賈慧慧，王超男，魏艷敏，趙曉燕，高坦坦，任爭光*

(北京農(nóng)學(xué)院a.農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物生產(chǎn)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，b.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)普遍存在于植物的根際土壤中，具有綠色、抑菌譜廣、耐儲(chǔ)藏、耐逆境等特點(diǎn)，是植物保護(hù)工作者進(jìn)行生物防治研究的一類重要微生物[1]。解淀粉芽胞桿菌能夠合成多種抗菌代謝產(chǎn)物，其中，以非核糖體合成的聚酮化合物、脂肽化合物和核糖體合成的細(xì)菌素為主[2-3]。利用這些抗菌代謝產(chǎn)物，解淀粉芽胞桿菌能夠抑制多種病原真菌和細(xì)菌的生長。另外，解淀粉芽胞桿菌與植物的相互作用可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(Induced systemic resistance, ISR)，使植物抗病性增強(qiáng)[4]。北京農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室前期從杏樹根際土壤分離到一株解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)BJ-6，研究發(fā)現(xiàn)該菌株及其發(fā)酵液對(duì)蘋果樹皮腐爛病菌(Valsamali)、蘋果輪紋病菌(Physalosporapiricola)、桃褐腐病菌(Monilinialaxa)和白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)等多種病原真菌具有很強(qiáng)的抑菌活性[5-6]。本研究對(duì)解淀粉芽胞桿菌BJ-6全基因組進(jìn)行測序、基因預(yù)測與功能注釋，分析抗菌代謝產(chǎn)物的合成基因簇，并驗(yàn)證部分抗菌物質(zhì)合成基因的表達(dá)，為今后深入研究該菌株的拮抗機(jī)制提供保障。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株B.amyloliquefaciensBJ-6分離自北京市門頭溝區(qū)杏樹根際土壤，北京農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室保存。供試LB培養(yǎng)基配方為酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；NB培養(yǎng)基配方為牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)菌總DNA和RNA的提取 將解淀粉芽胞桿菌BJ-6用LB培養(yǎng)基于28 ℃、200 r/min培養(yǎng)36 h，收集菌體，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司)提取總DNA。將解淀粉芽胞桿菌BJ-6菌株接種到NB培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r/min培養(yǎng)60 h，并分別于12、24、36、48、60 h時(shí)取樣，利用細(xì)菌RNA提取試劑盒(購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司)提取解淀粉芽胞桿菌BJ-6不同時(shí)間段的總RNA。

1.2.2 基因組測序與組裝 細(xì)菌DNA檢測合格后送北京賽默百合生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測序。采用全基因組鳥槍法(Whole-genome shotgun, WGS)，構(gòu)建不同插入片段的文庫，基于illumina MiSeq測序平臺(tái)進(jìn)行測序，獲得的原始數(shù)據(jù)采用Edena軟件進(jìn)行組裝[7]。

1.2.3 基因預(yù)測及注釋 使用Prodigal軟件對(duì)序列的蛋白編碼區(qū)(Coding sequence, CDS)進(jìn)行預(yù)測，使用Infernal、Rnammer軟件對(duì)tRNA、rRNA和ncRNA進(jìn)行預(yù)測[8-9]。使用RFam、Nr、KEGG、Swissprot和Nt數(shù)據(jù)庫對(duì)所有基因進(jìn)行比對(duì)和功能注釋[10-11]。通過antiSMASH軟件進(jìn)行抗菌次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇的預(yù)測[12]。

