李 浪，張 娟 ，劉光芒，王建萍，林 燕，白世平，張克英，張軍民，趙青余，吳彩梅*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點實驗室，成都 611130；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

鎘（Cd）是一種常見的重金屬污染物，是人與動物的非必需重金屬元素。鎘通過飼糧、飲水、空氣等途徑被動物吸收進而蓄積于體內各個組織中，從而對各組織器官造成不同程度的損傷，嚴重影響動物及人體的正常生理功能[1-2]。鈣代謝紊亂是鎘毒性的重要方面，而鎘對蛋雞鈣代謝影響及對雞蛋和蛋殼質量影響研究較少，因此，開展本研究為鎘對蛋雞鈣代謝和鈣沉積的影響及對雞蛋蛋殼質量的影響提供基礎數(shù)據(jù)，同時為鎘影響蛋雞鈣代謝的機理研究奠定基礎。鎘作用于腸道和腎臟，可導致腸道對鈣的吸收減少、腎臟對鈣的排泄增加，使機體處于負鈣平衡，作用于骨骼引起骨骼礦化障礙、骨鈣溶出增加，臨床表現(xiàn)為骨軟化、骨質疏松[3-6]。M.NISHIJO等[7]研究了不同地區(qū)、不同年齡段成年男性和女性長時間暴露在低鎘環(huán)境中的血液鎘，尿鎘和骨損傷之間的關系，結果顯示鎘暴露尤其是血鎘會影響骨骼重塑，而M.H.Bhattacharyya等[8]證明鎘暴露使雌鼠椎體骨密度峰值降低，尿鈣排泄增加，鈣排泄分數(shù)增大，降低細胞內鈣的積累和鈣化結節(jié)的形成。在鵪鶉日糧中添加不同劑量的鎘會使鵪鶉的產(chǎn)蛋率、蛋重、蛋殼強度降低[9]。在蛋雞飼糧中添加鎘會降低蛋雞生產(chǎn)性能、產(chǎn)蛋率，使蛋殼變薄、軟殼蛋數(shù)增多[10]。鎘暴露引起的人類和動物的鈣代謝失衡，如尿鈣增多、骨質減少、骨質疏松癥、骨軟化癥等已被廣泛報道[2，4，8，11-12]，而鈣是雞蛋中的營養(yǎng)物質，且是蛋殼的主要組成成分，鎘影響蛋雞鈣吸收會直接影響蛋品質和蛋雞健康。因此，本試驗擬通過在蛋雞玉米-豆粕型基礎飼糧中添加不同劑量的鎘（CdCl2形式），測定蛋雞血液、脛骨、糞尿、蛋黃、蛋清及蛋殼中鎘鈣含量、蛋殼品質及脛骨強度，明確飼糧鎘暴露對產(chǎn)蛋高峰期蛋雞鈣代謝和蛋品質的影響，對明確鎘對蛋雞健康和蛋品質的毒性作用及為鎘影響蛋雞鈣代謝的機理研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

本實驗動物選用150只處于產(chǎn)蛋高峰期（40周齡）的健康的粉殼羅曼蛋雞。

1.2 試驗設備及試劑

1.2.1 試驗設備

ContrAA 700高分辨率連續(xù)光源原子吸收光譜儀（配有MPE60自動進樣器），（德國Analytik Jena公司）；CEM-MARS6型智能微波消解儀（美國CEM公司）；BHW-09Y型智能趕酸儀（上海博通化學科技有限公司）；MILLIPORE實驗室超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）；TA-XT plus型物性測定儀（英國SMS公司）；CP-224s型萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；EMT-5200型蛋品質分析儀（日本TOUHOKURHYTHM公司）；移液器（德國Eppendorf公司）；玻璃器皿均用體積分數(shù)為5%的硝酸溶液浸泡24 h以上。

1.2.2 試驗試劑

鎘、鈣標準溶液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；濃硝酸HNO3（四川西隴化工有限公司）；鹽酸（四川西隴化工有限公司）；高氯酸（天津市鑫源化工有限公司）；過氧化氫H2O2；實驗所用試劑均為優(yōu)級純（GR）；實驗用水為18.2 MΩ·cm的超純水。

