劉銀蘭，李國勤，葉 軒，李浙烽，徐二華，馮佩詩，顧天天，田 勇，李 昂，盧立志*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福州 350000；3.浙江省仙居種雞場，浙江仙居 311719；4.杭州康德權(quán)飼料有限公司，杭州 311107）

雞蛋的營養(yǎng)價值較高[1]，且富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素，其雞蛋中所含氨基酸在體內(nèi)的利用率高達99.6%，是天然食品中最理想的優(yōu)質(zhì)蛋白源[2]。近年來，隨著人們消費水平及對食品認識的提高，具有合理營養(yǎng)和保健功效的功能性食品逐漸被消費者關(guān)注和青睞，而具有良好藥食同源性的傳統(tǒng)植物正成為功能性食品開發(fā)的原料來源，研究、提取與應(yīng)用其中的功能性成分，開發(fā)新的功能性產(chǎn)品已成為國內(nèi)外食品研究矚目的熱點[3-4]。

紅豆杉為紅豆杉科屬種植物，被公認為天然珍稀的抗癌植物，其醫(yī)療保健、免疫調(diào)控、代謝調(diào)節(jié)、抗氧化作用等在人類和實驗動物中已有大量研究。紫杉醇是紅豆杉屬植物中具有特殊的抗癌作用的次生代謝產(chǎn)物[5-6]，最早由M.C.Wani等[7]從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）的樹皮中分離得到并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。常明進等[8]發(fā)現(xiàn)從短葉紅豆杉中提取的紫杉醇的含量僅有0.069%，資源及其匱乏。C.L.Manthey等[9]的研究表明紫杉醇除有抗有絲分裂的作用外，尚有激活巨噬細胞介導(dǎo)的抗腫瘤作用。謝寶芬等[10]報道紅豆杉中含有的紫杉醇可使動物體內(nèi)的免疫功能得到提升，對動物性疾病達到防御性作用。李循等[11]通過研究實驗發(fā)現(xiàn)紅豆杉可以增強荷瘤小鼠的免疫細胞功能，提高荷瘤小鼠的免疫力和抗菌抗疾病的能力。然而，紅豆杉作為畜禽飼料原料卻鮮有報道，紅豆杉中紫杉醇的有效含量、在動物體內(nèi)的代謝規(guī)律及其對畜禽膽固醇、卵磷脂等體內(nèi)代謝影響研究甚少，僅趙燕等[12]發(fā)現(xiàn)在肉雞飼糧中添加3%紅豆杉，紫杉醇可沉積在雞肉中，且肝臟中沉積量最高。本試驗擬研究不同水平紅豆杉葉改善雞蛋中營養(yǎng)成分的效果以及紫杉醇在雞蛋中的沉積水平，研究開發(fā)蛋雞功能性飼料，生產(chǎn)合理營養(yǎng)和保健功效的功能性食品。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

紅豆杉葉：試驗選用紅豆杉葉為上一年自紅豆杉樹修剪下的枝葉，自然光照曬干后粉粹而成，紫杉醇含量為19.6 μg/g，由浙江武義曼地亞紅豆杉開發(fā)研究有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選取140日齡，體重相近且健康狀況良好的仙居雞400只，隨機分成4組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)20只。其中飼喂基礎(chǔ)飼糧為對照組，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加2%、3%和4%的紅豆杉葉，記為2%、3%、4%組?；A(chǔ)日糧由浙江省仙居種雞場提供，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗雞只采用雙層立體籠養(yǎng)，雞舍為半封閉式，自然光照和通風(fēng)。預(yù)備試驗期7 d，正式試驗期90 d。整個試驗期間，雞只自由采食粉狀飼料、自由飲水，試驗過程詳細記錄各組雞的健康情況，按雞場正常免疫程序進行免疫和消毒，飼養(yǎng)管理條件保持一致。

1.3 樣品的收集

試驗開始，每間隔10 d隨機收集對照組、2%組、3%組、4%組每組每個重復(fù)組的雞蛋各2枚，放置保存于蛋托中，待測蛋清、蛋黃中紫杉醇的含量及蛋黃中卵磷脂、膽固醇含量的變化。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 紫杉醇含量的檢測