1.2.4 抗菌代謝產(chǎn)物主要合成基因轉(zhuǎn)錄分析 將1.2.1中提取的總RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，包括反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μL、反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、Oligo(dT)引物1 μL、隨機(jī)核苷酸引物1 μL。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?7 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，使得反轉(zhuǎn)錄酶失活，最后4 ℃保存。根據(jù)次級(jí)代謝產(chǎn)物抗菌基因簇的預(yù)測結(jié)果，以cDNA為模板，設(shè)計(jì)7對(duì)引物(表1)分別擴(kuò)增抗菌代謝產(chǎn)物(豐原素、桿菌素、大環(huán)內(nèi)酯抗生素、桿菌溶素、兒茶酚型嗜鐵素、表面活性素和伊枯草菌素)合成相關(guān)基因的部分序列(200 bp左右)；設(shè)計(jì)1對(duì)引物(表1)擴(kuò)增細(xì)胞壁組分糖醛酸磷壁酸質(zhì)的合成基因作為對(duì)照；同時(shí)以解淀粉芽胞桿菌BJ-6總DNA為模板作為對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增。分析不同培養(yǎng)時(shí)間段(12～60 h)抗菌代謝產(chǎn)物合成基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。

表1 用于擴(kuò)增解淀粉芽胞桿菌BJ-6抗菌代謝產(chǎn)物合成基因的引物序列Tab.1 Primer sequences for amplifying biosynthesis genes of antibiotic metabolite

2 結(jié) 果

2.1 解淀粉芽胞桿菌BJ-6基因組序列結(jié)構(gòu)特征

經(jīng)過全基因組測序，序列拼接比對(duì)和注釋分析，最后得到解淀粉芽胞桿菌BJ-6的全基因組序列4 175 709 bp。該序列GC含量為46.12%，預(yù)測的蛋白編碼區(qū)(CDS)為4 075個(gè)；最后注釋基因4 261個(gè)，包括87個(gè)tRNA基因、13個(gè)rRNA基因、1個(gè)tmRNA和85個(gè)miscRNA基因；基因間區(qū)占12.04%，基因的平均長度862 bp，基因的GC含量平均為47.21%；基因間區(qū)GC含量為38.22%，基因間區(qū)平均長度118 bp；共找到154個(gè)串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，10個(gè)IS序列，5個(gè)噬菌體元件。將解淀粉芽胞桿菌BJ-6與已公開發(fā)表解淀粉芽胞桿菌FZB42(GenBank登錄號(hào)：CP000560)[13]進(jìn)行比較，相對(duì)于FZB42，解淀粉芽胞桿菌BJ-6基因組較大，編碼蛋白基因數(shù)量也多，而GC含量、編碼區(qū)占比和IS序列數(shù)量基本一致(表2)。

表2 解淀粉芽胞桿菌BJ-6全基因組序列基本特征及菌株FZB42的對(duì)比結(jié)果Tab.2 The features of whole genome sequences of B. amyloliquefaciens BJ-6 and FZB42

2.2 主要代謝途徑功能基因分析

KEGG分析解淀粉芽胞桿菌BJ-6基因組中主要代謝途徑基因，有20種主要代謝通路，對(duì)參與各代謝通路的基因數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見圖1。參與氨基酸代謝和碳水化合物代謝的基因較多，都在200個(gè)以上；其次是參與跨膜運(yùn)輸、輔助因子和維生素代謝的基因；萜類和聚酮化合物，以及其他次級(jí)代謝物生物合成的數(shù)量共有74個(gè)，其中包括該菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的合成基因。

圖1 解淀粉芽胞桿菌BJ-6主要代謝通路注釋統(tǒng)計(jì)Fig.1 Annotation graph of B. amyloliquefaciens BJ-6 protein encoding gene KEGG pathway

