基于非揮發(fā)性有機(jī)酸的濃香型配打模塊煙葉評(píng)價(jià)指標(biāo)

彭桂新，楊永鋒，胡靜宜，王寶林，劉向真，劉茂林，牛洋洋，方蔣平，姚旭博，陳紅麗*

1. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)第三大街8 號(hào) 450000

2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市金水區(qū)農(nóng)業(yè)路63 號(hào) 450002

3. 江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，南京市建鄴區(qū)興隆大街29 號(hào) 210000

煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)生態(tài)環(huán)境條件的變化極為敏感［1-2］。生態(tài)因素、栽培因素和遺傳因素共同決定了煙葉質(zhì)量的形成。其中，生態(tài)因素決定了煙葉的香型風(fēng)格特征［3］。由于中國(guó)煙葉種植區(qū)域生態(tài)環(huán)境的差異，我國(guó)煙葉形成了不同的香型風(fēng)格［4］。煙葉香型是煙葉質(zhì)量和使用的重要依據(jù)和主要指標(biāo)［5］。我國(guó)根據(jù)煙葉的香型特征，主要分3 個(gè)香型即濃香型、中間香型和清香型烤煙。其中，濃香型烤煙以河南煙區(qū)、湖南煙區(qū)為代表，中間香型煙葉以貴州煙區(qū)、黑龍江煙區(qū)為代表，清香型煙葉以云南煙區(qū)、四川煙區(qū)為代表［6-7］。有機(jī)酸廣泛存在于煙草中，是煙草生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的三羧酸循環(huán)產(chǎn)物，煙葉中的有機(jī)酸主要以非揮發(fā)性有機(jī)酸的形式存在，對(duì)煙草的生理代謝起著重要的作用［8-13］。煙草中的非揮發(fā)性有機(jī)酸雖然不能直接作用于煙葉的風(fēng)味，但能與煙葉中的生物堿結(jié)合生成鹽，從而調(diào)節(jié)游離煙堿的含量、使煙氣的酸堿度得到平衡、煙氣醇和，是影響煙草感官質(zhì)量的主要物質(zhì)之一［14-18］。已有研究表明，煙葉中的非揮發(fā)性有機(jī)酸主要影響煙葉感官質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)中的刺激性、濃度和勁頭［19-20］。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)通過(guò)因子分析、判別分析和模糊數(shù)學(xué)理論等方法對(duì)煙葉質(zhì)量與生態(tài)環(huán)境、煙葉產(chǎn)區(qū)關(guān)系的研究日益增多［21-23］。但是上述分析方法識(shí)別率低，不能很好地建立煙葉特征識(shí)別模型［24-26］。正交偏最小二乘判別（OPLS-DA 分析）可以用于確定不同類(lèi)別分界面的最優(yōu)位置，能夠提高模型的預(yù)測(cè)效果，解釋造成模式之間差異的根本原因，而且降低了對(duì)樣本量的較高要求［27-29］。前人的研究多集中在不同香型單等級(jí)煙葉常規(guī)化學(xué)成分差異以及多酚類(lèi)物質(zhì)差異的比較，但是常規(guī)化學(xué)成分在不同香型間存在較多交叉，多酚類(lèi)物質(zhì)含量受海拔等因素影響較明顯，且實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜，檢測(cè)指標(biāo)過(guò)多，檢測(cè)過(guò)程較繁瑣。能夠準(zhǔn)確快捷、操作簡(jiǎn)便地區(qū)分濃香型多等級(jí)混合配打模塊煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸含量的研究方法較少。

因此，以我國(guó)3 個(gè)香型8 個(gè)產(chǎn)區(qū)的33 個(gè)多等級(jí)配打模塊煙葉為研究對(duì)象，基于正交偏最小二乘法判別分析，探索不同香型模塊煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸含量的差異，并進(jìn)行解釋和分析，以期為濃香型模塊煙葉風(fēng)格定位和煙葉質(zhì)量評(píng)價(jià)分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

