宋宏杰 ，張 健 ，石 琴 ，周治國，王明偉

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；2.復旦大學生物醫(yī)學影像研究中心，上海 200032；

3.上海分子影像探針工程技術(shù)研究中心，上海 200032；

4.上海師范大學化學與材料科學學院，上海 200234

人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）在多種癌癥中過表達，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌等［1］，使得相關(guān)腫瘤具有惡性程度高、侵襲力強、易轉(zhuǎn)移、預后差等特點。目前，HER2是重要的腫瘤分子靶點，而且HER2靶向抗體藥物已被納入關(guān)鍵的臨床治療方案，因此，腫瘤診斷和靶向治療均需要有效的HER2表達檢測方法。

目前，臨床檢測HER2的常用方法是免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）。然而，兩者均有一定局限性，包括由于活檢取樣導致的創(chuàng)傷性和取樣誤差，不能多次、動態(tài)取樣檢查，通常只能在原發(fā)灶取樣而不能在其他轉(zhuǎn)移灶取樣，無法進行全身評價［2］，因而缺乏整體、動態(tài)等系統(tǒng)性觀察能力。研究［1］表明，腫瘤HER2表達具有明顯的異質(zhì)性，即HER2表達在原發(fā)病灶的不同區(qū)域內(nèi)、原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤之間、不同轉(zhuǎn)移灶之間及不同患者之間等都可能是不同的和變化的。分子影像檢查可以實時、全面、無創(chuàng)、實時定量地檢測HER2表達，為克服上述問題提供了有效的解決途徑，特別是高靈敏度的、基于放射性核素的核醫(yī)學分子影像檢查［3］。

核素標記HER2抗體是目前主要的HER2靶向分子影像探針。然而，抗體相對分子質(zhì)量大（約150×103），血液清除速度慢，成像時間長（通常為注射后3～5 d），給使用帶來不便。多肽則易于制備和儲存，性質(zhì)穩(wěn)定，而且相對分子質(zhì)量小，血液清除快，具有開發(fā)為分子影像探針的理想性質(zhì)［4］。因此，核素標記HER2靶向性多肽是HER2分子影像探針的重要發(fā)展方向，具有注射后及時成像的特點，臨床應(yīng)用潛力很大。

基于組合多肽文庫技術(shù)的研究［5］發(fā)現(xiàn)，一種序列模型為LTVXPWX的7肽可與HER2陽性乳腺癌細胞發(fā)生明顯的結(jié)合和內(nèi)吞作用［6］，特別是其中LTVSPWY序列的親和力最強［7］。本研究選取該七肽為HER2靶向配體，經(jīng)過螯合劑HYNIC修飾，實現(xiàn)核素99mTc標記，獲得HER2分子影像探針99mTc-HYNIC-LTVSPWY（99mTc-HP7），并開展其不同HER2表達水平的腫瘤單光子發(fā)射型計算機斷層顯像/計算機斷層掃描（single-photon emission computed tomography/computed tomography，SPECT/CT）顯像及其腫瘤攝取與HER2表達相關(guān)性的研究。

1 材料和方法

1.1 試劑與器材

委托上海科肽生物科技有限公司合成HYNIC-LTVSPWY（HP7）衍生物；無水氯化亞錫和三（羥甲基）甲基甘氨酸（Tricine）購自北京百靈威科技有限公司；乙二胺二乙酸（EDDA）來源于東京化成工業(yè)株式會社；高锝酸鈉（Na99mTcO4）購自上海原子科興藥業(yè)有限公司。所有化學試劑均為分析純，沒有進一步純化直接使用。

采用美國Agilent Technologies公司的1260 Infinity高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC），拉脫維亞Biosan公司的TS-100恒溫振蕩器，美國Waters公司Seppak?Plus C18柱；美國CRPINTEC公司CRC-25R活度計，德國Merck公司TLC Silica gel 60 F254鋁基硅膠板，德國Raytest公司miniGita Star放射性薄層色譜掃描儀（radioactive thin layer chromatography，Radio-TLC），美國Bioscan公司Nano SPECT/CT PLUS小動物SPECT/CT。

