植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體的制備

王 歡，張紅星，金君華，謝遠(yuǎn)紅

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室/北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心/農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

細(xì)菌素(bacteriocins)是某些細(xì)菌產(chǎn)生的具有抑菌生物活性的多肽、蛋白或蛋白復(fù)合物[1]。其作為一種安全高效的天然生物抑菌劑，近年來在食品保藏和抑菌類藥物開發(fā)等行業(yè)的應(yīng)用受到極大的關(guān)注。由乳酸菌代謝所產(chǎn)的細(xì)菌素被稱為乳酸菌素，是一種安全的蛋白類物質(zhì)[2]，同時(shí)可抑制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、幽門螺桿菌和沙門氏菌等致病菌[2-3]以及腐敗菌的生長。乳酸乳球菌素Nisin和乳酸片球菌素Pediocin是目前大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用的乳酸菌細(xì)菌素，已經(jīng)被80多個(gè)國家和地區(qū)允許作為食品添加劑，應(yīng)用在奶酪、牛奶制品、果汁和罐頭等食品生產(chǎn)中[4]。針對食品中乳酸乳球菌素Nisin的檢測方法，1990年建立第一種乳酸乳球菌素Nisin免疫試驗(yàn)，即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。使用制備的羊抗乳酸乳球菌素Nisin的多克隆抗體，能夠檢測到溶液中5 ng/mL的乳酸乳球菌素Nisin，檢測到奶酪中231 ng/g的乳酸乳球菌素Nisin[5]。

前期研究中，本課題組從天然發(fā)酵的肉制品中篩選得到1株植物乳桿菌BM-1(LactobacillusplantarumBM-1)。通過體外抑菌試驗(yàn)證實(shí)，植物乳桿菌BM-1能夠代謝產(chǎn)生一種對單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、志賀氏菌(Shigelladysenteriae)等都具有一定抑菌效果的細(xì)菌素蛋白，命名為植物乳桿菌素BM-1[5]。由于植物乳桿菌素BM-1對多種食源性致病菌都具有一定的抑菌效果，且熱穩(wěn)定性良好，在pH 2.0～10.0范圍內(nèi)均具有良好的抑菌活性，相對于乳酸乳球菌素Nisin在食品防腐保鮮領(lǐng)域具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

植物乳桿菌素作為一種新型的IIa類乳酸菌素，目前限制其在食品保鮮應(yīng)用中存在的最大問題是，還沒有建立食品中植物乳桿菌素的定量檢測方法。由于植物乳桿菌素BM-1是一種蛋白，因此建立針對植物乳桿菌素BM-1的免疫學(xué)定量檢測方法顯得尤為重要。本研究的目的是制備高滴度的植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體，為進(jìn)一步建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測植物乳桿菌素BM-1的方法奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組免疫原pKYCS-KLH、pKYCS-BSA(上海強(qiáng)耀生物技術(shù)有限公司)，小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室保存)，鼠單抗亞型鑒定試劑盒(Sigma公司)。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6DCP-32B型恒流電泳儀(北京六一儀器廠)，酶標(biāo)測定儀(Bio Rad公司)，BT2202S電子天平(Starorius公司)，BIOFUGE STRATOS臺式冷凍離心機(jī)(Theromo公司)，2000微量分光光度計(jì)(Theromo公司)。

1.3 方 法

1.3.1 植物乳桿菌素BM-1抗原制備 根據(jù)Atrih[6]研究，按照植物乳桿菌素BM-1的氨基酸序列，合成植物乳桿菌素BM-1成熟肽，全序列為KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAM AWATGGHQGNHKC。并委托上海強(qiáng)耀生物技術(shù)有限公司將合成的植物乳桿菌素BM-1分別偶聯(lián)鑰孔血藍(lán)蛋白和牛血清白蛋白制備得到人工抗原pKYCS-KLH和人工抗原pKYCS-BSA，用于后續(xù)免疫試驗(yàn)動(dòng)物。

