王黎霞，黃 芳，張建軍，安 健

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧醫(yī)系；北京 102442；2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

球蟲體外培養(yǎng)對(duì)于研究球蟲發(fā)育、球蟲病防治和球蟲與宿主的關(guān)系具有重大的意義和作用，首先能夠更清楚研究球蟲細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育狀況[1]；其次可分離到較純凈的抗原，為疫苗的研制打下基礎(chǔ)；第三選育弱毒株，為制作弱毒活疫苗提供條件；第四進(jìn)行新型抗球蟲藥或是抗球蟲藥物新劑型研究提供條件[2-3]；第五能夠更直觀檢測(cè)球蟲與宿主細(xì)胞之間的相互作用[4]。更重要的是在科學(xué)研究中，體外培養(yǎng)可以減少動(dòng)物試驗(yàn)，是動(dòng)物福利實(shí)現(xiàn)的重要途徑。

球蟲體外培養(yǎng)中，不同細(xì)胞系對(duì)球蟲的生長和發(fā)育有很大影響。牛腎傳代細(xì)胞(Madin-Darby bovine kidney，MDBK)是培養(yǎng)E.tenella的良好細(xì)胞系[5]，但不適合布氏艾美耳球蟲的培養(yǎng)[6]，小隱孢子蟲在其中也無法發(fā)育[7]。幼地鼠腎細(xì)胞(baby hamster kidney，BHK)被用于培養(yǎng)艾美耳屬球蟲，且認(rèn)為是優(yōu)于雞腎原代細(xì)胞和火雞腎原代細(xì)胞[8]。Tierney認(rèn)為BHK、MDBK、豬腎傳代細(xì)胞(porcine kidney，PK)-13較適宜培養(yǎng)E.tenella[9]。MDBK和肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞(hepatoblastoma，Hep)-2較適合培養(yǎng)剛地弓形蟲，非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(African green monkey kidney，VERO)、BHK、PK-13對(duì)于弓形蟲的體外培養(yǎng)不是很好[10]。人結(jié)腸癌細(xì)胞(human colon cancer cell，HCT)-8被認(rèn)為最適合體外培養(yǎng)小隱孢子蟲[11]，有人比較小隱孢子蟲入侵狗腎傳代細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney，MDCK)、小鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞(Mouse astrocytes，MA)-104、Hep-2和VERO，發(fā)現(xiàn)MDCK最易于感染，在MA-104細(xì)胞中小隱孢子蟲無法進(jìn)行有性生殖，VERO細(xì)胞入侵最少而且無法形成滋養(yǎng)體[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)兔軟骨細(xì)胞(Rabbit chondrocytes，VELI)體外培養(yǎng)小隱孢子蟲得到卵囊，再次感染小鼠時(shí)的毒力更強(qiáng)，說明VELI細(xì)胞更適于體外培養(yǎng)小隱孢子蟲[13]。弓形蟲在宮頸癌細(xì)胞(Henrietta Lacks cervical cancer cell，Hela)中培養(yǎng)可以產(chǎn)生大量的速殖子[14]，可見，細(xì)胞系對(duì)于體外培養(yǎng)寄生蟲的影響很大，不同的胞內(nèi)寄生蟲對(duì)不同的細(xì)胞系的入侵和發(fā)育差別很大，所以在體外培養(yǎng)寄生蟲時(shí)應(yīng)該廣泛選擇細(xì)胞系。

E.acervulina體外培養(yǎng)過程中，有報(bào)道認(rèn)為早熟減毒株裂殖子在雞胚成纖維原代細(xì)胞(chicken embryo fibroblast，CEF)、雞腎原代細(xì)胞(chicken kidney，CK)中不能發(fā)育，而在雞胚小腸上皮原代細(xì)胞可以發(fā)育到卵囊階段[15]。有研究認(rèn)為E.acervulina入侵雞胚小腸上皮48 h形成第一代裂殖子，60 h可見大小配子體，72 h可以見到合子[16]。本試驗(yàn)比較MDBK、VERO、PK-15、CEF、CK 5種不同細(xì)胞在37 ℃和41 ℃下，子孢子的入侵和發(fā)育的情況，以期篩選出適宜E.acervulina體外培養(yǎng)的細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

蟲株：E.acervulina孢子化卵囊，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)秦建華饋贈(zèng)，北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室繁殖并保存。

細(xì)胞系：MDBK，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)索勛饋贈(zèng)；VERO、PK-15，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳清民饋贈(zèng)。

