李千會，陳說，趙楊

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽 110001）

卵巢癌是最致命的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，死亡率較高［1］。卵巢癌在早期階段沒有明顯癥狀，因此，大多數(shù)患者在初診時(shí)已處于晚期［2］。腫瘤切除手術(shù)聯(lián)合鉑類藥物化學(xué)治療（簡稱化療）可用于多種實(shí)體腫瘤的治療。順鉑自1989年開始被廣泛用于治療卵巢癌，但許多患者可出現(xiàn)順鉑耐藥及腫瘤復(fù)發(fā)，且順鉑耐藥的具體機(jī)制目前尚不明確［3］。E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）屬于E2F轉(zhuǎn)錄因子家族，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥［4-7］。本研究組在前期研究［8］中發(fā)現(xiàn)，E2F1可通過調(diào)節(jié)miR-519d/RhoC途徑促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。然而，E2F1是否參與卵巢癌耐藥尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬探討E2F1在卵巢癌細(xì)胞耐藥中的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone Logan公司）培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株A2780。另用含20 ng/mL順鉑的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人卵巢癌順鉑耐藥株A2780/DDP。在常規(guī)培養(yǎng)期間，每2 d更換1次培養(yǎng)基。按照說明書用lipofectamine 3000（美國Invitrogen公司）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別用E2F1過表達(dá)質(zhì)粒及小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染A2780/DDP細(xì)胞，上調(diào)或下調(diào)E2F1的表達(dá)。

1.2 MTT

將細(xì)胞消化后接種于96孔板中（3×103/孔），孵育12 h，加入不同濃度的順鉑。待細(xì)胞培養(yǎng)48 h后加入5 mg/mL MTT（中國Solarbio公司）20 μL/孔，37 ℃孵育4 h，除去培養(yǎng)基/MTT溶液，加入DMSO（150 μL/孔）。使用微孔板分光光度計(jì)（美國Bio-Tek Instruments公司）測量吸光度。

1.3 RT-PCR

用TRIzol試劑盒（日本TaKaRa公司）從A2780、A2780/DDP及分別轉(zhuǎn)染了E2F1過表達(dá)質(zhì)粒和si-RNA的A2780/DDP細(xì)胞中提取總RNA，按照說明書逆轉(zhuǎn)錄cDNA?；贕enBank序列設(shè)計(jì)引物。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（日本TaKaRa公司）進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。GAPDH用作內(nèi)參基因。E2F1引物序列如下：F，5'-AACCGCTGTTGTCCCG-3'；R，5'-CAAGCCCT GTCAGAAATCC-3'。GAPDH引物序列如下：F，5'-A GCCTCAAGATCATCAGCAATG-3'；R，5'-CACGAT ACCAAAGTTGTCATGGAT-3'。

1.4 Western blotting

變性蛋白（40 μg）上樣，10%或15%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至Hybond膜（德國Amersham公司），于3%牛血清白蛋白中37 ℃封閉2 h。加入一抗［E2F1抗體1︰1 000稀釋、自噬相關(guān)蛋白7（autophagy related 7 homolog，ATG7）抗體1︰1 000稀 釋、死骨片蛋白（sequestosome 1，P62/SQSTM1）抗體1︰1 000稀釋、自噬相關(guān)蛋白10（autophagy related 10 homolog，ATG10）抗 體1︰1 000稀 釋，美國Proteintech公司；切除修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白1（excision repair cross-complementing group 1，ERCC1）抗體1︰300稀釋、ATP結(jié)合蛋白C1（ATP-binding cassette，sub-family C member 1，ABCC1）抗 體1 ︰300稀釋、ATP結(jié)合蛋白G2（ATP-binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）抗體1︰300稀釋，中國北京Bioss公司；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3 beta，LC3）抗體1︰1 000稀釋，美國 Cell Signaling Technology公司］，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次，加入抗小鼠/兔IgG抗體（1︰5 000，美國Proteintech公司），室溫下孵育2 h，洗膜10 min×3次。ECL Plus檢測顯影。β-actin（1︰3 000稀釋，美國 Proteintech公司）用作內(nèi)參照。

