補陽還五湯對腦出血大鼠模型相關(guān)蛋白表達的作用

李紅云 王中琳

摘要 目的：研究補陽還五湯對腦出血大鼠模型基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、谷氨酸（Glu）及PI3K、AKT表達的作用。方法：選取90只SD大鼠，以隨機抽簽法分成模型組、正常對照組及補陽還五湯組。模型組與補陽還五湯組建立腦出血模型，造模后第2 d。補陽還五湯組行補陽還五湯灌胃，模型組行生理鹽水灌胃，給藥14 d。比較3組MMP-9、TIMP-1、Glu，腦組織PI3K、AKT以及Bcl-2、BAX蛋白表達。結(jié)果：補陽還五湯組、模型組的MMP-9、TIMP-1、Glu均高于正常對照組，且補陽還五湯組MMP-9、Glu低于模型組，而TIMP-1高于模型組（均P<0.05）;補陽還五湯組、模型組腦組織PI3K、AKT蛋白表達較正常對照組更高，補陽還五湯組腦組織PI3K、AKT蛋白表達較模型組更高（均P<0.05）;補陽還五湯組、模型組腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達均高于模型組，補陽還五湯組腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達較模型組更高（均P<0.05）。結(jié)論：補陽還五湯可改善腦出血大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu，可由激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路，調(diào)控Bcl-2、BAX表達，繼而發(fā)揮保護腦組織作用。

關(guān)鍵詞 腦出血;補陽還五湯;PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路;基質(zhì)金屬蛋白酶-9;基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1;大鼠;相關(guān)蛋白;腦組織

Abstract Objective：To investigate and analyze the effects of Buyanghuanwu Decoction on the expression of matrix metalloproteinase-9（MMP-9），matrix metalloproteinase inhibitor-1（TIMP-1），glutamate（Glu），PI3K and AKT in rats with cerebral hemorrhage.Methods：A total of 90 SD rats were selected and divided into a model group，a normal control group and Buyang Huanwu Decoction group by random lottery.Rats in the model group and the Buyang Huanwu Decoction group were given the cerebral hemorrhage model.Starting from 2 d after the model，the Buyang Huanwu Decoction group was given the gavage treatment of Buyang Huanwu Decoction，while the model group was given normal saline and continuous administration for 14 d.The expression levels of MMP-9，TIMP-1，Glu，PI3K，and AKT，Bcl-2，BAX in brain tissues of the 3 groups of rats were compared.Results：The levels of MMP-9，TIMP-1 and Glu in the Buyang Huanwu Decoction group and the model group were higher than those in the normal control group，and the levels of MMP-9 and Glu in the Buyang Huanwu Decoction group were lower than those in the model group while the TIMP-1 was higher than those in the model group（all P<0.05）.The expression levels of PI3K and AKT in the brain tissues of rats in the Buyang Huanwu Decoction group and the model group were higher than those in the normal control group.PI3K、AKT protein expression levels in brain tissues of rats in Buyang Huanwu Decoction were higher than those in the model group（all P<0.05）.Bcl-2 and BAX protein expression levels in brain tissues of rats in Buyang Huanwu Decoction group were higher than those in model group（both P<0.05）.Conclusion：Buyang Huanwu Decoction can significantly improve the levels of MMP-9，TIMP-1 and Glu in rats with cerebral hemorrhage，which may further regulate the expression of Bcl-2 and BAX proteins by activating the PI3K/AKT signal transduction pathway，thereby playing a role in protecting brain tissue.

Keywords Cerebral hemorrhage; Buyang Huanwu Decoction; PI3K/AKT signal transduction pathway; Matrix metalloproteinase-9; Matrix metalloproteinase inhibitor-1; Rats; Related protein; Brain tissue

腦出血主要是指原發(fā)性腦實質(zhì)出血，在所有卒中疾病中占10%～15%，且多發(fā)于基底節(jié)區(qū)[1]。該病具有發(fā)病急、死亡率高以及致殘率高的特點，屬于腦卒中最為嚴重的類型之一，其中腦出血誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡以及繼發(fā)性腦水腫，在神經(jīng)功能損傷過程中起著至關(guān)重要的作用[2]。而隨著近年來相關(guān)研究的逐漸深入，越來越多的學者發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路參與了細胞增殖、分化以及抑制神經(jīng)細胞凋亡等過程[3]。目前，臨床上已有研究報道[4]證實，神經(jīng)營養(yǎng)因子的使用可有效激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路，從而改善腦出血患者臨床癥狀，但其效果并不十分理想。因此，尋找一種更加安全有效的治療方式顯得尤為重要，亦是目前臨床研究的重點。補陽還五湯屬于中藥制劑，具有補氣活血通絡(luò)的功效，目前已被廣泛應(yīng)用于腦卒中及其后遺癥的治療過程中，且效果顯著[5]。然而，關(guān)于補陽還五湯是否會對PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路產(chǎn)生影響，臨床研究較少。鑒于此，本研究通過研究補陽還五湯對腦出血大鼠模型基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、谷氨酸（Glu）及PI3K、AKT蛋白表達的作用并予以分析，旨在明確補陽還五湯治療腦出血的作用機制，繼而為其臨床應(yīng)用提供更佳的理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取90只清潔級SD大鼠作為試驗對象，均為我院實驗室飼養(yǎng)的6～8周大鼠。