參照陳華等[13]方法測定紫杉醇含量，以克拉霉素為內(nèi)標，蛋清、蛋黃勻漿液分別經(jīng)乙腈沉淀蛋白后，進行HPLC-MS法測定。

1.4.2 蛋清蛋白的分離

參照麻小娟等[14]的方法對蛋清蛋白進行分離。用蛋黃蛋清分離器將蛋黃分離出來，將蛋黃稱重后，稱取2.5 g放入25 mL容量瓶中，加生理鹽水定容至刻度，搖勻，制成蛋黃稀釋液，備用。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分Table 1 Basic diet composition and nutrients

1.4.3 膽固醇含量的檢測

采用北京北化康泰臨床試劑有限公司所生產(chǎn)的膽固醇試劑盒測定蛋黃膽固醇含量。樣品前處理方法同1.4.2，取0.1 g/mL的蛋黃稀釋液1 mL于10 mL離心管中，加入 1.0 mL 95%乙醇，用漩渦振蕩器混勻，然后加入2.5 mL乙醚，混勻后再加入2.5 mL石油醚，振蕩混勻，3 000 r/min離心5 min。將上層萃取液移出，在65℃水浴中用氮氣吹干，加入2.0 mL無水乙醇溶解剩余物。

在測定膽固醇濃度的基礎(chǔ)上，根據(jù)蛋黃重計算每枚雞蛋中膽固醇的總含量。

1.4.4 卵磷脂含量的檢測

采用乙醇提取法對卵磷脂的含量進行檢測。對雞蛋的蛋白和蛋黃進行分離，將蛋黃收集燒于杯中備用。稱取一定量的蛋黃于具塞錐形瓶中，按乙醇體積與蛋黃的克數(shù)（mL/g）比例為 10∶1，分別加入不同濃度的乙醇（100%，95%，90%，85%，80%，75%），常溫下在磁力攪拌器上攪拌 1 h，將提取液收集于 50 mL離心管中，4 000 r/min離心 15 min，取上清液，沉淀再加入不同濃度乙醇提取、離心，合并兩次上清液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至近干，取出濃縮物，真空冷凍干燥，得到卵磷脂。稱重，計算提取率。提取率=（卵磷脂重量/蛋黃重量）×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2007進行整理，采用SPSS 17.0軟件對整理數(shù)據(jù)進行方差分析，并采用LSD和Duncans檢驗法進行各組間差異顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著。試驗數(shù)據(jù)以平均值標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆杉葉添加水平對紫杉醇在蛋清中沉積量的影響

由表2可見：對照組蛋清中未檢測到紫杉醇含量，添加紅豆杉葉后的第10天，3個試驗組蛋清中均未檢測到紫杉醇含量；第20天可以檢測到紫杉醇含量，但含量極少，4%組顯著高于2%組（P＜0.05），3%與4%組間差異不顯著（P＞0.05）；第20～70天，2%、3%、4%組間差異顯著（P＜0.05），且 4%組顯著高于2%、3%組（P＜0.05），但2% 與3%組間差異不顯著（P＞0.05）；第80天，3% 與4%組顯著高于2%組（P＜0.05），但 3%與 4%組間差異不顯著（P＞0.05）；第90天，4%組顯著高于2%組，但3%與4%組差異不顯著（P＞0.05），2%與3%組間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 紫杉醇在蛋清中的沉積量的變化Table 2 Changes in the deposition amount of paclitaxel in egg white mg·kg-1

2.2 紅豆杉葉添加水平對紫杉醇在蛋黃中沉積量的影響

由表3可見：對照組蛋黃中未檢測到紫杉醇含量，添加紅豆杉葉后的第10天，2%、3%和4%組蛋黃中均可以檢測到紫杉醇的含量，但沉積量極少各組間差異不顯著（P＞0.05）；第 20～60天，3組間差異顯著（P＜0.05），4%組顯著高于 2%、3%組（P＜0.05），2%組顯著高于3%組；第70天，3組間差異顯著（P＜0.05），4%組顯著高于其他兩組（P＜0.05），但 2%組與 3%組間差異不顯著（P＞0.05）；第 80天，3%、4%組顯著高于2%組（P＜0.05），但3%與4%組間差異不顯著（P＞0.05）；第 90天，3組間差異顯著（P＜0.05），4%組顯著高于其他兩組（P＜0.05），2%組顯著高于3%組（P＜0.05）。