1.5 免疫熒光染色

在培養(yǎng)板中將融合度達(dá)到 60%～80%的細(xì)胞爬片用PBS浸洗5 min×3次。4%甲醛固定30 min。PBS洗滌3次，0.2%Triton X-100室溫下透化30 min。PBS洗滌3次，3%BSA 室溫下封閉30 min。加入一抗ATG7（1︰100稀釋）、ATG10（1︰100稀釋）、LC3（1︰100稀釋）、P62（1︰100稀釋），4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，加入TRITC標(biāo)記的二抗，室溫下暗箱中孵育2 h，洗滌，DAPI孵育5 min，PBS洗滌。熒光顯微鏡下拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 A2780/DDP細(xì)胞中E2F1表達(dá)水平高于A2780細(xì)胞

MTT檢測結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞系順鉑耐藥株A2780/DDP（IC50：26.5 μmol/L）對順鉑的耐藥性高于親本A2780細(xì)胞（IC50：13.9 μmol/L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖1A。

RT-PCR及Western blotting結(jié)果顯示，A2780/DDP細(xì)胞中E2F1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著高于A2780細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖1B、1C。

2.2 E2F1參與卵巢癌細(xì)胞耐藥

通過轉(zhuǎn)染E2F1過表達(dá)質(zhì)?；駿2F1 siRNA，上調(diào)或下調(diào)A2780/DDP中E2F1的表達(dá)，并應(yīng)用Western blotting 及RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染E2F1過表達(dá)質(zhì)粒后，A2780/DDP細(xì)胞中E2F1mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜ 0.05，圖2A、2C）；在A2780/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染E2F1 siRNA，E2F1mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜ 0.05，圖2B、2D）。

圖1 A2780/DDP細(xì)胞中E2F1mRNA和蛋白表達(dá)水平高于A2780細(xì)胞Fig.1 E2F1mRNA and protein were expressed at higher levels in cisplatin-resistant ovarian cancer cell line A2780/DDP than parental A2780

圖2 E2F1過表達(dá)質(zhì)粒/E2F1 siRNA轉(zhuǎn)染上調(diào)/下調(diào)了E2F1的表達(dá)Fig.2 Transfection of E2F1 overexpression plasmid or E2F1 siRNA upregulates or downregulates the expression of E2F1

MTT結(jié)果顯示，E2F1的過表達(dá)降低了A2780/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性（P＜ 0.05，圖3A）；沉默E2F1具有相反的作用（P＜ 0.05，圖3B）。表明E2F1能增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥性。

2.3 改變 E2F1 表達(dá)不影響耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，A2780/DDP細(xì)胞中E2F1的過表達(dá)或低表達(dá)對 ERCC1、ABCC1或ABCG2的蛋白表達(dá)水平無顯著影響（圖4）。表明E2F1并非通過調(diào)節(jié)耐藥相關(guān)蛋白增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥性。

2.4 E2F1通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響卵巢癌細(xì)胞耐藥

本研究分別在A2780/DDP與A2780細(xì)胞中檢測了自噬相關(guān)蛋白ATG7、ATG10、LC3、P62的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與A2780細(xì)胞相比，A2780/DDP細(xì)胞中ATG7、ATG10和LC3蛋白表達(dá)水平升高，P62表達(dá)水平降低（圖5）。提示自噬可能在卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥中發(fā)揮作用。

用順鉑處理的A2780/DDP細(xì)胞中E2F1的過表達(dá)增加了ATG7、ATG10和LC3的表達(dá)，并降低P62表達(dá)；而E2F1的敲低具有相反的效果（圖6）。這些結(jié)果證實(shí)，E2F1的過表達(dá)促進(jìn)了A2780/DDP細(xì)胞中順鉑誘導(dǎo)的保護(hù)性自噬。

圖3 E2F1參與卵巢癌細(xì)胞耐藥Fig.3 E2F1 is involved in ovarian cancer cell resistance

圖4 改變 E2F1 表達(dá)不影響耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Altering E2F1 expression does not affect the expression of proteins involved in drug resistance

圖5 自噬相關(guān)蛋白在A2780/DDP與A2780中的表達(dá)Fig.5 Differential expression of autophagy-related proteins in A2780/DDP and A2780 cells

