盛 楠，魯冠杰，付 岳，田學(xué)琳，胡 格

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)根據(jù)其毒力分為A、B、C三型，屬于正黏病毒家族中的包膜病毒[1]?？赏ㄟ^抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)移引起疾病和大流行。不同的血紅凝集素(Hemagglutinin，HA)及神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)組成不同的亞型，如H5N1、H7N9、H3N2、H9N2等[2]。其中H9N2型禽流感病毒(H9N2 Avian influenza virus，H9N2-AIV)流行最為廣泛，也威脅人類健康。

禽流感病毒侵入機(jī)體后，在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制繁殖對(duì)宿主的正常生理代謝功能造成損害，嚴(yán)重則引起細(xì)胞死亡，病毒感染期間Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)信號(hào)通路觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)核因子-κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化，并上調(diào)許多產(chǎn)生炎性介質(zhì)的基因。在長(zhǎng)期的互相影響過程中，機(jī)體逐步形成一段復(fù)雜的抗病毒網(wǎng)絡(luò)。感染治療期間，神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)易產(chǎn)生相關(guān)副作用，限制許多藥物的使用，造成抗病毒的藥物相對(duì)較少。天然草藥具有低毒性、作用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，體現(xiàn)出對(duì)呼吸道病毒有很好的抑制作用。連翹酯苷A(forsythoside A，F(xiàn)SA)是從連翹的風(fēng)干果中分離得到的苯乙醇糖苷產(chǎn)品，為連翹的主要有效成分之一，具有體外抗菌，抗氧化和抗炎等活性[3]，且對(duì)神經(jīng)具有一定保護(hù)作用[4]，已被用于多種病毒性疾病的治療并取得一定療效，但限制病毒復(fù)制及其他具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步證實(shí)。

本研究采用H9N2型禽流感病毒建立小鼠急性肺損傷模型，連翹酯苷A分組治療，通過對(duì)其肺系數(shù)、體質(zhì)量、組織病理變化、炎性因子水平及TLR4相關(guān)蛋白等指標(biāo)，探討連翹酯苷A對(duì)H9N2型禽流感病毒感染小鼠的影響，為連翹酯苷A抗病毒作用機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

H9N2型禽流感病毒通過雞胚繁殖獲取感染性尿囊液，測(cè)定血凝效價(jià)后-80 ℃冰箱保存；42～56日齡SPF級(jí)Balb/c小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自北京興隆動(dòng)物養(yǎng)殖廠；小鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自mlbio酶聯(lián)生物公司；石蠟切片機(jī)(LEICA公司)；生物組織包埋機(jī)(LEICA公司)；免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)所用MyD88抗體、NF-κB p65抗體、P-NF-κB p65抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology生物公司；熒光素標(biāo)記山羊抗兔二抗、熒光素標(biāo)記山羊抗小鼠二抗均購(gòu)自碧云天生物公司。

1.2 方 法

1.2.1 病毒的制備 按照國(guó)家sop操作規(guī)程步驟，進(jìn)行病毒的制備。從-80 ℃冰箱取出病毒，將病毒按100 μL/只注入雞胚尿囊腔。37 ℃溫箱培養(yǎng)雞胚2～3 d。收獲雞胚前1 d置于4 ℃冰箱過夜。無菌移液槍吸取尿囊液置于收集管中，收獲的雞胚尿囊液3 000 r/min離心15 min去除血液和細(xì)胞后，根據(jù)Reed-Muench方法對(duì)病毒滴度進(jìn)行計(jì)算，測(cè)定血凝效價(jià)為10-9，分裝凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 小鼠半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定 35只Balb/c小鼠，隨機(jī)分成7組，用滅菌生理鹽水將病毒液10倍稀釋得到100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的6個(gè)梯度，每個(gè)稀釋度分別滴鼻接種一組小鼠(100 μL/只)。對(duì)照組滴鼻接種100 μL 的滅菌生理鹽水。接種后各組小鼠隔離飼養(yǎng)，防止交叉感染連續(xù)觀察14 d，記錄各組小鼠的發(fā)病死亡情況，按照Reed-Muench法計(jì)算LD50。