1.2 HP7的準備與分析

HPLC分析條件：分析柱為ZORBAX 300SBC18柱（5 μm，250 mm × 4.6 mm），流動相由溶液A［0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）的水溶液］和溶液B（0.1% TFA的乙腈溶液）組成，濃度梯度為0 min（80%A，20%B）、25 min（15%A，85%B）、30 min（0%A，100%B）、35 min（0%A，100%B），流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL，紫外檢測波長為214 nm。

1.3 99mTc-HP7放射性標記

為了標記99mTc-HP7，取含有20 μg HP7的Eppendorf試管，加入500 μL EDDA（20 mg/mL，溶于0.1 mol/L NaOH溶液）和500 μL Tricine（40 mg/mL，溶于0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH=6.0），混勻；再加入Na99mTcO4溶液（約5 mCi，1 Ci=3.7×1010Bq），混勻；再加入5 μL SnCl2（1.0 mg/mL，溶于0.1 mol/L HCl溶液），混勻，于100 ℃下加熱反應(yīng)15 min。

如果反應(yīng)不完全時，采用Sep-Pak C18柱分離純化。將反應(yīng)液加入預處理的C18柱，先用5～10 mL水淋洗，再用1～2 mL乙醇淋洗，加熱揮發(fā)出去乙醇，加入1～3 mL 0.9%的NaCl溶液溶解，獲得99mTc-HP7注射液。

利用Radio-TLC分析99mTc-HP7的標記率和放射化學純度。將反應(yīng)液點樣于硅膠板，分別以丙酮、0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=5.0）和甲醇/乙酸銨（體積比為1∶1）作為展開劑。

1.4 體外穩(wěn)定性實驗

取100 μL99mTc-HP7溶液分別加入至等體積的0.9% NaCl溶液和馬血清中，于37 ℃分別溫育1、3、6、18及24 h。在每個時間點，將溶液點樣在硅膠板上，以0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=5.0）為展開劑，進行Radio-TLC分析，測定各個時間點的放化純度。

1.5 SPECT/CT顯像

根據(jù)參考文獻［8］，選擇HER2表達水平不同的人胃癌NCI-N87、卵巢癌SKOV-3和結(jié)腸癌HT-29細胞系均來自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，分別用包含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基、McCOY’s 5A培養(yǎng)基和McCOY’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中，每過48 h細胞傳代1次，處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

5周齡BLAB/c裸小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，將處理好的NCI-N87、SKOV-3和HT-29細胞分散在PBS溶液中，取0.1 mL細胞懸液（1×107個細胞） 注射于裸小鼠右前肢皮下。腫瘤生長至長徑0.5～1.0 cm，用于SPECT/CT成像實驗。

采用快速截留超綠-超紅方法(以下用FIE表示)，即EGR2中的3G和2.4R的值若大于255，則看作255，計算得到的ExG - ExR2值只能夠保留大于0的像素[7]。

各取3只NCI-N87、SKOV-3和HT-29模型鼠，將0.9～1.1 mCi99mTc-HP7溶液經(jīng)尾靜脈注射到荷瘤鼠體內(nèi)，分別于注射后0.5、1.0和3.0 h進行SPECT/CT顯像。分析腫瘤（T）及對側(cè)肌肉（M）的放射性攝取%ID/g值，并計算T/M比值。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）和免疫組織化學實驗

分別選擇并處死3只NCI-N87、SKOV-3和HT-29模型荷瘤鼠，剝離獲取腫瘤組織，用于Western blot實驗的瘤塊凍存于-80 ℃，用于免疫組織化學分析的瘤塊置于4%多聚甲醛固定。所有瘤塊委托上海晶萊生物技術(shù)有限公司處理，最終獲得Western blot條帶圖及免疫組織化學圖像（×200）。利用Image J軟件分析Western blot條帶圖的灰度值，采用Image Pro Plus軟件分析免疫組織化學圖像中HER2陽性率（average optical density，AOD）=陽性區(qū)域光密度值（integral optical density，IOD）/視野面積（mm2）。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 HP7的純度