3 討論

E2F1在腫瘤組織中過表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展［7］。本研究結(jié)果顯示，順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞系E2F1表達(dá)水平高于親本卵巢癌細(xì)胞系，而且轉(zhuǎn)染編碼E2F1的質(zhì)粒降低了A2780/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性，而沉默E2F1則具有相反的作用，表明E2F1參與了卵巢癌的順鉑耐藥。

腫瘤細(xì)胞耐藥性與耐藥相關(guān)基因的表達(dá)水平相關(guān)。ERCC1參與某些癌癥中順鉑抗性的發(fā)展［9-10］。乳腺癌耐藥蛋白BCRP/ABCG2是ATP結(jié)合盒（ATPbinding cassette，ABC）家族中的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在化療耐藥中起著至關(guān)重要的作用［11-12］。ABCC1也稱為多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistanceassociated protein 1，MRP1），與多種癌細(xì)胞系的耐藥性相關(guān)［13-14］。本研究通過評估耐藥相關(guān)基因的表達(dá)水平，探討了E2F1增強(qiáng)卵巢癌耐藥性的分子機(jī)制。結(jié)果顯示，在A2780/DDP細(xì)胞中過表達(dá)或敲低E2F1后，ERCC1、ABCC1和ABCG2的表達(dá)水并無改變，提示這些蛋白可能并未參與 E2F1誘導(dǎo)的卵巢癌順鉑耐藥。因此，E2F1可能通過調(diào)節(jié)其他基因促進(jìn)卵巢癌順鉑耐藥性。

圖6 E2F1通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響卵巢癌細(xì)胞耐藥Fig.6 E2F1 promotes cisplatin resistance in ovarian cancer cells by regulating the expression of autophagy-related proteins

越來越多的研究表明自噬在腫瘤耐藥中起重要作用。自噬是一種進(jìn)化上保守的過程，通過對長壽蛋白和功能失調(diào)細(xì)胞器的降解和更新提供代謝支持，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。自噬在細(xì)胞正?；A(chǔ)代謝水平持續(xù)發(fā)生，在應(yīng)對饑餓、氧化應(yīng)激或藥物治療等應(yīng)激時(shí)上調(diào)［15］。腫瘤細(xì)胞可通過誘導(dǎo)自噬對抗腫瘤治療藥物產(chǎn)生耐藥性［16-18］。LC3-Ⅱ是監(jiān)測哺乳動物自噬和自噬相關(guān)過程的可靠標(biāo)記［19］，P62（SQSTM1）累積表示對自噬體的清除被阻斷。當(dāng)LC3-Ⅱ上調(diào)時(shí)，P62下調(diào)，表明自噬正在進(jìn)行，反之表示自噬過程被抑制［20］。ATG8和ATG12是形成自噬體所需的遍在蛋白樣蛋白，ATG7是E1樣連接酶，而ATG10是E2樣連接酶，后二者對ATG12的綴合都是必需的。以上這些蛋白質(zhì)的改變可導(dǎo)致自噬的喪失。在ATG8系統(tǒng)中，ATG12-ATG5綴合物能促進(jìn)ATG8和磷脂酰乙醇胺之間的綴合，而ATG10以E3-酶非依賴性方式促進(jìn)ATG12-ATG5綴合。增強(qiáng)的ATG7和ATG10水平足以誘導(dǎo)自噬［21］。本研究結(jié)果顯示，與A2780細(xì)胞相比，順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP中ATG7、ATG10、LC3表達(dá)水平升高，P62表達(dá)水平降低，提示順鉑耐藥可能與A2780/DDP細(xì)胞中的自噬有關(guān)。研究［22-23］表明，E2F1通過參與相關(guān)的信號通路影響自噬。本研究發(fā)現(xiàn)，E2F1的過表達(dá)增加了ATG7、ATG10和LC3蛋白的表達(dá)，降低了P62的表達(dá)，而沉默E2F1則具有相反的效果。以上結(jié)果表明E2F1可能通過增加自噬導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對順鉑的耐藥。

綜上所述，本研究表明 E2F1 可通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞保護(hù)性自噬，并增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性。