1.2.3 動(dòng)物模型的建立 60只Balb/c小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組及模型組，每組小鼠30只逐一記錄初始體質(zhì)量。對(duì)照組每只小鼠鼻腔接種100 μL無病毒感染的正常雞胚尿囊液，模型組接種100 μL測(cè)定后的病毒雞胚尿囊液，從兩組小鼠各隨機(jī)取出15只單獨(dú)飼養(yǎng)，每天稱量體質(zhì)量觀察采食量變化及臨床表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)死亡率繪制生存曲線，其余小鼠在3、5、7 d分別取3只小鼠稱量體質(zhì)量后處死，取肺部組織觀察并進(jìn)行肺水腫評(píng)估檢測(cè)。各組小鼠均保持自由飲食及飲水，分離飼養(yǎng)防止交叉感染，連續(xù)觀察14 d稱量體質(zhì)量后全部處死取肺組織檢測(cè)備用。

1.2.4 試驗(yàn)動(dòng)物的處理及分組 將120只小鼠隨機(jī)分成5組，分別為對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。對(duì)照組小鼠滴鼻接種無病毒感染的正常雞胚尿囊液(100 μL/只)；稀釋病毒尿囊到LD50濃度，滴鼻接種其余各組小鼠(100 μL/只)；低劑量組、中劑量組、高劑量組給予連翹酯苷A，劑量分別20、40、80 mg/kg，連續(xù)7 d。自由飲食及飲水，分離飼養(yǎng)防止交叉感染，每天檢測(cè)體質(zhì)量變化。

1.2.5 小鼠的肺水腫評(píng)估 小鼠感染后在3、5、7、14 d每組分別取3只小鼠稱量體質(zhì)量后處死，用剪刀鑷子小心剖開胸腔，取出肺臟，在無菌生理鹽水中漂洗去血液后用濾紙吸干水分，稱量肺質(zhì)量及右側(cè)肺葉質(zhì)量，將右肺置于37 ℃恒溫干燥箱中干燥，直到質(zhì)量不再變化，記錄數(shù)值。按肺濕質(zhì)量(mg)/肺干質(zhì)量(mg)計(jì)算肺濕干質(zhì)量比，按肺濕質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)計(jì)算肺系數(shù)，衡量肺水腫程度。

1.2.6 肺臟組織切片的制作及觀察 小鼠感染后在3、5、7、14 d每組分別取3只小鼠稱量體質(zhì)量后處死，取左側(cè)一半肺葉于組織包埋盒置于4%多聚甲醛中固定，另一半肺組織經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱備用。固定后的組織按照脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片、染色制作病理切片顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7 細(xì)胞因子檢測(cè) 小鼠感染后在3、5、7、14 d每組分別取3只小鼠稱量體質(zhì)量后取血，離心取血清，按照小鼠IL-6試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞因子。

1.2.8 組織總蛋白提取及蛋白定量 取出凍存的第5天肺組織剪碎成細(xì)小碎片，加入裂解液，玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。離心取上清按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(BCA Protein Assay Kit，BCA)進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。調(diào)整樣品濃度，加上樣緩沖液水浴加熱使蛋白變性。-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.9 TLR4信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 提取蛋白進(jìn)行電泳，按照配膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色步驟進(jìn)行，最后進(jìn)行Western blot結(jié)果掃描。利用軟件image J進(jìn)行灰度分析，將得出的數(shù)值進(jìn)行計(jì)算并用GraphPad 5分析作圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)分析比較各組數(shù)據(jù)，用#、*表示P<0.05，即差異顯著；用 ##、**表示P<0.01，即差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定

對(duì)照組小鼠無明顯病理變化，沒有死亡；經(jīng)14 d觀察統(tǒng)計(jì)病毒感染后小鼠，隨著病毒濃度降低死亡率下降。10-1時(shí)小鼠死亡率高于50%，10-2時(shí)死亡率低于50%，半數(shù)致死量應(yīng)在10-1～10-2之間(表1)，根據(jù)Reed-Much方法計(jì)算結(jié)果LD50為10-1.78/0.1 mL。