HPLC分析結(jié)果顯示，HP7的純度大于95%（圖1），冷凍干燥后易于保存，有利于后續(xù)的放射性核素99mTc標記實驗。

2.2 99mTc-HP7的標記率和放射化學純度

99mTc-HP7標記反應(yīng)液在不同展開體系中的Radio-TLC譜圖見圖2。丙酮為展開劑時，只有未標記的游離99mTcO4移到前沿，99mTc膠體、99mTc-HP7肽和99mTc-共配體復合物三者均處于原點。0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=5.0）為展開劑時，游離99mTcO4和99mTc-共配體復合物二者移到前沿，99mTc-膠體和99mTc-HP7仍然處于原點。甲醇/乙酸銨（體積比為1∶1）為展開劑，99mTcO4、99mTc-共配體復合物和99mTc-HP三者一起移到前沿，只有99mTc-膠體處于原點［9］。根據(jù)3種展開體系Radio-TLC譜圖主峰的百分比，可以計算出99mTc-HP7肽的標記率大于95%。說明99mTc-HP7肽的標記率高，不需要進一步分離純化，所得99mTc-HP7溶液的放射化學純度大于95%，能夠滿足后續(xù)的體內(nèi)顯像實驗。

圖1 HP7的HPLC分析譜圖

2.3 99mTc-HP7的體外穩(wěn)定性

圖3是99mTc-HP7在24 h內(nèi)的體外穩(wěn)定性曲線，反映不同時間點99mTc-HP7的放射化學純度的變化。99mTc-HP7在0.9%的NaCl溶液和馬血清兩種體系中的穩(wěn)定性在6 h以內(nèi)都保持在95%以上，在24 h內(nèi)大于85%以上。因此，99mTc-HP7具有良好的體外穩(wěn)定性，可用于體內(nèi)顯像實驗。

圖2 99mTc-HP7標記溶液的Radio-TLC譜圖

圖3 99mTc-HP7的體外穩(wěn)定性

2.4 腫瘤模型99mTc-HP7 SPECT/CT顯像

圖4是注射后不同時間3種腫瘤模型NCI-N87（A）、SKOV-3（B）和HT-29（C）的99mTc-HP7 SPECT/CT圖像。99mTc-HP7在NCI-N87、SKOV-3和HT-29腫瘤內(nèi)顯像信號依次降低。定量分析發(fā)現(xiàn)，對于NCI-N87和SKOV-3模型，注射后1 h99mTc-HP7的腫瘤攝取較高（大于1.0%ID/g），3 h時明顯降低，同時全身血液清除基本完全，因此3 h時靶本比最高，表現(xiàn)出較好的腫瘤靶向性和較高的圖像對比度。對于HT-29模型，99mTc-HP7的腫瘤攝取較低（小于1.0%ID/g），并隨著時間快速減少，其靶本比較低，腫瘤顯像不明顯。

2.5 腫瘤組織HER2表達的Western blot和免疫組織化學檢測

從Western blot條帶圖（圖5）可知，反映NCI-N87（左）、SKOV-3（中）和HT-29（右）腫瘤組織HER2表達的條帶灰度依次降低，其半定量分析得到3種腫瘤組織對應(yīng)的條帶相對灰度值分別為1.27、0.44和0.13。該實驗結(jié)果表明，NCI-N87、SKOV-3和HT-29腫瘤組織的HER2表達水平明顯不同，呈現(xiàn)高、中、低依次降低的趨勢。

圖4 腫瘤模型99mTc-HP7 SPECT/CT圖像及其定量分析

圖5 腫瘤組織HER2表達的Western blot條帶圖（A）及定量灰度值分析（B）

免疫組織化學染色結(jié)果（圖6）清楚地顯示NCI-N87、SKOV-3和HT-29這3種腫瘤組織的不同程度的HER2表達，對應(yīng)的定量AOD值依次降低，這與Western blot結(jié)果一致。同時，H-E染色結(jié)果顯示，腫瘤組織形態(tài)正常，無明顯壞死現(xiàn)象。

由于99mTc-H P 7是H E R 2靶向探針，NCI-N87、SKOV-3和HT-29腫瘤組織的HER2表達水平是其腫瘤攝取的關(guān)鍵因素，因此我們研究了99mTc-HP7的腫瘤攝取與HER2表達水平的相關(guān)性。相關(guān)性分析所示，兩者之間呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性（r=1.000），且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖7）。

