釉基質(zhì)蛋白衍生物對(duì)人牙周膜干細(xì)胞分化、增殖的影響觀察

張帆　任偉偉

【摘要】 目的 分析研究釉基質(zhì)蛋白衍生物對(duì)人牙周膜干細(xì)胞分化及其增殖的影響。方法 3例健康的因正畸原因拔除前磨牙及2例埋伏第三恒牙患者， 對(duì)人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)， 檢驗(yàn)分析表面抗原表達(dá)及其克隆形成率， 對(duì)其多向分化潛能進(jìn)行鑒定， 分析在牙周膜干細(xì)胞上進(jìn)行不同質(zhì)量濃度的釉基質(zhì)衍生物培養(yǎng)2周和4周， 依據(jù) Von Kosas和Trichrome 染色法對(duì)牙周膜干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成和膠原合成情況進(jìn)行分析， 依據(jù)Real time 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） 法對(duì)成骨分化相關(guān)基因Ⅰ型膠原、RUX2及其骨鈣素表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)， 分析在牙周膜干細(xì)胞增殖情況檢測(cè)中3-（4， 5-二甲基噻唑-2）-2， 5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT） 法與生長(zhǎng)率法的作用。結(jié)果 相比牙周膜細(xì)胞克隆形成率0.42%、STRO-1-細(xì)胞克隆形成率0.21%， STRO-1+細(xì)胞（牙周膜干細(xì)胞）克隆形成率1.42%更高。表面抗原CD105表達(dá)率99.8%、CD29表達(dá)率99.7%、CD45表達(dá)率1.26%、CD44表達(dá)率98.8%。結(jié)論 釉基質(zhì)衍生物在試驗(yàn)中顯示為一定時(shí)間劑量效應(yīng)關(guān)系， 利于牙周膜干細(xì)胞膠原合成， 形成礦化結(jié)節(jié)， 促使有效表達(dá)骨分化相關(guān)基因Ⅰ型膠原、RUX2及其骨鈣素， 對(duì)于牙周膜干細(xì)胞增殖十分有利， 具有再生和修復(fù)牙周組織的臨床作用。

【關(guān)鍵詞】 釉基質(zhì)蛋白衍生物;人牙周膜干細(xì)胞;分化;增殖

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.11.086

牙周膜干細(xì)胞實(shí)際上是在牙周膜內(nèi)存在的成體干細(xì)胞， 存在牙周再生能力和多向分化潛力， 在牙周組織中釉基質(zhì)衍生物能夠再生， 可對(duì)細(xì)胞增殖、定向分化作用進(jìn)行刺激[1]。釉基質(zhì)衍生物實(shí)際上是取自于發(fā)育期牙釉組織的一種物質(zhì)， 釉質(zhì)蛋白為主要成分， 雖然釉基質(zhì)衍生物可對(duì)牙槽骨修復(fù)具有一定促進(jìn)作用， 但還是存在不明確的機(jī)制。本文闡述了2018年1月～2019年1月3例健康的因正畸原因拔除的前磨牙及其2例埋伏第三恒牙的實(shí)驗(yàn)效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 本文選取2018年1月～2019年1月3例健康的因正畸原因拔除前磨牙及2例埋伏第三恒牙患者作為研究對(duì)象， 患者及其家屬表示對(duì)醫(yī)院給出的知情同意書(shū)簽字認(rèn)可， 移交醫(yī)學(xué)倫理會(huì)得到批準(zhǔn)。