1.3 試驗設計

將40周齡150只處于產(chǎn)蛋高峰期的健康粉殼羅曼蛋雞隨機分為5個處理組，每個處理3個重復，每個重復10只雞。處理組1為對照組，飼喂玉米-豆粕型基礎飼糧（參照NRC1994標準配制），飼糧組成和營養(yǎng)水平見表1。處理組2～5為試驗組，飼喂在基礎飼糧中分別添加 10、30、50、70 mg/kg鎘（CdCl2）的試驗飼糧，試驗方案見表2。試驗前期，預飼1周，試驗期8周，試驗期內，蛋雞自由采食和飲水，試驗末期，收集雞蛋，每個重復選取三只雞，屠宰。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis)%

表2 實驗設計方案Table 2 Experimental design

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)所試驗場進行?采用三層全階梯籠養(yǎng)，自然光照與人工照明相結合，保證每天16 h光照，舍內溫度控制在25℃左右，雞舍內采用機械通風和自然通風進行通風和換氣，試驗全期自由飲水，每日飼喂 2 次（09:00；13:00），并觀察雞有無異常行為。定期打掃圈舍衛(wèi)生，按常規(guī)方法進行飼養(yǎng)管理及免疫。

1.5 樣品采集

第八周末試驗結束后，從每個重復中隨機選取3只雞（每個處理組9只，共45只），禁食12小時后采用肝素鈉抗凝管翅靜脈采血3 000 r/min離心10 min分離血漿，斷頭法處死，取其脛骨、糞尿樣品冷凍保存。收集第8周末的雞蛋，從每個重復組中隨機選取5枚雞蛋分離蛋清和蛋黃，將5個雞蛋的蛋清和蛋黃分別混勻，混勻后從中取出50克左右冷凍保存。5枚蛋殼用棉簽清理蛋清后稱重，冷凍保存。

1.6 指標測定與方法

1.6.1 測定指標

測定血漿、脛骨、糞便、蛋清、蛋黃、蛋殼中的Cd、Ca含量、蛋殼質量以及脛骨強度。

1.6.2 指標測定方法

血漿、糞便、脛骨、蛋清、蛋黃、蛋殼中鎘和鈣測定采用原子吸收光譜法[13]，脛骨、蛋殼中鈣含量參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[14]中高錳酸鉀滴定法測定。脛骨強度：采用物性測定儀測定。

蛋殼品質：蛋殼重、蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋殼比率均采用蛋品質分析儀測定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007整理，采用SAS 9.4中One-way ANOVA進行單因素方差分析和顯著性檢驗，結果用平均值±標準差表示，當P＜0.05時為差異顯著，P＜0.01時為差異極顯著。再根據(jù)Linear或Quadra是否顯著，顯著者用SAS進行一元多階回歸分析，線性表示為Y=a+bX，其中a表示截距，b表示直線的斜率，R2表示決定系數(shù)，二次表示為Y=aX2+bX+c，其中a表示二項系數(shù)，決定拋物線開口方向，b表示一項系數(shù)，和a共同決定對稱軸位置，c為常數(shù)項。