表3 紫杉醇在蛋黃中的沉積量的變化Table 3 Changes in the deposition of paclitaxel in egg yolk mg·kg-1

2.3 紅豆杉葉添加水平對仙居雞蛋黃中膽固醇含量的影響

由表4可見：第10天，對照組、試驗組各組間膽固醇含量差異不顯著（P＞0.05），第 20、30、40 天，3個試驗組顯著低于對照組（P＜0.05），3個試驗組間差異不顯著（P＞0.05）；第50天，試驗組膽固醇含量顯著低于對照組（P＜0.05），4%組顯著低于其他兩組（P＜0.05），2%、3%組間差異不顯著（P＞0.05）；第 60、70、80、90天，3個試驗組膽固醇顯著低于對照組（P＜0.05），3%、4%組顯著低于 2%組（P＜0.05），3%與4%組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 紅豆杉添加水平對仙居雞蛋黃中卵磷脂含量的影響

由表5可見：第10天，對照組和3個試驗組各組間卵磷脂含量差異不顯著（P＞0.05），第 20、30、40天，3個試驗組卵磷脂顯著高于對照組（P＜0.05），試驗組間差異不顯著（P＞0.05）；第50天，4%組顯著高于對照組，對照組及2%組、3%組組間差異不顯著（P＞0.05），3個試驗組間差異不顯著（P＞0.05）；第60、70、80天，試驗組卵磷脂顯著高于對照組（P＜0.05），試驗組間差異不顯著（P＞0.05）；第90天，3%、4%組顯著高于對照組（P＜0.05），2%與3%組間差異不顯著（P＞0.05），對照組、2%紅豆杉葉組間差異不顯著（P＞0.05）。

表4 試驗雞蛋黃膽固醇含量的變化Table 4 Test the change of cholesterol content in egg yolk mg·kg-1

表5 試驗雞蛋黃卵磷脂含量的變化Table 5 Test the change of egg yolk lecithin content mg·kg-1

3 討論與結(jié)論

3.1 紅豆杉葉添加水平對紫杉醇在蛋清、蛋黃中沉積量的影響

趙燕等[12]發(fā)現(xiàn)將紅豆杉添加到肉雞日糧中，紅豆杉中的紫杉醇可在雞肉中沉積，但沉積量很低。Wang X.等[15]給大白鼠靜脈注射5 mg/kg紫杉醇后，在各組織中進行紫杉醇含量檢測時發(fā)現(xiàn)，紫杉醇在肝臟中含量較高。孟素蕊等[16]通過對昆明小鼠進行尾靜脈注射9 mg/kg紫杉醇注射液，發(fā)現(xiàn)紫杉醇在肝臟分布最多，其次是腎臟。說明紫杉醇不論以任何形式（注射紫杉醇注射液或飼喂紅豆杉飼料）進入動物機體后，都可以沉積到體內(nèi)各組織，但紫杉醇在雞蛋中的沉積目前尚未見報道。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，紅豆杉葉中的紫杉醇可以從飼糧中轉(zhuǎn)移到雞蛋中，且在蛋清和蛋黃中都可以檢測到紫杉醇的含量，說明雞蛋可以作為紫杉醇的載體，且紫杉醇可以在蛋清、蛋黃中沉積，為開發(fā)富含紫杉醇雞蛋產(chǎn)品提供了依據(jù)。

