劉閏 周暄 邢帥
摘要:對百日上的白粉菌進行分子生物學分析,采用試劑盒法提取病原菌總基因組DNA,PCR擴增其rDNA內(nèi)轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,簡稱ITS)的保守序列并測序,并通過Clustal與MEAG軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹推演系統(tǒng)進化關系,在分子水平鑒定該菌種并比較與其他白粉菌菌種的親緣關系。結果表明,本研究測序的百日菊白粉菌BC180623的ITS序列與發(fā)生在土耳其菊芋上的Erysiphe cichoracearum(KF453969.1)相似度達到99%,與其具有比較近的親緣關系。以百日菊白粉菌為研究對象,在分子水平鑒定該菌種并分析其進化親緣關系為本試驗的創(chuàng)新之處。
關鍵詞:百日菊;白粉菌;內(nèi)轉錄間隔區(qū);序列分析
中圖分類號:S435.672? 文獻標志碼: A? 文章編號:1002-1302(2020)06-0098-06
百日菊(Zinnia elegans Jacq.)別稱百日草,為中藥材,以全草入藥。百日菊也是一年生草花主栽品種之一,其色彩豐富,花大、艷麗,花期長達百日,故得百日菊之美名。白粉病是百日菊常見的最重要病害之一,在生長區(qū)幾乎每年都普遍發(fā)生[1-3]。百日菊被白粉菌侵染后,最初葉片出現(xiàn)白色粉狀斑點,后病斑擴大或相連成片,發(fā)病后期葉面布滿白色粉層,葉片變褐,嚴重影響觀賞價值,甚至導致植株成片死亡。發(fā)病后期在發(fā)病部位形成的小黑點即為病菌的閉囊殼。據(jù)以前的研究報道有2個屬的白粉菌引起百日菊的白粉病,分別是白粉菌屬(Erysiphe)和單絲殼屬(Sphaerotheca),屬于子囊菌門(Ascomycota)白粉菌目(Erysiphales),白粉菌科(Erysiphaceae)[4-7]。
白粉菌傳統(tǒng)的鑒定以其形態(tài)學為主要特征,如有性世代閉囊殼內(nèi)子囊的個數(shù)及子囊孢子的數(shù)目,閉囊殼外附屬絲的特征等,但傳統(tǒng)的分類特征有諸多不足之處[8-11]。近年來,分子生物學在植物病害鑒定上的應用越來越廣泛,特別是植物病原菌在rDNA的內(nèi)轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,簡稱ITS)既具有保守性,又在科、屬、種水平上均有特異性序列的特點,通過特異性引物對ITS區(qū)段進行PCR擴增,可用于快速鑒定、檢測植物病原菌以及病害的診斷等[12-13]。目前國內(nèi)關于百日菊白粉病病原菌分子分類系統(tǒng)的研究未見報道,通過提取百日菊白粉菌總基因組DNA,利用分子生物學技術對其分類特征及進化關系進行研究,可為該花卉白粉病的準確調查提供有效和實用的手段。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
白粉菌樣本于2017年8月12日采自黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學城市實驗林場,樣品編號為BC180623,寄主植物為百日菊。提取白粉菌基因組DNA的試劑盒購自盛澤生物試劑有限公司(目錄號:DP321)。
1.2 試驗方法
1.2.1 樣品白粉菌的收集 刀片輕輕刮下葉片表面的菌絲與閉囊殼混合物,放入2 mL離心管中,置于-4 ℃冰箱中保存。
1.2.2 基因組DNA的提取 采用試劑盒法提取百日菊白粉菌基因組DNA:(1)取適量白粉菌菌絲放入研缽中,加入液氮充分研磨;(2)加入400 μL緩沖液FP1和6 μLRNaseA(10 mg/mL),渦旋振蕩 1 min,室溫放置10 min;(3)加入130 μL緩沖液FP2,充分混勻,渦旋振蕩1 min,12 000 r/min離心 5 min,將上清液轉移至新的離心管中,重復這一步驟;(4)向上清液中加入0.7倍體積的異丙醇,充分混勻,此時出現(xiàn)絮狀基因組DNA,離心2 min,棄上清,保留沉淀;(5)加入700 μL 70%乙醇,渦旋振蕩5 s,12 000 r/min離心2 min,棄上清,重復這一步驟;(6)開蓋倒置,室溫晾干10 min,徹底晾干殘余的乙醇;(7)加入適量洗脫緩沖液TE,65 ℃水浴 10~60 min溶解DNA,期間顛倒混勻數(shù)次助溶,最終得到DNA溶液。用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測得到的DNA溶液。
1.2.3 ITS序列PCR擴增 PCR反應的引物采用通用引物ITS1、ITS4[1,13],PCR反應所用的試劑是PCR Mix。25 μL的反應體系如下:模板DNA 1 μL;PCR Mix 12 μL;ddH2O 10 μL;P1和P2分別為 1 μL。PCR擴增條件:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30次循環(huán);72 ℃最終延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,EB染色觀察,檢測合格樣品進行序列測定與分析。
1.2.5 序列分析 將所得DNA序列輸入GenBank進行BLAST比對檢索,從NCBI數(shù)據(jù)庫中調取22種白粉菌ITS保守序列,采用Clustalx1.83將測序白粉菌(BC180623)結果與不同白粉菌的ITS序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹,推演系統(tǒng)進化關系。
2 結果與分析
2.1 基因組DNA提取與PCR擴增的結果
ITS通用引物擴增獲得的目的片段用膠回收試劑盒回收并純化,對所得結果進行電泳檢測(圖1),PCR擴增產(chǎn)物在回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序獲得長度為603 bp的堿基序列,結果如下:2.3 百日菊白粉菌ITS序列進化樹構建結果與分析
獲得的序列用NCBI的BLAST進行序列搜索,從GenBank中選取部分植物白粉菌ITS序列與本試驗測序結果進行比較分析(表1)。對表1白粉菌的ITS序列對比分析結果見圖2。
由圖2可知,樣品百日菌白粉菌BC180623的ITS序列與KF453969.1的ITS序列最為接近,相似度達到99%。兩者序列差異性主要體現(xiàn)在第2、4、19、560、581、585位堿基上。說明樣品百日菊白粉菌與KF453969.1具有較近的親緣關系。此外,23種白粉菌ITS序列219 ~374 bp之間保留著較高的一致性,因此,這些區(qū)段有可能起到了保障白粉菌性狀穩(wěn)定遺傳的功能。