2 結果與分析

2.1 飼糧鎘對蛋雞糞尿、脛骨、血漿、蛋清、蛋黃、蛋殼中鎘殘留量的影響

糞尿、脛骨、血漿、蛋清、蛋黃中鎘含量結果見表3。糞尿中鎘殘留量為mg/kg級，隨飼糧鎘添加量的增加呈一次線性增加（y=0.624 7+0.009 7x，R2=0.903 9，P＜0.000 1），各處理組糞尿中鎘殘留量極顯著高于對照（0 mg/kg）組，除50 mg/kg組和70 mg/kg組外，其余各處理組間均差異極顯著（P＜0.01）；脛骨中鎘殘留量為mg/kg級，隨飼糧鎘添加量的增加呈一次線性增加（y=0.091 1+0.018 3x，R2=0.726 7，P＜0.000 1），對照組（0 mg/kg）、10 mg/kg 組和 30、50、70 mg/kg組差異顯著（P＜0.05）。血漿中鎘殘留量為μg/L級別，隨飼糧鎘添加量的增加呈一次線性增加（y=1.232 5+0.023 2x，R2=0.772 4，P＜0.000 1），各處理組與對照組（0 mg/kg）相比差異極顯著（P＜0.01）；蛋黃蛋清鎘殘留量為μg/kg級，蛋黃鎘殘留量高于蛋清，隨飼糧鎘添加量的增加呈一次線性增加（y=2.599+0.405 7x，R2=0.920 7，P＜0.000 1）；30、50、70 mg/kg 組的蛋黃鎘殘留量極顯著高于對照組（0 mg/kg）和10 mg/kg組（P＜0.01），10 mg/kg組和對照組（0 mg/kg）間差異不顯著（P＞0.05）；蛋清中的鎘殘留量各處理組間差異均不顯著（P＞0.05），蛋殼中鎘含量過低未檢出（課題組前期建立的石墨爐快速測定鎘含量的方法中鎘的檢出限為0.244 ng/mL）。

2.2 飼糧鎘對蛋雞糞尿、脛骨、血漿、蛋殼中鈣含量的影響

糞尿、脛骨、血漿、蛋清、蛋黃中鈣含量結果見表4。由表4可知，血漿中鈣含量變化無明顯趨勢（P＞0.05）；糞尿中鈣含量隨飼糧中鎘添加量的增大而增大，呈一次線性增加（y=19.7269+1.3221x，R2=0.8505，P＜0.000 1），30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg 組鎘含量極顯著高于對照組（0 mg/kg）和 10 mg/kg組（P＜0.01）；脛骨中鈣含量隨飼糧中鎘添加量增加呈一次線性減少（y=194.319 2-1.106 6x，R2=0.737 0，P＜0.000 1），10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg 組脛骨中鈣含量顯著低于對照組（0 mg/kg），70 mg組顯著低于其他組（P＜0.05）；但蛋殼中鈣含量無明顯變化。

表3 飼糧鎘對蛋雞糞尿、脛骨、血漿、蛋清、蛋黃、蛋殼中鎘殘留量的影響Table 3 Effects of dietary cadmium on cadmium residues in feces，urine，tibia，plasma，egg white，egg yolk and egg shell of laying hens

2.3 飼糧鎘對蛋殼品質的影響

蛋雞蛋殼質量結果如表5所示，由表5可知，與對照組（0 mg/kg）相比，10 mg/kg組的蛋殼厚度增加（P＞0.05），30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg 組蛋殼厚度無顯著變化（P＞0.05）；蛋殼重、蛋殼比重無顯著變化（P＞0.05）；30 mg/kg組、50 mg/kg組蛋殼強度顯著低于對照組（0 mg/kg），但70 mg/kg組的蛋殼強度與其他處理組差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 飼糧鎘對脛骨強度的影響

蛋雞脛骨強度變化如表6所示，由表6可知，各處理組蛋雞脛骨中端的強度無明顯變化趨勢（P＞0.05）；與對照組（0 mg/kg）相比，10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg組蛋雞脛骨兩端的強度下降但差異不顯著（P＞0.05）。

表4 飼糧鎘對蛋雞糞尿、脛骨、血漿、蛋清、蛋黃、蛋殼中鈣含量的影響Table 4 Effects of dietary cadmium on calcium content in feces，urine，tibia，plasma，egg white，yolk and shell of laying hens