1.3.2 人工抗原動(dòng)物免疫 將人工抗原pKYCS-KLH按60 μg蛋白/只小鼠的量與等體積的完全弗氏佐劑混合，皮下注射初次免疫4只無特定病原體級(SPF級)的Balb/c雌性小鼠。每隔15 d加強(qiáng)1次免疫，按照30 μg蛋白/只小鼠的量共加強(qiáng)4次，之后進(jìn)行眼眶取血，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測其血清效價(jià)。

1.3.3 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測抗體滴度 取制備的人工抗原pKYCS-BSA加入到包被緩沖液(0.02 mol/L Na2CO3，0.03 mol/L NaHCO3，pH 9.6)中，終濃度為10 mg/mL。取100 μL包被緩沖液，加入到96孔板，于4 ℃包被過夜，棄去孔內(nèi)液體，洗滌3次后于室溫晾干。每孔加入200 μL封閉液(10%小牛血清)，37 ℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體，洗滌3次并于室溫晾干。將待測血清用稀釋液(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2)從200倍稀釋液開始進(jìn)行連續(xù)的二倍梯度稀釋，一直到稀釋倍數(shù)為102 400倍。于96孔板中每孔加入不同稀釋度的血清100 μL，并且將陰性血清做陰性對照，稀釋液做空白對照，用于消除稀釋液對反應(yīng)的影響。37 ℃溫育45 min，棄去孔內(nèi)液體，洗滌3次后于室溫晾干。把酶標(biāo)二抗稀釋成1∶20 000，100 μL/孔加入酶標(biāo)板，37 ℃溫育30 min，棄去孔內(nèi)液體，洗滌3次后于室溫晾干。96孔板中每孔加入100 μL顯色液，37 ℃溫育10 min。每孔加入50 μL終止液，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的吸光值(OD值)。結(jié)果判定：檢測孔OD值大于或等于2倍陰性O(shè)D值(P/N)的最高抗體稀釋倍數(shù)為檢測樣品抗體的滴度。

1.3.4 細(xì)胞融合及陽性細(xì)胞篩選 于融合前3 d向最佳免疫小鼠脾臟注射20 μg免疫原加強(qiáng)免疫。斷頸處死小鼠，分離小鼠脾臟，輕輕刮取脾細(xì)胞。取同時(shí)培養(yǎng)的人骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，兩者按10∶1比例混合，緩慢加入聚乙二醇，進(jìn)行兩種細(xì)胞的融合，使其充分反應(yīng)后，用培養(yǎng)基洗2遍，最后溶于Dulbecco's Modified Eagle Medium-HAT培養(yǎng)基中，于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)6 d。將培養(yǎng)板中液體換為 Dulbecco's Modified Eagle Medium-HT培養(yǎng)基，于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。取細(xì)胞上清液，進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測，陽性孔即分泌抗體的細(xì)胞孔，標(biāo)記為陽性細(xì)胞克隆。針對陽性細(xì)胞克隆進(jìn)行二倍梯度稀釋，進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)5代，分別檢測每一代上清效價(jià)，如均為陽性則為篩選得到的分泌抗植物乳桿菌素BM-1的雜交瘤細(xì)胞株，于-80 ℃保存。

1.3.5 植物乳桿菌素單克隆抗體亞型鑒定 用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4稀釋pKYCS-BSA包被抗體至0.5 μg/mL，于96孔板中每孔加 100 μL稀釋液，4 ℃反應(yīng)過夜。棄去孔中的液體，使用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，于每孔中加入 200 μL封閉液，37 ℃孵育2 h。棄去孔中的液體，使用含有0.05%吐溫-20磷酸鹽緩沖液洗滌3次，于每孔中加入100 μL雜交瘤細(xì)胞上清，37 ℃孵育1 h。棄去孔中的液體，使用0.05%吐溫-20磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每孔中加入100 μL用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h。棄去孔中的液體，使用0.05%吐溫-20磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每孔中加入50 μL顯色底物，顯色10 min。酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測吸光值(OD450)。