選取2019 年來(lái)源于不同產(chǎn)區(qū)、不同香型的33個(gè)多等級(jí)配打模塊煙葉樣品，其中清香型模塊9個(gè)，分別產(chǎn)自典型清香型產(chǎn)區(qū)四川、云南、福建3個(gè)省份；濃香型模塊17 個(gè)，分別產(chǎn)自典型濃香型產(chǎn)區(qū)湖南、河南2 個(gè)省份；中間香型模塊8 個(gè)，分別產(chǎn)自典型中間香型產(chǎn)區(qū)黑龍江、貴州、重慶3 個(gè)省份。所有樣品均為多等級(jí)混合打葉后的片煙，經(jīng)河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心收集后，統(tǒng)一復(fù)烤后制成。具體產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

濃硫酸、甲醇、二氯甲烷（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；己二酸（內(nèi)標(biāo)）、草酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、油酸甲酯、硬脂酸甲酯（色譜純，美國(guó)百靈威公司）。

Agilent 6890 型氣相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）。DHG-9145A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）。標(biāo)準(zhǔn)篩（浙江省上虞市五四儀器篩具廠）。

表1 33 份樣品的產(chǎn)地信息Tab.1 Producing area information of 33 samples

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

樣品置于40 ℃烘箱2 h。烘干后混合均勻，用四分法取一部分樣品磨成粉末過(guò)60 目（孔徑：250 μm）篩，進(jìn)行非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定。

1.2.2 非揮發(fā)性有機(jī)酸含量的測(cè)定

非揮發(fā)性有機(jī)酸含量按照文獻(xiàn)［18］的方法采用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

1.2.3.1 描述統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用DPS7.05 軟件。各成分所對(duì)應(yīng)的字母代號(hào)分別為：草酸（X1）、丙二酸（X2）、α-戊酮酸（X3）、富馬酸（X4）、丁二酸（X5）、蘋(píng)果酸（X6）、2,4-庚二烯酸（X7）、檸檬酸（X8）、十六酸（X9）、亞油酸（X10）、油酸（X11）、十八酸（X12）、非揮發(fā)性有機(jī)酸總量（X13）。

1.2.3.2 正交偏最小二乘法判別分析

正交偏最小二乘法判別分析是基于變量X 構(gòu)建變量Y 的預(yù)測(cè)模型。本試驗(yàn)中，非揮發(fā)性有機(jī)酸各指標(biāo)為變量X，煙葉的不同香型為變量Y。使用SIMCA-P14.1 軟件對(duì)分類(lèi)后的樣品非揮發(fā)性有機(jī)酸含量進(jìn)行OPLS-DA 分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸的統(tǒng)計(jì)描述

煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸的描述統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。由表2 可以看出，α-戊酮酸（X3）、2,4-庚二烯酸（X7）、檸檬酸（X8）的偏度稍大，其余指標(biāo)的偏度均較小，基本符合正態(tài)分布特征。α-戊酮酸、2,4-庚二烯酸和檸檬酸向右偏離中心稍遠(yuǎn)（偏度值＞1）。按照變異系數(shù)劃分等級(jí)，丁二酸（X5）為弱變異性（變異系數(shù)≤10%），其余各指標(biāo)均為中等變異性（變異系數(shù)在10%～100%）。

表2 煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸的描述性統(tǒng)計(jì)分析Tab.2 Descriptive statistical analysis of non-volatile organic acids in tobacco leaves

