戴佳格，張紫薇，韓思雨，張東宇，高建明

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol Regulatory Element Binding Proteins，SREBPs)是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜連接蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)受到細(xì)胞中胰島素和固醇水平調(diào)節(jié)和控制，在膽固醇合成/吸收和脂肪酸合成中發(fā)揮作用，在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)存在兩種SREBP，分別為SREBP1和SREBP2。其中SREBP1主要在調(diào)節(jié)脂肪酸的合成和代謝中發(fā)揮作用，參與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的多種組織器官脂質(zhì)代謝。脂肪組織中具有較高的SREBP1和過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達(dá)[1]。脂肪細(xì)胞由前脂肪細(xì)胞分化而來，過氧化物酶體增殖物激活受體γ、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancer binding protein，C/EBP)和脂肪細(xì)胞分化決定因子1(α-Adducin，ADD1)/SREBP1等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子共同調(diào)控其分化過程[2]。水飛薊素(Silibinin)添加在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系培養(yǎng)液中，可以降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞核內(nèi)SREBP1的表達(dá)及其與脂質(zhì)合成相關(guān)的下游基因(脂肪酸合成酶、硬脂酰輔酶A去飽和酶1、腺苷三磷酸檸檬酸裂解酶、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白)表達(dá)水平，降低了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中脂質(zhì)積累[3]。在轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系中過表達(dá)位于1q21.2上的長鏈非編碼RNA，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的SREBP1蛋白表達(dá)顯著升高，表明過表達(dá)位于1q21.2上的長鏈非編碼RNA通過SREBP1調(diào)控脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)來調(diào)控轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的生長[4]。然而，有研究表明SREBP1對豬卵母細(xì)胞外發(fā)育有一定影響。Lee等發(fā)現(xiàn)在豬體外成熟液中添加50 μmol/L羊毛甾醇，豬成熟卵母細(xì)胞中SREBP1等基因表達(dá)顯著升高，有利于豬卵母細(xì)胞的體外成熟[5]。在豬體外成熟液中補(bǔ)充10-9mol/L褪黑素，成豬熟卵母細(xì)胞中SREBP1等基因表達(dá)顯著升高，促進(jìn)了豬卵母細(xì)胞的體外成熟及其孤雌激活胚胎的體外發(fā)育[6]。然而，激動(dòng)或干擾SREBP1的作用對于豬卵母細(xì)胞體外成熟效果的影響尚不清楚。

本試驗(yàn)在豬卵母細(xì)胞體外成熟22 h分別顯微注射SREBP1干擾片段固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1-Sus-756(sterol regulatory element binding proteins 1-Sus-756，SREBP1-Sus-756)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1-Sus-837(sterol regulatory element binding proteins 1-Sus-837，SREBP1-Sus-837)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1-Sus-1104(sterol regulatory element binding proteins 1-Sus-1104，SREBP1-Sus-1104)和激動(dòng)劑(50、75、100、125、150和175 nmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)22 h，體外受精6 h進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)，并篩選出最佳SREBP1干擾片段和激動(dòng)劑濃度，觀察其對豬卵母細(xì)胞體外成熟及體外受精胚胎發(fā)育的影響。

1 材料方法

1.1 豬卵母細(xì)胞的采集和體外成熟

由北京近郊屠宰場采集的豬卵巢放在加入雙抗的37 ℃生理鹽水中運(yùn)回試驗(yàn)室并洗滌3次，浸在該37 ℃生理鹽水中。用帶12號針頭10 mL的注射器以吸取法獲取卵巢上直徑為3～6 mm卵泡中的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-Oocyte complexes，COCs)，經(jīng)洗卵液洗滌COCs 3遍，體視顯微鏡下挑選卵丘細(xì)胞2層以上、致密、胞質(zhì)均勻的COCs，移入覆蓋礦物油的50 μL TCM199卵母細(xì)胞體外成熟液，其中含有1 μg/mL促卵泡素(F2293，Sigma)和1 μg/mL促黃體素(L9773，Sigma)小滴中，置于39 ℃、5%CO2、95%空氣、100%相對濕度的CO2培養(yǎng)箱中體外培養(yǎng)22 h。

1.2 顯微注射SREBP1干擾片段和激動(dòng)劑

隨機(jī)選取體外成熟22 h的卵母細(xì)胞用0.1%透明質(zhì)酸酶脫除卵丘細(xì)胞，置于覆蓋礦物油50 μL培養(yǎng)液小滴中，采用OLYMPUS IX71倒置顯微鏡，配以Narishige MMO-202ND油壓三維微機(jī)械臂(Narishige)進(jìn)行顯微注射。將陰性片段、SREBP1干擾片段(SREBP1-Sus-756、SREBP1-Sus-837以及SREBP1-Sus-1104)分別顯微注射入卵母細(xì)胞質(zhì)中，分別為陰性對照組、SREBP1-Sus-756組、SREBP1-Sus-837組、SREBP1-Sus-1104組，未經(jīng)顯微注射的豬卵母細(xì)胞為對照組。各組注射量均為10-11L。