1.3.6 植物乳桿菌素單克隆抗體的純化及定量 取培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞腹腔注射Balb/c雌性小鼠，7 d后于腹腔收集腹水。取5 mL腹水與15 mL 磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L pH 7.0)混勻后，逐滴加入500 μL辛酸，磁力攪拌30 min，4 ℃靜置2 h。用濾紙過濾得到上清液加入1/10體積的磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L pH 7.0)，并向液體中緩慢加入硫酸銨，磁力攪拌30 min，使硫酸銨達(dá)到65%，4 ℃靜置2 h，4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，棄上清，將沉淀用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L pH 7.0)溶解并在4 ℃條件下透析去除硫酸銨，冷凍干燥純化的單克隆抗體，并于-20 ℃儲存。采用核酸蛋白定量儀(NanoDrop 2000C，Thermo公司)檢測植物乳桿菌素單克隆抗體的蛋白濃度。

1.3.7 蛋白電泳檢測單克隆抗體純度 取純化的植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體與2×三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)樣品緩沖液在1.5 mL離心管中混合，100 ℃加熱5 min。制備Tricine-SDS凝膠，分離膠18%，濃縮膠5%。將凝膠置入電泳槽，向電泳槽加入1×Tricine-Tris-SDS電泳緩沖液，150 V電泳2 h，染色后采用光密度分析法檢測蛋白純度。

2 結(jié)果分析

2.1 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測小鼠血清效價(jià)

采用制備的乳酸菌素人工抗原pKYCS-BSA免疫小鼠，免疫5次后于7 d后分別檢測4只小鼠血清中乳酸菌素抗體效價(jià)，結(jié)果如表1所示。其中2號小鼠血清中乳酸菌素抗體效價(jià)最高，血清稀釋倍數(shù)達(dá)到102 400時(shí)P/N值為2.8，顯著大于1號小鼠的1.7，3號小鼠的1.1和4號小鼠的1.3。選擇2號小鼠進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞融合試驗(yàn)。

表1 小鼠血清效價(jià)分析Tab.1 Titer analysis of mice serum

2.2 細(xì)胞融合試驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞融合后，進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測篩選的單克隆細(xì)胞產(chǎn)生抗體的效價(jià)。細(xì)胞進(jìn)行1次96孔板的篩選，結(jié)果如表2所示。共篩選得到6株呈陽性的雜交瘤細(xì)胞，分別是E3、E5、E7、E9、F5、G4孔細(xì)胞，陽性率為6.45%。

選取6株陽性細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)10代，有限稀釋法進(jìn)行二次篩選，結(jié)果如表3所示。其中2株陽性細(xì)胞穩(wěn)定性較好，按照吸光值大小最終篩選得到2株效價(jià)較高的單克隆細(xì)胞株E5和E9。

2.3 單克隆細(xì)胞亞類鑒定

選取篩選得到的2株單克隆細(xì)胞株E5和E9，進(jìn)行亞型鑒定分析，結(jié)果如表4所示。E5和E9細(xì)胞株均為IgM類型的陽性雜交瘤細(xì)胞株。

2.4 植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體的純化

將得到的雜交瘤細(xì)胞E5擴(kuò)大培養(yǎng)，注射成年BALB/c小鼠腹腔，誘發(fā)腹水，獲取腹水。經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測，腹水效價(jià)為21.26×104。采用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行單克隆抗體的純化試驗(yàn)，經(jīng)蛋白純化，蛋白質(zhì)量濃度13.2 mg/mL，分析純度達(dá)到92%。

表2 細(xì)胞融合試驗(yàn)篩選結(jié)果Tab.2 Screening results of cell fusion experiment

注：H12孔為陽性對照讀數(shù)，G12為空白對照讀數(shù)，F(xiàn)12為陰性對照讀數(shù)；方框中的數(shù)字代表陽性孔數(shù)。

Note: H12 is the positive control reading, G12 is the blank control reading, and F12 is the negative control reading; positive well numbers are shown in box.