2.2 不同香型配打模塊煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸含量差異顯著性分析

對(duì)3 個(gè)香型配打模塊煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸的13 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可以看出，①草酸（X1）含量在不同香型配打模塊煙葉間存在顯著差異，清香型模塊煙葉草酸含量顯著低于濃香型模塊和中間香型模塊煙葉。②丁二酸（X5）含量在不同香型模塊煙葉間存在極顯著差異，中間香型模塊煙葉丁二酸含量顯著低于清香型模塊和濃香型模塊煙葉。③丙二酸（X2）、蘋(píng)果酸（X6）、檸檬酸（X8）和亞油酸（X10）含量在不同香型模塊煙葉間存在極顯著差異，濃香型模塊煙葉丙二酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸和亞油酸含量顯著高于清香型模塊和中間香型模塊煙葉。④α-戊酮酸（X3）、富馬酸（X4）、2,4-庚二烯酸（X7）、十六酸（X9）、油酸（X11）和十八酸（X12）的含量在不同香型模塊煙葉間無(wú)顯著性差異。非揮發(fā)性有機(jī)酸總量（X13）以濃香型模塊煙葉最高，且與清香型模塊和中間香型模塊煙葉的差異達(dá)到極顯著水平。綜上所述，3 個(gè)香型配打模塊煙葉在多個(gè)非揮發(fā)性有機(jī)酸指標(biāo)上存在顯著差異，這種差異可以用來(lái)區(qū)分配打模塊煙葉風(fēng)格特征。

表3 不同香型模塊煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸含量差異顯著性分析①Tab.3 Significant difference analysis of non-volatile organic acid content in tobacco leaves in modules with different flavor styles

2.3 不同香型配打模塊煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸OPLS-DA 模型

對(duì)不同香型模塊的煙葉樣品非揮發(fā)性有機(jī)酸含量建立OPLS-DA 模型，篩選出了2 個(gè)預(yù)測(cè)主成分和3 個(gè)正交主成分。其中，R2X=0.77，表示5 個(gè)主成分對(duì)X 變量變異的解釋能力為77%；R2Y=0.774，表示2 個(gè)預(yù)測(cè)主成分對(duì)Y 變量變異的解釋能力為77.4%；Q2=0.627，表示2 個(gè)預(yù)測(cè)主成分對(duì)不同香型配打模塊煙葉樣品的預(yù)測(cè)能力為62.7%。一般來(lái)說(shuō)，R2和Q2＞0.5 時(shí)，該模型的預(yù)測(cè)能力較好且模型較穩(wěn)定。采用置換檢驗(yàn)對(duì)模型的可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)驗(yàn)證圖可以看出，位于左側(cè)的置換檢驗(yàn)隨機(jī)模型的Q2值均小于位于右側(cè)原模型的Q2值，模型結(jié)果參數(shù)Q2的回歸線與縱軸的截距為-0.474，小于0，表明模型較可靠，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象?？偟膩?lái)說(shuō)，模型的模擬效果較好。

圖1 OPLS-DA 模型置換檢驗(yàn)示意圖Fig.1 Schematic diagram of permutation test of OPLS-DA model

圖2 為基于非揮發(fā)性有機(jī)酸12 個(gè)指標(biāo)的3 個(gè)香型配打模塊煙葉33 個(gè)樣品OPLS-DA 模型第1、2主成分得分圖。由圖2 可以看出，不同香型配打模塊煙葉有明顯聚集的趨勢(shì)，不同香型配打模塊煙葉可明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)，其中橫坐標(biāo)為第一主成分得分，表明通過(guò)第一主成分可將濃香型模塊煙葉同清香型模塊和中間香型模塊煙葉區(qū)分開(kāi)；縱坐標(biāo)為第二主成分得分，表明通過(guò)第二主成分可將清香型模塊和中間香型模塊煙葉區(qū)分開(kāi)。本試驗(yàn)中，構(gòu)建的OPLS-DA 模型能夠較好地將3 個(gè)香型模塊煙葉區(qū)分開(kāi)，模型的模擬效果較好。

圖2 OPLS-DA 模型得分圖Fig.2 Score of OPLS-DA model

2.4 不同香型配打模塊煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸分類(lèi)指標(biāo)篩選

圖3 為OPLS-DA 模型中非揮發(fā)性有機(jī)酸各指標(biāo) 的VIP（Variable Importance for the Projection）圖。VIP 值越大，說(shuō)明與香型差異的相關(guān)性越高，對(duì)解釋變量的貢獻(xiàn)率越大。圖4 為OPLS-DA 模型第一主成分、第二主成分載荷圖，表示了兩個(gè)主成分非揮發(fā)性有機(jī)酸指標(biāo)和不同香型配打模塊煙葉的相關(guān)性，圖中非揮發(fā)性有機(jī)酸指標(biāo)與香型的距離越小，說(shuō)明該指標(biāo)對(duì)這個(gè)香型的相關(guān)性越高，影響越大。