表5 飼糧鎘對蛋殼品質的影響Table 5 Effect of cadmium of feed on egg-shell quality

表6 飼糧鎘對脛骨強度的影響Table 6 Effects of dietary cadmium on tibial strength kg·cm-2

3 討論與結論

本試驗的研究結果表明，隨著鎘添加量的增加，蛋雞糞尿、血漿、骨骼、雞蛋中鎘含量均呈線性增加，但雞蛋中的鎘含量遠低于我國鮮蛋衛(wèi)生標準（GB 2743-2003）的規(guī)定（0.05 mg/kg）。孫濤[15]等在蛋雞飼糧中添加 0 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg的鎘（CdCl2形式），發(fā)現(xiàn)蛋清、蛋黃中的鎘含量隨鎘添加量的增加而增多，但均是μg/kg級別，這可能與母體對胎盤的保護機制有關[16]。R.Swiergosz等[17]在秋水雞的飼糧中添加 0.05 μg/g、40 μg/g、70 μg/g（CdCl2形式），發(fā)現(xiàn)股骨和血液中的鎘殘留量與飼糧中鎘添加量和飼喂時間成正比，這些研究表明鎘一旦進入機體很難被排出，會在機體組織內蓄積，造成不可逆的組織損傷。

在本研究中，蛋殼中鈣含量無明顯變化趨勢，但蛋殼強度呈下降趨勢，可能是因為鎘離子Cd2+能夠干擾其他二價離子如Ca2+、Cu2+等的代謝，導致蛋殼形成過程中所需要的元素不能有效地被利用[10]。而O.Olgun等[18]也發(fā)現(xiàn)，在蛋雞飼糧中添加0、5、15、和45 mg/kg的鎘（CdCl2形式）會引起雞蛋蛋殼厚度升高，降低蛋殼重和蛋殼強度。本試驗的研究結果與之一致。糞尿中鈣含量隨飼糧中鎘添加量的增大呈線性增加，脛骨中鈣含量隨飼料中鎘含量增加呈線性減少；脛骨兩端的強度也隨鎘添加量的增加而呈降低趨勢。這表明鎘的攝入可能影響了蛋雞各組織之間的鈣含量和轉移。去卵巢小鼠經(jīng)水鎘染毒（0 mg/L、20 mg/L、100 mg/L、200 mg/L）導致糞鈣及尿鈣排泄明顯增加，骨鈣下降，鎘染毒可明顯降低去卵巢大鼠股骨頸的骨密度，高劑量組的骨密度顯著低于其余各組，骨損傷與鎘劑量之間呈顯著性負相關[19]，且鎘染毒人群或試驗動物尿液中鈣含量增加，骨骼中鈣含量減少[20]，以正常鈣水平飼養(yǎng)的成年大鼠為實驗動物，鎘的注射不僅干擾了骨骺軟骨細胞的成熟，而且增加了脛骨小梁區(qū)破骨細胞和巨核細胞的數(shù)量[21]。說明鎘的攝入對機體的鈣代謝產(chǎn)生了影響，本試驗的研究結果與之一致。鎘離子和鈣離子具有相似的理化性質，這使得鎘離子可直接在質膜、線粒體膜、微粒體膜等鈣離子轉運、貯存的特殊位置上競爭性取代鈣離子[22]。鎘可通過多種途徑或與多種蛋白作用于細胞，直接或間接改變鈣穩(wěn)態(tài)，誘導鈣穩(wěn)態(tài)介導的細胞凋亡。鎘通過和鈣競爭與鈣調素結合，干擾鈣調素及其調控的生理生化過程，取代鈣與肌動蛋白、微絲、微管結合，損害細胞功能，與鈣調蛋白結合，激活某些蛋白激酶，進而干擾與鈣相關的信息傳遞系統(tǒng)[23]，但不同細胞的作用路徑不同[24]。鎘也被認為可以通過與鈣的吸收競爭來直接降低胃腸道對鈣的吸收，并通過抑制腎臟中維生素D的激活來間接降低鈣的吸收[25]，但也有研究認為鎘降低1，25（OH）2D3水平與鎘對腎臟和骨骼的影響無關系[26]，因此有關鎘對機體鈣代謝和鈣沉積的影響機制還有待進一步研究。

4 結論

在蛋雞飼糧中添加不同濃度的鎘可引起血液、脛骨、糞尿、雞蛋中鎘含量增加（蛋殼鎘含量過低未檢出），而鎘可能抑制了蛋雞腸道鈣吸收，增加了糞尿中鈣排泄，導致機體鈣負平衡，最終導致脛骨中鈣下降。