1.1.2 藥物 1）補陽還五湯：生黃芪120 g，川芎、赤芍各4.5 g，干地龍、紅花、桃仁各3 g，當歸尾6 g。由我院藥房以水煎醇沉法制備質(zhì)量濃度為5.0 g/mL的提取物，保存在4 ℃恒溫箱中備用。2）生理鹽水（上海研生生化試劑公司）。

1.1.3 試劑與儀器 1）水合氯醛（上海生工公司，型號：A600288）;2）大鼠腦立體定向儀（北京東方德教育科技公司，型號：m155673）;3）微量注射器（北京英偉達公司，型號：Hamilton 7000）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取90只清潔級SD大鼠作為試驗對象，將其以隨機抽簽法等分成模型組、正常對照組以及補陽還五湯組。其中模型組大鼠雌性16只，雄性14只;周齡6～8周，平均周齡（7.36±0.24）周;體質(zhì)量91～136 g，平均體質(zhì)量（110.52±19.78）g。正常對照組大鼠雌性17只，雄性13只;周齡6～8周，平均周齡（7.44±0.25）周;體質(zhì)量96～135 g，平均體質(zhì)量（110.50±19.72）g。補陽還五湯組大鼠雌性18只，雄性12只;周齡6～8周，平均周齡（7.40±0.26）周;體質(zhì)量94～136 g，平均體質(zhì)量（110.47±19.90）g。3組大鼠性別、周齡、體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究已得到醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：019247）。腦出血大鼠模型的建立：通過Rosenberg法完成大鼠模型制備。即首先采用10%的水合氯醛進行腹腔注射麻醉，使用劑量為400 mg/kg，并將大鼠固定在立體儀上，選擇頭部正中作縱行切口，剝離大鼠骨膜，保證其冠狀縫與前囪暴露。選擇前囪前2 mm處以及中線右側(cè)3 mm處分別鉆1 mm直徑的小孔。采用微量注射器自股動脈內(nèi)抽取適量的血液，在立體定向儀的幫助下，順著鉆孔垂直進針6 mm左右，緩慢注入血液80 μL，留針10 min后撤針，并對切口進行消毒縫合。

1.2.2 干預(yù)方法 正常對照組僅裸露頸總動脈與神經(jīng)。補陽還五湯組從造模后第2天開始予以26 g/（kg·d）劑量補陽還五湯灌胃治療;模型組大鼠從造模后第2天開始予以等量的生理鹽水灌胃;2組均連續(xù)給藥14 d。

1.2.3 檢測指標與方法 比較3組大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平，腦組織PI3K、AKT蛋白表達水平，腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達水平。采用免疫組化法測定MMP-9、TIMP-1、Glu水平，具體操作按照試劑盒說明書進行，相關(guān)試劑盒具購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司;采用免疫組化法檢測大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白以及Bcl-2、BAX蛋白表達水平，具體操作按照試劑盒說明書進行，相關(guān)試劑盒具購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用配對t檢驗;計數(shù)資料用百分比/率（%）表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平比較 補陽還五湯組與模型組大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平均高于正常對照組，且補陽還五湯組MMP-9、Glu水平低于模型組，而TIMP-1水平高于模型組（均P<0.05）。見表1。

2.2 3組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達水平比較 補陽還五湯組與模型組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達水平較正常對照組高，且補陽還五湯組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達水平較模型組高（均P<0.05）。見表2，圖1。

2.3 3組大鼠腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達水平比較 補陽還五湯組與模型組大鼠腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達水平均高于模型組，且補陽還五湯組大鼠腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達水平較模型組高（均P<0.05）。見表3，圖2。