2.3 抗菌代謝產(chǎn)物基因簇的分析

通過antiSMASH軟件對(duì)解淀粉芽胞桿菌BJ-6抗菌代謝產(chǎn)物編碼基因簇進(jìn)行預(yù)測(表3)。在解淀粉芽胞桿菌BJ-6全基因組中預(yù)測到7個(gè)抑菌代謝產(chǎn)物編碼基因簇，其中豐原素、桿菌溶素、表面活性素，兒茶酚型嗜鐵素和伊枯草菌素是通過非核糖體途徑(Nonribosomal peptidesynthesis, NRPS)合成，桿菌素和大環(huán)內(nèi)酯抗生素通過聚酮化合物途徑(Polyketide biosynthase, PKS)合成。除表面活性素外，其他基因簇均與模式菌株FZB42具有極高的同源性，相似度均達(dá)到100%(表3)。這些基因簇編碼合成的物質(zhì)具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌和累積鐵離子等功能活性。進(jìn)一步將解淀粉芽胞桿菌BJ-6的表面活性素合成基因簇與FZB42的相關(guān)合成基因簇(srfAA-srfAB-srfAC-srfAD)進(jìn)行全序列比對(duì)，相對(duì)于FZB42的表面活性素合成基因簇，解淀粉芽胞桿菌BJ-6的表面活性素合成基因序列大量缺失，但是剩余序列仍和FZB42的合成基因簇相關(guān)序列高度同源(圖2)。

表3 解淀粉芽胞桿菌BJ-6編碼的抗菌物質(zhì)Tab.3 Gene clusters of antibiotic secondary metabolites of B. amyloliquefaciens BJ-6

圖2 解淀粉芽胞桿菌BJ-6與模式菌株FZB42的表面活性素合成基因簇比對(duì)分析結(jié)果Fig.2 Comparison of the surfactin biosynthesis gene clusters between B. amyloliquefaciens BJ-6 and FZB42

2.4 基因轉(zhuǎn)錄分析

為了驗(yàn)證抗菌物質(zhì)合成基因在解淀粉芽胞桿菌BJ-6中是否正常表達(dá)，對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的解淀粉芽胞桿菌BJ-6總RNA進(jìn)行提取，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，通過設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增抗菌物質(zhì)合成基因。解淀粉芽胞桿菌BJ-6在NB中培養(yǎng)12～60 h，以不同時(shí)間段的cDNA為模板，均擴(kuò)增到豐原素、桿菌素、大環(huán)內(nèi)酯抗生素、桿菌溶素、兒茶酚型嗜鐵素、表面活性素和伊枯草菌素的合成基因目的片段，說明這些抗菌物質(zhì)合成基因能夠正常表達(dá)(圖3)。

3 討 論

隨著DNA測序技術(shù)的革新和基因組學(xué)研究的發(fā)展，越來越多的芽胞桿菌全基因組被測序，截止目前在NCBI網(wǎng)站公布的芽胞桿菌全基因組有200多個(gè)，其中包括枯草芽胞桿菌51株，解淀粉芽胞桿菌18株，這些生物學(xué)信息為研究生防芽胞桿菌提供重要的依據(jù)。本研究對(duì)解淀粉芽胞桿菌BJ-6全基因組進(jìn)行測序，獲得大小為4 175 709 bp的序列，序列的GC含量為46.12%，預(yù)測編碼區(qū)4 075個(gè)，加上各種RNA基因共4 261個(gè)。與模式解淀粉芽胞桿菌FZB42相比，解淀粉芽胞桿菌BJ-6序列更大，編碼蛋白基因數(shù)更多。通過KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測到解淀粉芽胞桿菌BJ-6的主要代謝通路共20種，antiSMASH軟件預(yù)測次級(jí)代謝抗菌化合物合成基因簇，發(fā)現(xiàn)豐原素、桿菌素、大環(huán)內(nèi)酯抗生素、桿菌溶素、兒茶酚型嗜鐵素、表面活性素和伊枯草菌素這7種抗菌化合物的合成基因簇。另外，還發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌BJ-6的表面活性素合成基因簇與模式菌株FZB42的相關(guān)合成基因簇序列存在較大差異。對(duì)解淀粉芽胞桿菌BJ-6的RNA進(jìn)行提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這7種抗菌物質(zhì)的關(guān)鍵合成基因都能正常表達(dá)。這為下一步鑒定解淀粉芽胞桿菌BJ-6產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)種類奠定基礎(chǔ)。