1. 2 方法

1. 2. 1 牙周膜細(xì)胞分離培養(yǎng) 基于無(wú)菌環(huán)境下將離體牙牙根中1/3位置牙周膜進(jìn)行小心分離， 在37℃下使用4 g/L胰蛋白酶和3 g/LⅠ型膠原酶進(jìn)行1 h消化， 在10 cm培養(yǎng)皿上接種， 加入DMEM培養(yǎng)基， 主要涵蓋10%胎牛血清、100 g/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素G， 基于37℃在5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1. 2. 2 FACS分選 經(jīng)5～7 d培養(yǎng)上述牙周膜細(xì)胞后， 通過(guò)Tryple E消化細(xì)胞， 在blocking buffer中重懸細(xì)胞， 放置在0℃環(huán)境內(nèi)20 min， 使用2 mg/L、STRO-1免疫球蛋白M（IgM）抗體進(jìn)行1 h孵育;通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)STRO-1+細(xì)胞進(jìn)行分選， 實(shí)施細(xì)胞傳代培養(yǎng)， 使用第2代或3代細(xì)胞展開(kāi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1. 2. 3 克隆形成率測(cè)定 在5 cm培養(yǎng)皿中接種400個(gè)牙周膜細(xì)胞、400個(gè)STRO-1-細(xì)胞、400個(gè)STRO-1+細(xì)胞， 在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液中進(jìn)行14 d的培養(yǎng)， 使用10%甲醛溶液固定后1% violet blue染色。1個(gè)克隆即為>50個(gè)細(xì)胞聚成的細(xì)胞集落?？寺⌒纬陕?每個(gè)培養(yǎng)皿中的克隆數(shù)/植入細(xì)胞數(shù)。

1. 2. 4 流式細(xì)胞儀表面抗原檢測(cè) 用Tryple E 消化第3代牙周膜干細(xì)胞后， 在 blocking buffer 中重懸細(xì)胞， 放置在0℃環(huán)境內(nèi)20 min， 實(shí)施EP管分裝處理， 每管100 μl， 分別將CD105、CD44、CD34、CD45抗體加入1 μl進(jìn)行1 h孵育， 重懸后將二抗加入再次控模型重懸， 通過(guò)流式細(xì)胞儀實(shí)施相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1. 2. 5 多向分化能力檢測(cè) 以5×107個(gè)/L細(xì)胞濃度將第2代牙周膜干細(xì)胞加入24孔板內(nèi)進(jìn)行24 h孵育， 更換培養(yǎng)液為成骨誘導(dǎo)液、成軟骨誘導(dǎo)液、成脂誘導(dǎo)液， 間隔3 d更換1次， 21 d后采用von kosa染色法對(duì)成骨誘導(dǎo)組培養(yǎng)板內(nèi)礦化結(jié)節(jié)形成狀態(tài)進(jìn)行觀察， 使用番紅O染色法對(duì)軟骨形成狀態(tài)進(jìn)行觀察， 使用油紅O染色法對(duì)脂滴形成狀態(tài)進(jìn)行觀察。

1. 2. 6 成骨分化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 分組培養(yǎng)第3代牙周膜干細(xì)胞， 將不同質(zhì)量濃度的釉基質(zhì)衍生物加入到相同的培養(yǎng)液中， 分別為20 mg/L釉基質(zhì)衍生物、50 mg/L釉基質(zhì)衍生物、100 mg/L釉基質(zhì)衍生物， 放置到37℃環(huán)境下， 在5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行2周及4周的培養(yǎng)。通過(guò)Trichrome染色法對(duì)膠原合成情況進(jìn)行檢測(cè)：依據(jù)試劑相關(guān)說(shuō)明書(shū)實(shí)施操作， 以10%甲醛溶液固定細(xì)胞后， 將Bouin's溶液加入后放置于56 ℃環(huán)境下1 h， 將Weigert鐵蘇木精染液放入10 min， 之后進(jìn)行清洗， 加入比布列西酸性品紅液大約10～15 min后， 再加入苯胺藍(lán)溶液， 大約10 min后使用1%乙酸進(jìn)行5 min清洗， 脫水后進(jìn)行鏡下觀察。通過(guò)Von Kosas 染色法對(duì)礦化結(jié)節(jié)形成狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)， 依據(jù)VonKosas染色法能夠把礦化結(jié)節(jié)染成黑色， 在對(duì)細(xì)胞爬片固定且PBS洗滌后， 置入到5%硝酸銀水溶液內(nèi)10 min， 并且在日光下進(jìn)行20 min曝曬后通過(guò)蒸餾水進(jìn)行洗滌， 同時(shí)進(jìn)行乙醇系列脫水， 二甲苯顯示為透明。通過(guò)RT-PCR法對(duì)成骨相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)， 進(jìn)行2周及4周培養(yǎng)過(guò)程中收集細(xì)胞， 依據(jù)TRIzol法對(duì)總RNA進(jìn)行抽提， 實(shí)施反轉(zhuǎn)錄后形成cDNA， 并且將其當(dāng)做模板， 通過(guò)目標(biāo)基因的引物開(kāi)展Real time RT-PCR， 對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)MTT法對(duì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測(cè)， 以每孔4×104個(gè)的濃度將第3代牙周膜干細(xì)胞種入到96孔板， 將不同濃度的釉基質(zhì)衍生物加入進(jìn)行48 h孵育， 以含5 g/L MTT PBS取代培養(yǎng)液， 基于37℃環(huán)境下使用5% CO2進(jìn)行48 h孵育， 讀取570 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。細(xì)胞生長(zhǎng)率：以每孔5 000個(gè)的密度種將第3代牙周膜干細(xì)胞置入到12孔培養(yǎng)板上進(jìn)行24 h培養(yǎng)， 在無(wú)血清DMEM中進(jìn)行24 h再培養(yǎng)， 在存在100 mg/L釉基質(zhì)衍生物的培養(yǎng)基中進(jìn)行2 d與4 d的再培養(yǎng)， 分析消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)情況。