圖6 腫瘤組織的H-E染色（A）與HER2免疫組織化學染色（B）及其定量AOD值分析（C）

圖7 腫瘤攝取與HER2表達水平的相關(guān)性分析

3 討 論

研究［10］發(fā)現(xiàn)，HER2在乳腺癌等多種常見腫瘤中高表達，這類腫瘤具有惡性程度高、進展快、易出現(xiàn)早期復發(fā)轉(zhuǎn)移和患者生存率低的特點。近年來，靶向HER2單克隆抗體已經(jīng)成功地應(yīng)用于臨床治療［11］，比如曲妥珠單抗，可顯著提高HER2陽性腫瘤患者的生存率。因此，有效檢測HER2表達狀態(tài)和動態(tài)變化對于精準腫瘤診斷、靶向治療患者選擇和療效評價具有非常重要的意義。

為了開展HER2靶向分子影像，本研究利用放射性核素99mTc標記HER2靶向多肽HP7，開發(fā)了HER2陽性腫瘤SPECT/CT分子影像探針99mTc-HP7。它具有多個方面的優(yōu)勢：①99mTc是臨床腫瘤核醫(yī)學顯像診斷使用最多的核素，來源于發(fā)生器，方便易得，已發(fā)展了多樣化的標記方法；② SPECT/CT是較為普及的臨床核醫(yī)學顯像診斷儀器，費用較低，較為普惠，有利于應(yīng)用推廣；③ 與核素標記單克隆抗體類分子影像探針的相對分子質(zhì)量大、血液清除慢、最佳顯像時間較長、生產(chǎn)難度大且成本高等不足相比，核素標記多肽類探針具有相對分子質(zhì)量小、血液清除快、注射后及時顯像、易于生產(chǎn)且成本低等優(yōu)勢。

本研究采用基于螯合劑的方法實現(xiàn)了99mTc-HP7的放射性標記制備。目前，99mTc標記方法主要包括直接標記法［12］和間接標記法［13］。對于直接標記，99mTc通過生物分子中的多個供體基團（-COOH、-NH2-，-OH等）直接與其連接，存在穩(wěn)定性較差的問題［12］。對于間接標記，99mTc通過雙功能螯合劑連接與多肽等形成較為穩(wěn)定的結(jié)合，同時具有方法簡便、反應(yīng)條件溫和、標記率高等特點。因此，本研究使用間接方法從而避免99mTc標記對肽和靶分子生物活性的影響。需要指出的是，HYNIC作為螯合劑時，需要引入其他共配體參與螯合以形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。文獻［14-16］報道，選用Tricine和EDDA作為共配體，有利于提高標記率和穩(wěn)定性，這也成為本研究制備99mTc-HP7的方法基礎(chǔ)。

根據(jù)荷瘤鼠全身SPECT/CT顯像，本研究發(fā)現(xiàn)，99mTc-HP7的體內(nèi)生物分布以腎臟和腸道分布代謝為特征。99mTc-HP7在腎臟和膀胱的放射性顯像信號很高，這與它的相對分子質(zhì)量小有關(guān)，符合多肽在體內(nèi)主要通過腎臟代謝的一般特點。99mTc-HP7在膽囊和腸道的分布較高，這與HP7序列富含脂肪烴基和芳香基而親脂性較高的性質(zhì)吻合，也與類似文獻報道［17］一致。

為了驗證基于99mTc-HP7標記的SPECT/CT顯像腫瘤HER2表達的可行性，本項研究開展了3種HER2表達不同的腫瘤（胃癌NCI-N87、卵巢癌SKOV-3和結(jié)腸癌HT-29）顯像。實驗結(jié)果表明，這3種顯像信號依次降低，其中HER2表達較高的NCI-N87和SKOV-3腫瘤顯像清楚，而HER2表達低的HT-29腫瘤顯像不明顯。Western blot和免疫組織化學實驗均證實了3種腫瘤組織HER2表達呈高、中、低的水平，說明HER2介導99mTc-HP7特異性攝取，同時也解釋了實驗?zāi)[瘤攝取99mTc-HP7肽探針高低的原因，與類似探針的報道［18］一致。進一步的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，99mTc-HP7腫瘤攝取與HER2表達水平呈現(xiàn)良好的正相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，本研究開發(fā)了HER2陽性腫瘤SPECT/CT分子影像探針99mTc-HP7，其制備方法簡便，標記效率高，腫瘤靶向性良好，且與腫瘤HER2表達水平有關(guān)，能夠?qū)崿F(xiàn)在體內(nèi)HER2表達水平顯像?？傊?9mTc-HP7表現(xiàn)出較為理想的探針性質(zhì)及顯像效果，具有作為HER2分子影像探針的潛力。