表1 H9N2感染小鼠LD50測(cè)定(只)Tab.1 Results of LD50 of H9N2 infected in mice(single)

2.2 小鼠造模后表現(xiàn)

2.2.1 小鼠各項(xiàng)指標(biāo)變化 通過14 d的臨床觀察，對(duì)照組小鼠無明顯病理變化，模型組小鼠表現(xiàn)出精神不振、弓背、站立不穩(wěn)、被毛豎立，且可以聽到明顯的呼吸音，鼠籠中小鼠蜷縮聚集在一起，呈現(xiàn)畏寒扎堆的情況(圖1-A)。剖檢第7天的模型組小鼠，可見肺部充血、淤血、腫大，呈現(xiàn)深紅色，肺葉有大面積壞死灶(圖1-B)。模型組小鼠第2天起體質(zhì)量開始下降(圖1-C)，整體病情逐漸加重，第3天開始出現(xiàn)死亡，5～7 d臨床癥狀最為明顯，死亡率最高(圖1-D)。

2.2.2 小鼠肺水腫評(píng)估 模型組小鼠隨時(shí)間增加，肺濕干質(zhì)量比與肺系數(shù)逐漸增加，第7天肺濕干質(zhì)量比最大損傷表現(xiàn)最為嚴(yán)重。與正常組相比，模型組小鼠3～7 d肺濕干質(zhì)量比與肺系數(shù)均呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)，7 d后病情逐漸好轉(zhuǎn)，在觀察期最后一天，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺濕干質(zhì)量比及肺系數(shù)具有顯著差異(P<0.05)，見表2。

表2 肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量與肺系數(shù)的變化(n=3)Tab.2 Lung W/D ratio and changes of lung coefficient in the mice(n=3)

注：與對(duì)照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

Note:*P<0.05，**P<0.01vs.control group.

注：A 小鼠臨床表現(xiàn)；B 小鼠肺組織解剖學(xué)觀察；C 小鼠體質(zhì)量變化；D 累積生存曲線。Note:A is clinical manifestation of mice; B is observation of lung tissue anatomy in mice; C is changes in body weight of mice; D is cumulative survival function curves.圖1 小鼠各項(xiàng)指標(biāo)變化Fig.1 Changes indicators of mice

2.3 連翹酯苷A對(duì)H9N2型禽流感病毒小鼠體征及小鼠體質(zhì)量的影響

2.3.1 小鼠臨床表現(xiàn) 對(duì)照組小鼠無特異體征變化；模型組小鼠被毛豎立，弓背，全身緊張，聚集蜷縮在鼠籠一角，行動(dòng)遲緩，迅速消瘦且采食飲水量減少，與對(duì)照組有顯著區(qū)別。與模型組相比中劑量組、高劑量組小鼠弓背程度減小，被毛豎立程度降低，行動(dòng)及采食飲水均有明顯改善(圖2)。

圖2 小鼠臨床表現(xiàn)Fig.2 Clinical manifestation of mice

2.3.2 小鼠體質(zhì)量變化 試驗(yàn)過程中每天監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量，第2天開始，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，其余各組小鼠體質(zhì)量均明顯下降。與對(duì)照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量降低嚴(yán)重，在5～6 d急劇下降且達(dá)到最低峰。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠體質(zhì)量下降率減小(圖3)。

圖3 H9N2-AIV感染小鼠后的體質(zhì)量變化Fig.3 Weight change of H9N2-AIV infected mice

2.4 連翹酯苷A對(duì)H9N2型禽流感病毒小鼠病理組織學(xué)的影響

2.4.1 小鼠肺組織解剖學(xué)變化 由于5～7 d模型組小鼠病情發(fā)展最為嚴(yán)重，因此選擇第5天進(jìn)行病理剖檢檢測(cè)肺部病理變化(n=3)。對(duì)照組小鼠肺無明顯病理變化，模型組小鼠肺部充血淤血，呈現(xiàn)深紅色病灶。與對(duì)照組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組損傷區(qū)域減小，水腫及充血癥狀有所減輕，其中中劑量組、高劑量組與模型組有顯著差別(圖4)。