重要試劑： 改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、新生牛血清為Gibico公司產(chǎn)品，青霉素、1∶250胰酶為Orien公司產(chǎn)品，硫酸鏈霉素為Topbio公司產(chǎn)品，蘇木精、伊紅為Amersco公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)材料的純化和培養(yǎng)E.acervulina子孢子的純化參考黃芳[17]，CEF培養(yǎng)參考陳淑亞[18]、CK培養(yǎng)參考姜逸[19]、傳代細(xì)胞系培養(yǎng)參考曾華書[20]。

1.2.2 不同細(xì)胞系、不同溫度下的E.acervulina子孢子入侵率的比較 用胰酶37 ℃，5%CO2消化3 min，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL。將蓋玻片加入6孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液2 mL，在37 ℃、5%CO2和41 ℃、5%CO2分別培養(yǎng)2 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞達(dá)到融合。將純化好的子孢子計(jì)數(shù)，每孔接入105個(gè)，再培養(yǎng)24 h，HE染色觀察，每個(gè)樣品觀察3個(gè)視野，算出平均數(shù)，計(jì)算入侵率。入侵率=一個(gè)視野下被子孢子侵入細(xì)胞數(shù)/一個(gè)視野下細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 不同細(xì)胞系、不同溫度對(duì)入侵時(shí)間的影響 按1.2.2方法在37 ℃，5%CO2和41 ℃，5%CO2培養(yǎng)，每隔0.5 h進(jìn)行HE染色，共觀察3 h，觀察入侵時(shí)間。

1.2.4E.acervulina在MDBK中的發(fā)育 按1.2.2方法37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，每隔12 h更換1次無血清培養(yǎng)基，每隔2 h進(jìn)行高碘酸-shiff染色，觀察球蟲發(fā)育情況。

2 結(jié) 果

2.1 不同細(xì)胞系、不同溫度對(duì)E. acervulina入侵時(shí)間的影響

溫度明顯可以影響子孢子的入侵時(shí)間，子孢子在41 ℃比37 ℃能夠較快入侵細(xì)胞，37 ℃時(shí)子孢子入侵不同細(xì)胞系的時(shí)間一致，41 ℃時(shí)PK-15細(xì)胞入侵所需時(shí)間較長(表1)。

表1 不同細(xì)胞、不同溫度下E. acervulina子孢子入侵時(shí)間Tab.1 The time of E. acervulina sporozoite invasion five cell at 37 ℃ and 41 ℃

2.2 不同細(xì)胞系和溫度對(duì)E. acervulina入侵率的影響

在37 ℃時(shí)，MDBK和PK-15的入侵率顯著高于VERO、CEF、CK(P<0.05)，MDBK的入侵率高于PK-15，但二者差異不顯著(P>0.05)，VERO、CEF、CK的入侵率差異不顯著(P>0.05)，見圖1。

41 ℃時(shí)，MDBK入侵率最高，但MDBK、PK-15、VERO、CEF的入侵率差異不顯著(P>0.05)，CK的入侵率顯著低于其他4種細(xì)胞(P<0.05)，見圖1。

注：A、B、a、b字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。Note: Different letter is significant difference(P<0.05)，same letter is not significant difference(P>0.05).圖1 不同溫度、不同細(xì)胞系E. acervulina入侵率Fig.1 The invasion rate at different temperature and different cell lines

注：A，入侵前的子孢子(↑)；B，共培養(yǎng)1 h附著于細(xì)胞表面的子孢子(↑)；C，2 h后細(xì)胞入侵成功(↑)；D，24 h后的子孢子長大，發(fā)育為滋養(yǎng)體(↑)；E，52 h的第一代裂殖體(↑)；F，56 h第一代裂殖體發(fā)育成熟(↑)；G，H，60 h第一代裂殖子正在釋放出細(xì)胞(↑)；I，72 h形成第二代裂殖體(↑)。Note: A, The sporozotie before invasion(↑); B, the sporozoite adhere to the cell after co-culture 1 h(↑); C, the sporozoite entered the cell after co-culture 2 h(↑); D, the trophozoite within parasitophorous vacuole after co-culture 24 h(↑); E, the developed schizont after co-culture 52 h(↑); F，the developed schizont after co-culture 56 h(↑); G, H, the merozoite released from cells after co-culture 60 h(↑); I, the second generation schizont formed after co-culture 72 h(↑).圖2 E. acervulina MDBK內(nèi)發(fā)育Fig.2 Development of E. acervulina in MDBK

比較溫度對(duì)入侵率的影響，PK-15和MDBK 37 ℃的入侵率顯著高于41 ℃的入侵率， VERO、CEF、CK 41 ℃的入侵率顯著高于37 ℃的入侵率，但總體比較MDBK的入侵率無論是在41 ℃還是在37 ℃下培養(yǎng)入侵率都較高，見圖1。