3.2 紅豆杉葉添加水平對仙居雞雞蛋蛋黃中膽固醇含量的影響

膽固醇是影響家禽蛋品質(zhì)的重要指標，主要存在于家禽蛋黃中，通常將蛋黃中膽固醇的含量作為評價蛋品質(zhì)的依據(jù)[17]。雞蛋中膽固醇的含量較高，且在蛋黃中膽固醇含量約10.34 mg/g[18]，為滿足不同人群的需要，低膽固醇雞蛋備受人們關(guān)注[19-23]，有研究表明，高膽固醇會導(dǎo)致人類高血脂、冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病[24]，雞蛋源膽固醇比其他食品源膽固醇更易導(dǎo)致人體血清膽固醇水平的提高，因而有必要對雞蛋中膽固醇的含量進行分析[25]；美國心臟病研究會推薦人體每天膽固醇攝入量不應(yīng)超過300 mg，可減少高脂血癥和冠心病的危險[26]。因此，探索減少雞蛋中膽固醇的含量已經(jīng)成為研究熱點。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在仙居雞飼糧中添加紅豆杉葉可降低蛋黃中膽固醇的含量，隨著飼喂時間的延長、添加水平的增加，膽固醇含量下降的趨勢越明顯，說明紅豆杉葉產(chǎn)生作用需要一定的時間。紅豆杉中含有的主要成分除紫杉烷類，還有黃酮類物質(zhì)、紅豆杉多糖類物質(zhì)等也兼具有消炎殺菌等作用[27]。徐國銀[28]在蛋雞飼糧中添加大豆黃酮，結(jié)果表明大豆黃酮使蛋黃膽固醇含量顯著降低，并且時間越久作用效果越明顯。尹靖東等[29]試驗表明日糧中添加10 mg/kg大豆黃酮有降低產(chǎn)蛋雞血漿總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的作用；蛋黃膽固醇濃度隨大豆黃酮添加量升高而顯著降低，且隨著添加量升高，雞蛋膽固醇含量出現(xiàn)遞減趨勢。在飼糧中添加紅豆杉葉能夠降低蛋黃中膽固醇的含量，可能因為紅豆杉中含有的黃酮類和生物堿性物質(zhì)可以和膽固醇部分結(jié)合，減少了膽固醇向蛋黃中的轉(zhuǎn)移[30]。對于紅豆杉作用的最佳時長及是否可以通過增加添加水平來縮短起效時間尚需進一步研究。

3.3 紅豆杉葉添加水平對仙居雞蛋黃中卵磷脂含量的影響

卵磷脂是動植物體內(nèi)一種非常重要的含磷物質(zhì)，主要包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸等成分[31]。卵磷脂是人體細胞生物膜的重要組成部分和脂質(zhì)來源，而在雞蛋蛋黃中卵磷脂含量占其總量的2%～6%[32]。研究表明，卵磷脂具有良好的生理特性，如抗氧化活性[33]；提高大腦的活性和加強記憶力[34]；降低血脂，減少脂質(zhì)在血管內(nèi)壁的停留時間，降低膽固醇[35]等。卵磷脂在食品、化妝品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域都有應(yīng)用[36-37]。天然卵磷脂廣泛存在于動、植物體內(nèi)，以蛋黃、大豆內(nèi)含量較多，其中蛋黃卵磷脂具有含量高、易吸收、氧化穩(wěn)定性好的顯著優(yōu)勢，因此蛋黃卵磷脂的功能特性及應(yīng)用開發(fā)日益受到人們的關(guān)注[38]。在仙居雞基礎(chǔ)日糧中添加紅豆杉葉后，蛋黃中卵磷脂的含量明顯得到了改善。這可能與紅豆杉中含有的黃酮類物質(zhì)有關(guān)，張琳等[39]研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物可以提高蛋黃卵磷脂的含量。但目前將紅豆杉葉應(yīng)用于蛋雞生產(chǎn)的報道幾乎沒有，具體紅豆杉中什么物質(zhì)的含量對卵磷脂起到改善作用，仍需進一步驗證。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加4%的紅豆杉葉，隨著時間的延長，提高了雞蛋蛋黃中卵磷脂的含量。因此，在蛋雞飼糧中添加紅豆杉葉對蛋雞生產(chǎn)有著重要的意義，有待于開發(fā)利用。

綜上，在仙居雞飼糧中添加紅豆杉葉后，紫杉醇可以沉積到蛋清和蛋黃中，且可提高蛋黃卵磷脂的含量、同時降低膽固醇的含量，以4%的紅豆杉葉的添加水平效果最佳。