2 結(jié)果

2. 1 克隆形成率、細(xì)胞形態(tài)學(xué) 試驗(yàn)研究顯示， 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低密度接種后， 基于光鏡下進(jìn)行觀察顯示出克隆樣生長(zhǎng)。經(jīng)14 d培養(yǎng)后， 相比牙周膜細(xì)胞克隆形成率0.42%、STRO-1-細(xì)胞克隆形成率0.21%， STRO-1+細(xì)胞（牙周膜干細(xì)胞）克隆形成率1.42%更高。

2. 2 牙周膜干細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況 CD105表達(dá)率99.8%、CD29表達(dá)率99.7%、CD44表達(dá)率98.8%、CD45表達(dá)率1.26%， 證實(shí)， 牙周膜干細(xì)胞屬于間充質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞。

2. 3 牙周膜干細(xì)胞多向分化能力情況 誘導(dǎo)分化牙周膜干細(xì)胞成骨后， 經(jīng)Von Kosa染色處理顯示礦化結(jié)節(jié);經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后， 油紅O染色顯示脂滴;經(jīng)過(guò)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后番紅花精O染色顯示為陽(yáng)性， 表示牙周膜干細(xì)胞存在多向分化潛能。

2. 4 釉基質(zhì)衍生物對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化影響作用 膠原合成能力：通過(guò)Trichrome染色法對(duì)不同質(zhì)量濃度的釉基質(zhì)衍生物進(jìn)行檢驗(yàn)， 分別是0、20、50、100 mg/L， 試驗(yàn)研究顯示， 釉基質(zhì)衍生物可對(duì)牙周膜干細(xì)胞膠原合成進(jìn)行促進(jìn)， 且顯示為劑量效應(yīng)關(guān)系;100 mg/L劑量具有最強(qiáng)的牙周膜干細(xì)胞分化促進(jìn)作用。隨著試驗(yàn)時(shí)間的增加延長(zhǎng)， 釉基質(zhì)衍生物不斷增加促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞膠原合成的臨床作用， 證實(shí)上述操作存在時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

礦化能力：在牙周膜干細(xì)胞上以0、100 mg/L釉基質(zhì)衍生物進(jìn)行2、4周作用， 隨著時(shí)間的增加， 可顯著提升釉基質(zhì)衍生物對(duì)于牙周膜干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的促進(jìn)作用。

成骨相關(guān)基因表達(dá)：在牙周膜干細(xì)胞上以0、100 mg/L釉基質(zhì)衍生物進(jìn)行2、4周作用， 通過(guò)Real time RT-PCR法對(duì)成骨基因Ⅰ型膠原、Runχ2表達(dá)及其骨鈣素進(jìn)行表示， Runχ2表達(dá)：2周0 mg/L為1.53、100 mg/L為8.69， 4周0 mg/L為1.55、100 mg/L為6.58;Ⅰ型膠原表達(dá)：2周0 mg/L為1.11、100 mg/L為3.53， 4周0 mg/L為1.32、100 mg/L為6.53;骨鈣素：2周0 mg/L為1.66、100 mg/L為5.39， 4周0 mg/L為1.68、100 mg/L為7.99。證實(shí)， 隨著時(shí)間的增加， 可顯著提升釉基質(zhì)衍生物對(duì)于牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。