2.3 E. acervulina 在MDBK中發(fā)育情況

染色后顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)1 h子孢子附著于細(xì)胞表面，2 h后子孢子入侵MDBK中，形成帶蟲空泡。24 h后子孢子轉(zhuǎn)化為早期第一代裂殖體，52 h開始形成第一代裂殖體，56 h形成成熟的第一代裂殖體，60 h第一代裂殖子釋放出細(xì)胞，72 h形成完整的第二代裂殖體，證明E.acervulina利用MDBK在37 ℃培養(yǎng)可以進(jìn)行胞內(nèi)繁殖，見圖2。

3 討 論

細(xì)胞對(duì)球蟲體外培養(yǎng)的影響很大，MDBK是來自牛的細(xì)胞系，適宜大部分艾美耳屬寄生蟲體外培養(yǎng)，但不適合布氏艾美耳球蟲和肉孢子蟲的培養(yǎng)[6]。HCT-8和MDCK適宜小隱孢子蟲的培養(yǎng)[11]，原代牛臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞適宜牛艾美耳球蟲和祖氏艾美耳球蟲的培養(yǎng)[21]，因此，細(xì)胞對(duì)于體外培養(yǎng)寄生蟲的影響十分明顯，為了篩選出適宜E.acervulina體外培養(yǎng)的細(xì)胞，本試驗(yàn)選擇MDBK、PK-15、VERO、CEF和CK 5種細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)對(duì)比試驗(yàn)。

41 ℃是雞的體溫，球蟲生活在雞的腸道，41 ℃比較適宜子孢子生長，對(duì)比41 ℃和37 ℃對(duì)入侵的影響。在三個(gè)傳代細(xì)胞系中，41 ℃都不利于細(xì)胞生長，溫度改變后細(xì)胞基本處于維持狀態(tài)無法進(jìn)行繁殖，不適宜體外培養(yǎng)E.acervulina，對(duì)于原代細(xì)胞41 ℃時(shí)只有入侵時(shí)間縮短，入侵率并沒有優(yōu)勢(shì)。原代細(xì)胞傳代中細(xì)胞發(fā)育不穩(wěn)定，一般認(rèn)為成纖維細(xì)胞可以傳代20次左右，但是在試驗(yàn)過程中無法保證每次傳代的生長效果完全一致，對(duì)于下一步的研究有一定的影響。

Naciri-Bontemps用3日齡雞腎原代細(xì)胞體外培養(yǎng)E.acervulina時(shí)，在EHT培養(yǎng)基培養(yǎng)44 h可見第一代裂殖體。感染54 h第一代裂殖子釋放出細(xì)胞。68 h，其入侵周圍的細(xì)胞并發(fā)育成第二代裂殖體。72～96 h，可以觀察到第三代和第四代裂殖子。第四代裂殖子可以發(fā)育成為配子體，當(dāng)把收集的配子體感染給雞45 h可以收獲卵囊[22]。E.acervulina子孢子和細(xì)胞共培養(yǎng)2 h才侵入細(xì)胞，在42 h第一代裂殖體發(fā)育完全，56 h才從細(xì)胞中釋放出來。72 h可見第二代裂殖子發(fā)育成熟。這可能與培養(yǎng)基中血清含量有關(guān)。有研究證明當(dāng)培養(yǎng)基成分為90% HBSS、5%乳清蛋白水解物和5%胎牛血清比用95% M199和5%胎牛血清，E.tenella入侵更多[23]。有研究曾比較雞血清，小牛血清，兔血清和豬血清對(duì)雞原代細(xì)胞的生長、子孢子入侵能力以及對(duì)E.tenella的第一代和第二代裂殖體的作用效果的影響，發(fā)現(xiàn)，雞血清組子孢子入侵能力最強(qiáng)，胎牛血清組第二代裂殖體比雞血清多，但雞血清組的卵囊比胎牛血清多[9]。有研究證明，在無血清培養(yǎng)基中，人隱孢子蟲和小隱孢子蟲可以發(fā)育，并能完成生活史[11]。

MDBK培養(yǎng)E.acervulina可以形成第二代裂殖體，而VERO、PK-15只能發(fā)育到第一代裂殖體階段，CEF和CK中E.acervulina有第一代裂殖子的釋放，但未再次入侵，并且CEF和CK不易傳代，5種細(xì)胞中，MDBK最適宜E.acervulina培養(yǎng)；與MDBK共培養(yǎng)1 h子孢子附著于細(xì)胞表面，2 h子孢子入侵，子孢子入侵24 h形成第一代滋養(yǎng)體，52～56 h形成第一代成熟裂殖體，60 h第一代裂殖子釋放出細(xì)胞，72 h形成第二代裂殖體，在VERO、MDBK、PK-15、CEF及CK這5種細(xì)胞中，MDBK是培養(yǎng)E.acervulina的最適宜細(xì)胞。