表3 陽性細(xì)胞株篩選結(jié)果Tab.3 Screening results of positive cell lines

表4 單克隆細(xì)胞亞類鑒定結(jié)果Tab.4 Identification of monoclonal cell subsets

采用Tricine電泳檢測純化的植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體，結(jié)果如圖1。獲得清晰的2條蛋白帶，分別為單克隆抗體的重鏈和輕鏈。

注：M是預(yù)染蛋白Marker，1是植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體。Note: M is Pre-stained protein Marker, 1 is Plantaricin BM-1 monoclonal antibody.圖1 植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體SDS-PAGE電泳圖Fig.1 Electrophoresis analysis of planraricin BM-1 monoclonal antibody

3 討 論

在前期研究中，本課題組從天然發(fā)酵食品中分離得到1株產(chǎn)乳酸菌素的植物乳桿菌BM-1，抑菌活性分析表明，植物乳桿菌素BM-1對多種食源性革蘭氏陽性和陰性致病菌均具有良好的抑菌作用[4]。將其應(yīng)用于冷鮮肉中微生物污染的控制研究中，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌素BM-1能夠顯著抑制冷鮮肉中單增李斯特菌的污染，并且有效降低冷鮮肉表面菌落總數(shù)[7]。目前，已經(jīng)報(bào)道多種由植物乳桿菌代謝產(chǎn)生的細(xì)菌素應(yīng)用于食品微生物污染控制。例如，植物乳桿菌素Plantaricin C19，是一種由植物乳桿菌C19產(chǎn)生的，具有抗單增李斯特菌作用的細(xì)菌素，在其N端含有的一段保守序列YYGNGV，結(jié)構(gòu)分析表明其與乳酸片球菌素Pediocin的結(jié)構(gòu)高度類似，能夠顯著抑制多種食源性致病微生物[6]。植物乳桿菌LR/14產(chǎn)生的抗菌肽LR14，對黑曲霉、匍匐根霉、總狀毛霉和產(chǎn)黃青霉4種腐敗真菌具有抑菌效果，并且在實(shí)驗(yàn)室條件下能提高小麥的儲藏時(shí)間[8]。

關(guān)于細(xì)菌素的定量分析方法，目前主要有微量滴定法、比濁法和免疫學(xué)方法等。前2種方法更多的用于檢測細(xì)菌素的活性，而免疫學(xué)方法用于定量檢測細(xì)菌素蛋白的含量[9]。Suarez等[10]建立的直接競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測結(jié)果表明，使用小鼠來源的乳酸乳球菌素Nisin單克隆抗體的檢測限明顯高于使用多克隆抗體的檢測限。Bouksaim等[11]利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)菌素。將乳酸乳球菌素Nisin包被于酶標(biāo)板，并用親和純化的抗乳鏈菌肽抗體進(jìn)行檢測。為了減少非特異性結(jié)合，在酶標(biāo)板上涂一層吐溫-20。建立的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對純?nèi)樗崛榍蚓豊isin更敏感，為研究細(xì)菌素的產(chǎn)生及其在食品貨架期中的抗菌活性提供一種工具。[11]。

細(xì)菌素抗體的產(chǎn)生為細(xì)菌素的檢測和定量提供特異和敏感的方法，使免疫化學(xué)分析成為可能?？贵w的制備為利用免疫親和層析法純化細(xì)菌素提供可能的替代方法。而細(xì)菌素純化率低是細(xì)菌素自身或結(jié)合載體蛋白免疫試驗(yàn)動(dòng)物的主要缺點(diǎn)，之前成功的經(jīng)驗(yàn)大多是采用合成的細(xì)菌素生產(chǎn)多克隆抗體或者單克隆抗體[12]。Keren等[12]合成的乳鏈球菌素RM免疫兔子制備細(xì)菌素多克隆抗體，得到抗體的滴度約為1∶140 000。Martínez等[13]用合成的植物乳桿菌素PA-1免疫兔子制備多克隆抗體，得到抗體的滴度約為1∶102 000，均遠(yuǎn)低于本研究制備的細(xì)菌素單克隆抗體的滴度。本研究同樣采用合成的植物乳桿菌素BM-1制備人工抗原后免疫小鼠，并分離小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選得到2株能夠穩(wěn)定分泌植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞E5免疫小鼠誘發(fā)腹水，抗體滴度在1∶200 000以上。本研究為進(jìn)一步建立基于免疫學(xué)的植物乳桿菌素BM-1定量檢測方法奠定研究基礎(chǔ)。