釉基質(zhì)衍生物可將牙周膜干細(xì)胞活力增強(qiáng)， 隨著不斷增加質(zhì)量濃度， 會(huì)增加促進(jìn)作用， 0 mg/L為1.01， 20 mg/L為1.61， 50 mg/L為1.83， 100 mg/L為1.95;通過(guò)100 mg/L劑量實(shí)施細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)， 表明隨著時(shí)間的增加， 明顯增加牙周膜干細(xì)胞數(shù)， 即為0 d為0.5×105， 2 d為1.5×105， 4 d為3.5×105。

3 討論

現(xiàn)階段臨床治療牙周炎疾病過(guò)程中促進(jìn)組織修復(fù)、控制局部炎癥為主要方法。針對(duì)牙槽骨缺損患者最理想的臨床治療方法為牙槽骨再生， 但牙槽骨再生始終都是治療牙周炎疾病的重點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。此外， 牙槽骨缺損和吸收引發(fā)的骨量不足， 也屬于種植牙治療的主要問(wèn)題， 因具有不足夠的骨量， 導(dǎo)致種植體固位不良， 患者可能需要選擇移骨粉或者植自體骨等材料對(duì)骨量進(jìn)行增加， 導(dǎo)致容易種植修復(fù)失敗或者放棄治療。如可將牙槽骨再生水平顯著提升， 能夠有效處理骨量不足導(dǎo)致的問(wèn)題， 促使種植修復(fù)效果比較滿意[3-5]?，F(xiàn)階段在治療牙周病和修復(fù)牙周缺損過(guò)程中牙周骨移植及其引導(dǎo)組織再生術(shù)屬于常見(jiàn)方法， 但具有不理想的牙周組織生理功能和結(jié)構(gòu)恢復(fù)效果。釉基質(zhì)衍生物是取自發(fā)育期牙釉組織的一種物質(zhì)， 釉基質(zhì)衍生物利于牙周膜干細(xì)胞成骨對(duì)基因Ⅰ型膠原、RUχ2及其骨鈣素的分化[6-8]。

綜上所述， 釉基質(zhì)蛋白能促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖、蛋白合成及礦化相關(guān)蛋白骨涎蛋白和骨橋蛋白的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[1] 趙文華， 葉銀婷， 李燕燕， 等. 骨膜蛋白在人牙周膜干細(xì)胞成纖維表達(dá)中的研究進(jìn)展. 口腔醫(yī)學(xué)， 2018， 38（4）： 364-367.

[2] 于彬， 舒獻(xiàn)碧， 黃詠梅. 1， 25-二羥基維生素D3對(duì)人牙周膜干細(xì)胞體外成骨作用的機(jī)制研究. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2019， 18（4）：41-44.

[3] 李影， 劉娜， 張維， 等. Wnt經(jīng)典通路β-catenin過(guò)表達(dá)對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖能力及成骨能力的影響. 中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2017， 15（4）：198-203.

[4] 黃飛， 丁潔， 張明燁， 等. 脂多糖對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖及炎癥因子表達(dá)的影響. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志， 2017， 27（2）：86-88， 110.

[5] 鄭樹(shù)燦， 鄒暉， 黃旭瑤， 等. 低氧對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖和分化的影響. 口腔醫(yī)學(xué)研究， 2019， 35（1）：38-41.

[6] 龍晏， 邱申彩， 李淑慧， 等. 過(guò)表達(dá)Notch1的胞內(nèi)段基因?qū)θ搜乐苣じ杉?xì)胞增殖能力影響. 口腔醫(yī)學(xué)研究， 2019， 35（1）：28-32.

[7] 邱申彩， 戴曉瑋， 龍晏， 等. 不同濃度γ-分泌酶抑制劑對(duì)人牙周膜干細(xì)胞骨向分化的影響. 中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志（電子版）， 2018， 12（6）：335-341.

[8] 米夢(mèng)夢(mèng)， 夏海斌， 王敏. 釉基質(zhì)蛋白衍生物在口腔種植中的研究進(jìn)展. 國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2018（5）：522-526.

[收稿日期：2019-09-12]

基金項(xiàng)目：十堰市市級(jí)引導(dǎo)性科研項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：17Y43）

作者單位：442000 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬口腔醫(yī)院

通訊作者：任偉偉