將不同濃度的SREBP1激動(dòng)劑(50、75、100、125、150和175 nmol/L)以及陰性片段分別顯微注射入卵母細(xì)胞質(zhì)中，分別為50、75、100、125、150和175 nmol/L組和陰性對照組，未經(jīng)顯微注射的豬卵母細(xì)胞為對照組。各組注射量均為10-11L。

將各組別卵母細(xì)胞移入覆蓋礦物油的50 μL TCM199豬卵母細(xì)胞成熟液(不含有促卵泡素和促黃體素)小滴中，在39 ℃、5%CO2、95%空氣、100%相對濕度的CO2培養(yǎng)箱中體外成熟至44 h，選擇卵周隙明顯、卵細(xì)胞膜完整、且排除第一極體的卵母細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)中所使用的SREBP1干擾片段及其陰性片段(表1)和激動(dòng)劑(ADV11-SREBF1Sus)以及陰性片段(ADMax-GFP-Negative control)由中國吉瑪公司構(gòu)建。

表1 SREBP1干擾片段序列Tab.1 SREBP1 interference fragment sequences

1.3 豬卵母細(xì)胞體外受精

將豬的細(xì)管冷凍精液(百鈞達(dá)公司)放在50 ℃水浴16 s解凍、加入10 mL精液稀釋液(百鈞達(dá)公司)后，以1 500 r/min離心5 min，棄上清液加入5 mL體外受精液混勻后，以1 500 r/min離心5 min，棄上清液加入5 mL獲能液混勻后，加入培養(yǎng)箱中獲能30 min。將獲能處理后的上游精液以l×106個(gè)/mL的終濃度，按試驗(yàn)組別分別置于每滴中含有10～15枚成熟卵母細(xì)胞的mTBM受精液中，受精6 h備用。

1.4 胚胎體外培養(yǎng)

將各組體外受精6 h的受精卵分別用添加0.4%牛血清白蛋白的NCSU-23胚胎培養(yǎng)液清洗3遍，分別移入39 ℃、5%CO2、95%空氣、100%相對濕度的CO2培養(yǎng)箱中平衡4 h的NCSU-23胚胎培養(yǎng)液清洗3遍的50 μL液滴中，每滴15枚左右，進(jìn)行體外培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)48、72、96、120和168 h觀察其2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑椹胚、囊胚率，間隔48 h換液。

1.5 數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件的單向方差分析和SNK多重比較法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和差異顯著性比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SREBP1干擾片段對豬卵母細(xì)胞體外成熟及其體外受精胚胎體外發(fā)育的影響

在豬卵母細(xì)胞體外成熟第一極體排出率和體外受精胚胎體外發(fā)育囊胚率上，SREBP1-Sus-756、SREBP1-Sus-1104、SREBP1-Sus-837組與對照組和陰性對照組之間均差異顯著(P<0.05)，對照組和陰性對照組之間差異顯著(P<0.05)；SREBP1-Sus-1104組與SREBP1-Sus-756組和SREBP1-Sus-837組之間差異顯著(P<0.05)，而SREBP1-Sus-756組和SREBP1-Sus-837組之間差異不顯著(P>0.05)，見表2和表3?？梢?，SREBP1-Sus-1104干擾片段對豬卵母細(xì)胞體外成熟及其體外受精胚胎體外發(fā)育的抑制效果均最好。

2.2 SREBP1激動(dòng)劑對豬卵母細(xì)胞體外成熟及其體外受精胚胎體外發(fā)育的影響

豬卵母細(xì)胞體外成熟第一極體排出率，125 nmol/LSREBP1激動(dòng)劑組顯著高于陰性對照組(P<0.05)；50、75、100和150 nmol/LSREBP1激動(dòng)劑組與陰性對照組之間差異不顯著(P>0.05)；175 nmol/LSREBP1激動(dòng)劑組顯著低于陰性對照組(P<0.05)，對照組與其他各組具有顯著差異(P<0.05)。125 nmol/LSREBP1激動(dòng)劑能夠顯著提高豬卵母細(xì)胞體外成熟效果，見表4。

表2 SREBP1干擾片段對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響Tab.2 Effects of SREBP1 interfering fragments on porcine oocytes in vitro maturation