2.4.2 小鼠肺部病理學(xué)變化 為進(jìn)一步探究其病理組織的變化，進(jìn)行肺組織切片觀察。與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破環(huán)，肺泡間質(zhì)大量粒細(xì)胞聚集，淋巴細(xì)胞增多，肺泡間質(zhì)多處充血淤血。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞滲出明顯減少，肺組織損傷減輕，有明顯改善(圖5)。

圖4 小鼠肺組織解剖學(xué)觀察Fig.4 Observation of lung tissue anatomy in mice

2.5 連翹酯苷A對(duì)H9N2型禽流感病毒小鼠肺水腫的影響

為探究連翹酯苷A對(duì)H9N2-AIV感染小鼠后肺水腫的影響，分別檢測(cè)肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比及肺系數(shù)。對(duì)照組小鼠肺濕干質(zhì)量比與肺系數(shù)均無明顯變化；第5天與第7天模型組肺濕干質(zhì)量比與肺系數(shù)逐漸增大且極顯著高于其余4組(P<0.01)，低劑量組、中劑量組、高劑量組均極顯著低于模型組(P<0.01)，治療后第14天中劑量組、高劑量組逐漸恢復(fù)到正常水平(圖6-A、圖6-B)。

2.6 連翹酯苷A對(duì)H9N2型禽流感病毒小鼠炎癥細(xì)胞的影響

采用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子IL-6的含量變化。與對(duì)照組相比，各組小鼠IL-6水平在5～7 d極顯著升高(P<0.01)；3～7 d模型組和低劑量組小鼠血清中IL-6表達(dá)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；第5天及第7天中劑量組和高劑量組IL-6含量極顯著低于模型組(P<0.01)，第14天逐步恢復(fù)到正常水平(圖7)。

注：與對(duì)照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組相比#表示P<0.05，##表示P<0.01；A是小鼠肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比；B是小鼠肺系數(shù)變化。Note: *P<0.05，**P<0.01 vs.control group；#P<0.05，##P<0.01 vs.model group; A is Lung wet weight/dry weight(W/D) ratio of mice; B is Lung coeffcient of Mice.圖6 小鼠肺水腫指標(biāo)變化Fig.6 Changes of pulmonary edema index in mice

注：直箭頭指示區(qū)域?yàn)榇罅垦仔粤＜?xì)胞聚集；環(huán)形箭頭指示肺泡間質(zhì)充血。Note:The straight arrow indicates that there is a large number of inflammatory granulocytes in the indicating area; the circular arrow indicates congestion in the alveolar stroma.圖5 感染H9N2-AIV小鼠肺病理組織學(xué)變化Fig.5 The changes of lung histopathology of H9N2-AIV infected mice

2.7 連翹酯苷A對(duì)H9N2型禽流感病毒小鼠TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

為了驗(yàn)證連翹酯苷A對(duì)TLR4信號(hào)通路的影響，利用Western Blot方法對(duì)第5天各組肺組織進(jìn)行MyD88，NF-κBp65，P-NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測(cè)(圖8)。模型組關(guān)鍵蛋白表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，加入連翹酯苷A治療后，呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，中劑量組與高劑量組均極顯著低于模型組(P<0.01)。

注：與對(duì)照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。Note:*P<0.05，**P<0.01 vs.control group；#P<0.05，##P<0.01 vs.model group.圖7 連翹酯苷A對(duì)小鼠感染H9N2-AIV后IL-6的影響Fig.7 Effect of forsythoside A IL-6 in serum of mice infected with H9N2-AIV