圖3 OPLS-DA 模型VIP 值Fig.3 VIP values of OPLS-DA model

圖4 OPLS-DA 模型主成分載荷圖Fig.4 Principal component load diagram of OPLS-DA model

由圖3 可以看出，有6 個(gè)非揮發(fā)性有機(jī)酸指標(biāo)對(duì)變量解釋的貢獻(xiàn)率較大（VIP＞1），按照貢獻(xiàn)率由大到小的順序排列分別為丁二酸（X5）、檸檬酸（X8）、蘋(píng)果酸（X6）、丙二酸（X2）、亞油酸（X10）和草酸（X1）。由圖4 可以看出，6 個(gè)對(duì)解釋變量貢獻(xiàn)率較大的指標(biāo)丁二酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、亞油酸和草酸均與濃香型較靠近，與清香型和中間香型相對(duì)較遠(yuǎn)，說(shuō)明丁二酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、亞油酸和草酸6 個(gè)指標(biāo)與濃香型模塊煙葉的相關(guān)性較高，與清香型模塊和中間香型模塊煙葉相關(guān)性相對(duì)較低，非揮發(fā)性有機(jī)酸對(duì)濃香型模塊煙葉的影響高于清香型模塊和中間香型模塊煙葉。因此，非揮發(fā)性有機(jī)酸可作為濃香型模塊煙葉區(qū)別于清香型模塊和中間香型模塊煙葉的主要化學(xué)成分。按照6 個(gè)指標(biāo)與濃香型模塊煙葉的距離由小到大排列，檸檬酸與濃香型距離最小，說(shuō)明檸檬酸對(duì)濃香型模塊煙葉的相關(guān)性最高，其次是丙二酸、蘋(píng)果酸，6 個(gè)對(duì)解釋變量貢獻(xiàn)較大的指標(biāo)中，草酸與濃香型模塊煙葉的相關(guān)性相對(duì)較小。由表3 可以看出，經(jīng)過(guò)OPLS-DA 模型篩選出來(lái)的與濃香型相關(guān)性較高的6 個(gè)指標(biāo)在不同香型間均存在顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以作為濃香型特征非揮發(fā)性有機(jī)酸指標(biāo)。

3 結(jié)論

（1）不同香型模塊烤煙非揮發(fā)性有機(jī)酸含量存在顯著性差異。其中，濃香型模塊煙葉草酸含量顯著高于清香型模塊煙葉；濃香型模塊煙葉丙二酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸和亞油酸的含量高于清香型模塊和中間香型模塊煙葉；濃香型模塊煙葉丁二酸含量顯著高于中間香型模塊煙葉；濃香型模塊煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸總量顯著高于清香型模塊和中間香型模塊煙葉。

（2）基于非揮發(fā)性有機(jī)酸建立的OPLS-DA 模型模擬效果較好，模型參數(shù)R2X、R2Y 和Q2分別為0.770、0.774 和0.627。

（3）通過(guò)模型得到的2 個(gè)主成分得分可較好地區(qū)分不同香型配打模塊的煙葉。通過(guò)第一主成分可將濃香型模塊煙葉同清香型模塊和中間香型模塊煙葉區(qū)分開(kāi)；通過(guò)第二主成分可將清香型模塊和中間香型模塊煙葉區(qū)分開(kāi)。

（4）通過(guò)模型篩選出VIP 值大于1 的6 個(gè)非揮發(fā)性有機(jī)酸指標(biāo)（丁二酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、亞油酸、草酸）與濃香型模塊煙葉的相關(guān)性較大，6 個(gè)指標(biāo)可作為濃香型模塊煙葉的特征指標(biāo)；影響濃香型模塊煙葉的最主要指標(biāo)依次為檸檬酸、丙二酸、蘋(píng)果酸、亞油酸、丁二酸和草酸。