注：同一列，不同字母之間表示差異顯著(P<0.05)，相同字母之間表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: The values denoted by different letters within the same column represent significant difference at 0.05 level (P<0.05), the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

注：同一列，不同字母之間表示差異顯著(P<0.05)，相同字母之間表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: The values denoted bydifferent letters within the same column represent significant difference at 0.05 level (P<0.05), the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

豬體外受精胚胎體外發(fā)育囊胚率，75、100和125 nmol/LSREBP1激動(dòng)劑組顯著高于陰性對照組(P<0.05)，其中125 nmol/LSREBP1激動(dòng)劑組顯著高于75和100 nmol/L激動(dòng)劑組(P<0.05)，而二者之間差異不顯著(P>0.05)；50和150 nmol/LSREBP1激動(dòng)劑組與陰性對照組之間差異不顯著(P>0.05)；175 nmol/LSREBP1激動(dòng)劑組顯著低于陰性對照組(P<0.05)，對照組與其他各組具有顯著差異(P<0.05)。125 nmol/LSREBP1激動(dòng)劑能夠顯著促進(jìn)豬體外受精胚胎體外發(fā)育，見表5。

表4 不同濃度SREBP1激動(dòng)劑對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響Tab.4 Effects of different concentrations of SREBP1 agonists on porcine oocytes in vitro maturation

注：同一列，不同字母之間表示差異顯著(P<0.05)，相同字母之間表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: The values denoted by different letters within the same column represent significant difference at 0.05 level (P<0.05), the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

表5 不同濃度SREBP1激動(dòng)劑對豬體外受精胚胎體外發(fā)育的影響Tab.5 Effects of different concentrations of SREBP1 agonists on porcine oocytes in vitro fertilized embryo development

注：同一列，不同字母之間表示差異顯著(P<0.05)，相同字母之間表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: The values denoted by different letters within the same column represent significant difference at 0.05 level (P<0.05), the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

3 討 論

本研究中，在豬卵母細(xì)胞成熟過程中干擾SREBP1的作用，顯著降低了卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精胚胎體外發(fā)育。這可能是由于卵母細(xì)胞在體外成熟過程中脂質(zhì)難以合成，無法滿足卵母細(xì)胞成熟過程中的物質(zhì)和能量所需。在人肺癌細(xì)胞系中干擾B7-H3的表達(dá)，SREBP1的表達(dá)水平顯著下降，細(xì)胞中脂質(zhì)和甘油三酯含量顯著下降，其脂質(zhì)合成能力顯著降低[7]。反式-10，順式-12共軛亞油酸通過下調(diào)SREBP1的表達(dá)水平，從而抑制山羊乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸合成[8]。另外，有研究表明SREBP1對人胚胎腎細(xì)胞293的有絲分裂過程具有調(diào)控作用[9]。

然而本研究中，在豬卵母細(xì)胞成熟過程中適量的激動(dòng)SREBP1，有利于卵母細(xì)胞體外成熟和IVF胚胎體外發(fā)育。有研究表明，10-9mol/L褪黑素可以通過調(diào)控SREBP1等基因表達(dá)使在體外成熟的豬卵母細(xì)胞中脂肪酸的含量顯著提高，有利于豬卵母細(xì)胞的體外發(fā)育。T0901317(肝X受體激動(dòng)劑)通過激活SREBP1的表達(dá)，增加了牛乳腺細(xì)胞中一些不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的含量[10]。在牛乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)SREBP1，激活了脂肪酸合成酶基因的表達(dá)，有利于細(xì)胞中脂滴的生成[11]。本研究表明過高的SREBP1激動(dòng)劑濃度對豬卵母細(xì)胞體外成熟和IVF胚胎體外發(fā)育有一定的阻滯作用，這可能是因?yàn)樵诼涯讣?xì)胞中會(huì)導(dǎo)致大量的脂質(zhì)堆積。Hiraga研究也表明豬卵母細(xì)胞中脂滴含量高則降低體外受精囊胚發(fā)育率[12]。有關(guān)SREBP1對豬卵母細(xì)胞體外成熟及體外受精胚胎體外發(fā)育的作用機(jī)制是下一步進(jìn)行的研究內(nèi)容。

4 結(jié) 論

SREBP1干擾片段對豬卵母細(xì)胞體外成熟及體外受精胚胎的發(fā)育效果有抑制作用，其中SREBP1-Sus-1104干擾片段的作用最強(qiáng)。125 nmol/LSREBP1激動(dòng)劑對豬卵母細(xì)胞體外成熟及體外受精胚胎的發(fā)育效果有顯著促進(jìn)作用。