注：與對(duì)照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組相比#表示P<0.05，##表示P<0.01。Note:*P<0.05，**P<0.01 vs.control group；#P<0.05，##P<0.01 vs.model group.圖8 小鼠肺組織中TLR4, MyD88, NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)Fig.8 Expression of TLR4, MyD88, NF-κB p65 and p-NF-κB p65 protien in lung tissue of mice

3 討 論

禽流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物物種適應(yīng)過程十分復(fù)雜，能夠影響所有類型的鳥類，其具體作用機(jī)制目前尚不完全清楚[5]。采用H9N2-AIV侵入小鼠機(jī)體，引起動(dòng)物產(chǎn)生急性肺損傷或其他嚴(yán)重的病理形式造成的急性肺損傷模型檢測(cè)發(fā)病機(jī)制，可為人類急性肺損傷反應(yīng)的關(guān)鍵步驟提供重要的試驗(yàn)依據(jù)[6]。本研究中模型組小鼠感染后疾病發(fā)展進(jìn)程趨勢(shì)及指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與早前研究建立模型[7]結(jié)果一致提示小鼠急性肺損傷模型成功建立。

禽流感病毒具有高度傳染性，損傷呼吸系統(tǒng)造成人和動(dòng)物高發(fā)病率和死亡率。TLR4是機(jī)體識(shí)別病原體的固有免疫受體,募集下游信號(hào)分子，活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，調(diào)控相關(guān)受體、酶等發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)[8]。在禽流感病毒感染期間，TLR4信號(hào)通路起著重要的調(diào)節(jié)作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)病毒感染后可激活TLR4信號(hào)通路，活化NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，上調(diào)相關(guān)炎性介質(zhì)的基因，引起肺部IL-6、IL-10等細(xì)胞因子含量升高[9]。細(xì)胞因子是一種調(diào)節(jié)蛋白，具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等多種生物學(xué)活性。復(fù)雜的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)造成組織水腫、出血等癥狀[10-11]，給動(dòng)物體造成嚴(yán)重?fù)p傷甚至威脅生命，有效的治療藥物可以抑制細(xì)胞因子過表達(dá)，保護(hù)機(jī)體減輕免疫損傷。

近年廣泛的試驗(yàn)研究顯示中草藥抗病毒有廣闊前景，中藥的研究分為單味藥和復(fù)方藥，與西藥不同的是單味中藥便可含有多種有效成分，抗病毒機(jī)理復(fù)雜[12-13]。中藥的抗病毒機(jī)制研究具有非常重要的意義。連翹酯苷A是連翹中抗病毒的有效成分單體，具有較好的生物學(xué)活性及免疫調(diào)節(jié)作用[14-16]，逐漸被應(yīng)用于禽流感病毒及急性肺損傷的治療。許多研究顯示，連翹酯苷A可以通過介導(dǎo)多種炎癥通路下調(diào)免疫因子，調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)，達(dá)到抗病毒作用[17-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，連翹酯苷A可減輕小鼠肺組織的病理?yè)p傷，降低肺水腫程度及細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)，緩解炎癥損傷。提示連翹酯苷A可能通過炎癥通路調(diào)控免疫應(yīng)答，抑制IL-6表達(dá)量，減輕炎癥反應(yīng)。禽流感病毒能上調(diào)MyD88、NF-κB p65、P-NF-κB p65表達(dá)量，而低劑量組、中劑量組、高劑量組均能抑制其表達(dá)，且與IL-6炎癥因子含量變化趨勢(shì)一致，提示連翹酯苷A可能通過TLR4信號(hào)通路影響NF-κB p65激活，調(diào)控細(xì)胞因子水平從而達(dá)到抗損傷效果，起到維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。

連翹酯苷A對(duì)低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠均起到治療作用，降低禽流感病毒對(duì)小鼠造成的病理性損害。

連翹酯苷A可減輕禽流感所致的急性肺損傷，其主要作用機(jī)制可能是通過抑制MyD88、NF-κBp65、P-NF-κB p65信號(hào)通路，減輕炎癥因子過度表達(dá)。其具體作用途徑需進(jìn)一步研究，為臨床使用中藥提供更完善的依據(jù)。