類似性能。原子力掃描電鏡圖表明經(jīng)過氧化大豆11S蛋白質(zhì)發(fā)生了解聚，分子顆粒變小，顆粒均勻度增加，同時(shí)可溶性蛋白顆粒的含量增加。通過以上分析可以得出，濃度100 mmol/L的過氧化氫能夠較好的改善大豆11S蛋白的表面活性性能。