3 討論

中醫(yī)學認為，腦出血當屬“中風”范疇，主癥為突然昏撲、語言障礙、口舌歪斜以及偏身麻木等[6-8]。針對該病病因我國中醫(yī)學歷代醫(yī)家的論述較多，其中唐宋之前多以“外風”立論，強調(diào)“內(nèi)虛邪中”。唐宋之后則以“內(nèi)風”立論，強調(diào)“正氣之虛”“痰濕生熱”以及“心火暴甚”等。清代名醫(yī)王清任則提出中風乃是“氣虛血瘀”所致，遂立補陽還五湯治療偏癱。近代醫(yī)家張伯龍等則認為該病的發(fā)生主要為陰陽失調(diào)，氣血逆亂，直沖犯腦[9-11]。病理機制乃是本虛標實、氣血逆亂、上盛下虛致使運化失調(diào)。且現(xiàn)代醫(yī)學證實，腦出血后血腫周圍存在一個組織損傷以及水腫形成進行性加重區(qū)域，與缺血暗半帶類似，該部位的腦組織病理改變可在特定時間內(nèi)可逆，若能于此時間窗內(nèi)予以積極有效的治療，可促使受損的組織功能恢復[12-14]。

MMP-9的過度表達會對基底膜完整性造成破壞，進一步促進神經(jīng)血管細胞的凋亡，引起出血。而TIMP-1屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）內(nèi)源性抑制劑，其可通過和MMP-9得催化區(qū)以1∶1的比例可逆性結(jié)合，進一步降低MMP-9的活性，發(fā)揮保護神經(jīng)功能的目的。Glu屬于腦缺血興奮性中毒分子標記物之一，機體一旦發(fā)生腦出血，則會導致突出前膜去極化，進一步促使神經(jīng)元釋放Glu至細胞外液中，且神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及神經(jīng)元攝取Glu的功能可能因缺血導致的能量衰竭而促使細胞外Glu水平升高[15-17]。同時，腦缺血會引起ATP合成缺乏，從而降低了Glu滅能，導致胞外Glu含量增加，使得神經(jīng)元興奮性持續(xù)增高，大量釋放Glu。形成惡性循環(huán)。本研究結(jié)果顯示，補陽還五湯組與模型組大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平均高于正常對照組，且補陽還五湯組MMP-9、Glu水平低于模型組，而TIMP-1水平高于模型組（均P<0.05），提示了補陽還五湯可能是通過改善腦出血模型大鼠的MMP-9、TIMP-1、Glu水平，進一步發(fā)揮保護神經(jīng)細胞功能的目的。分析原因，作者認為補陽還五湯中的赤芍、桃仁、紅花以及川芎具有活血化瘀的功效，而干地龍可疏通血脈，補氣活血，改善大鼠的腦血流，黃芪則具有補氣升陽、利水固表的功效。此外，腦出血后機體可能釋放一系列具有絡(luò)氨酸激酶活性受體激活的物質(zhì)，從而會與P13K的調(diào)節(jié)亞基進行特異性結(jié)合，進一步激活P13K，繼而促使細胞膜上的肌醇發(fā)生磷酸化，并生成第二信使[18-20]。Akt屬于P13K下游的效應(yīng)分子，P13K可通過與Akt的PH結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而促使Akt自細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞膜，同時促使其構(gòu)象的改變，進一步使得Akt的多個位點發(fā)生磷酸化，激活A(yù)kt。而活化的Akt可通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，從而實現(xiàn)多種生長因子的調(diào)控，以此誘發(fā)細胞生長，促進細胞存活[21-23]。補陽還五湯組與模型組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達水平相較正常對照組較高，且補陽還五湯組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達水平較模型組高（均P<0.05），提示補陽還五湯可能是通過激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路，從而發(fā)揮腦保護作用。另外，Bcl-2屬于抗凋亡基因之一，而BAX屬于重要的粗凋亡基因，后者的過表達會抑制前者的表達，進一步引起細胞凋亡[24-26]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：補陽還五湯組與模型組大鼠腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達水平均高于模型組，且補陽還五湯組大鼠腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達水平較模型組高（均P<0.05），提示補陽還五湯可能是通過增加Bcl-2蛋白的表達，同時抑制BAX蛋白的表達，從而實現(xiàn)抑制細胞凋亡發(fā)生，保護腦出血的作用。究其原因，作者認為可能是補陽還五湯在有效降低血腦屏障通透性的同時，激活了PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路，從而促進復合物的形成，進一步增加了胞質(zhì)中的Bcl-2游離狀態(tài)，以此發(fā)揮抗凋亡作用[27]。

綜上所述，補陽還五湯可有效改善腦出血大鼠模型MMP-9、TIMP-1、Glu水平，激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路，進一步調(diào)控Bcl-2、BAX蛋白的表達，可能是該藥治療腦出血的重要機制之一。

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