徐健鑫,扆幸運(yùn),李曉明,丁龍君,朱永官,4,*

1 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心土壤環(huán)境研究室, 北京 100085 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)中丹學(xué)院, 北京 100049 3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 4 中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所, 廈門 361021

甲烷(CH4)是繼二氧化碳(CO2)之后第二大溫室氣體,其較強(qiáng)的紅外線吸收能力使其單分子增溫的潛力是CO2的20—30倍[1- 2]。目前全球每年CH4排放量約5×108—6×108t,其中約70%來(lái)源于微生物作用[3]。產(chǎn)甲烷菌是其中最大的貢獻(xiàn)者。產(chǎn)甲烷菌是地球上最古老的生命形式之一[4],廣泛分布于稻田、海洋沉積物、厭氧消化器等厭氧環(huán)境中[5- 7],是復(fù)雜有機(jī)質(zhì)厭氧降解的重要推動(dòng)者[8]。根據(jù)碳源差異,產(chǎn)甲烷菌的能量代謝方式可分為：以H2或甲酸為電子供體還原CO2、乙酸發(fā)酵及甲基營(yíng)養(yǎng)型等三種[9]。

稻田是我國(guó)最重要的人工濕地生態(tài)系統(tǒng),也是CH4排放的人為源之一[10]。每年來(lái)源于稻田的CH4排放量約2×107—1.2×108t,中國(guó)位于世界首位[11]。氧化鐵是稻田土中最豐富的氧化物。多形態(tài)、高化學(xué)活性的氧化鐵在周期性干濕交替的稻田土壤中表現(xiàn)出活躍的價(jià)態(tài)變化,影響著其他營(yíng)養(yǎng)元素的生物地球化學(xué)循環(huán)[12-13]。有研究報(bào)道,由微生物介導(dǎo)的鐵還原直接影響著甲烷合成等其他代謝途徑[14]。Jackel等研究發(fā)現(xiàn)向水稻土中添加15或30 g/kg水鐵礦時(shí),甲烷釋放的抑制效率分別可達(dá)43%和84%[15]；Peng等向不同植區(qū)水稻土中添加葡萄糖后發(fā)現(xiàn)土壤中Fe(II)的產(chǎn)生量與CH4的釋放量顯著相關(guān),并提出以Fe(II)/[Fe(II)+Fe(III)]預(yù)估CH4排放量的模型[16]。然而,目前關(guān)于鐵氧化物對(duì)產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)的影響報(bào)道較少。

本研究通過(guò)泥漿厭氧培養(yǎng),以甲酸鹽為產(chǎn)甲烷底物,水鐵礦為唯一電子受體,探究添加鐵氧化物(鐵還原)對(duì)產(chǎn)甲烷菌的群落組成的影響。本實(shí)驗(yàn)將為探究水稻土中鐵還原與碳代謝間耦合的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水鐵礦的制備

水鐵礦(Fe5HO8·H2O[12])的制備方法參照Schwertmann和Cornell[17]進(jìn)行了適當(dāng)修改。用去離子水配制0.4 mol/L FeCl3溶液,并用1.0 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至7.0。然后用10倍體積的去離子水洗滌、離心沉淀(5000 r/min,10 min),直到上清液中Cl-濃度小于1 mmol/L。將洗好的沉淀冷凍干燥,研磨過(guò)篩(0.07 mm),室溫保存。

1.2 無(wú)菌缺氧去離子水的制備

向去離子水中添加微量刃天青作為氧化還原指示劑,將無(wú)菌針頭插入液面以下并通入高純N2,加熱并維持沸騰狀態(tài)30 min,以去除去離子水中的溶解氧,此時(shí)液體成粉紫色；稍冷,加入0.3 g/L L-半胱氨酸,持續(xù)微熱并通入高純N2至液體變?yōu)闊o(wú)色；迅速封裝,高壓滅菌(121℃,20 min),冷卻待用。

1.3 泥漿厭氧培養(yǎng)

土壤樣品采自湖南省桃源縣長(zhǎng)期施肥實(shí)驗(yàn)站(28°21′N,116°92′E)。采集土壤表層0—20 cm,并去除樣品中細(xì)小的沙石和根系,放入無(wú)菌自封袋中密封,冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將樣品風(fēng)干過(guò)篩(1 mm),充分混勻。

由于微生物對(duì)甲酸鹽的大量消耗,在10 d培養(yǎng)期間每天向體系中按7 μmol/g的濃度補(bǔ)充甲酸鹽,且培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(記為第10天)體系中幾乎沒(méi)有甲酸鹽剩余。

1.4 泥漿DNA提取及16S rRNA基因測(cè)序

取培養(yǎng)第0、10天的泥漿0.5 g(干土計(jì)),用FastDNA Spin Kit for Soil(MP bio,CA,USA)試劑盒提取泥漿 DNA。選擇16S rRNA基因的V4高變區(qū)(ArBa515f_Arch806r)進(jìn)行擴(kuò)增,20 μL PCR體系包括：4 μL 5×FastPfu Buffer,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,前、后引物各0.8 μL,0.4 μL FastPfu Polymerase,0.2 μL BSA和2 μL DNA,剩余用無(wú)菌水補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件如表1。樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 PCR反應(yīng)引物和反應(yīng)條件

1.5 數(shù)據(jù)分析

初始數(shù)據(jù)分析采用Excel 2016進(jìn)行,采用SPSS(20.0,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)軟件進(jìn)行顯著性分析(one-way ANOVA)。計(jì)算香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)描述古菌群落的α多樣性,基于Weighted normalized Unifrac距離算法進(jìn)行主坐標(biāo)分析。將相對(duì)豐度發(fā)生顯著差異的操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì),利用MEGA的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),檢驗(yàn)方法為bootstrap,重復(fù)1000次。

圖1 培養(yǎng)結(jié)束前、后微生物群落組成 Fig.1 Barplot of microbial community structure in CK and Fh treatments at day 0 and 10 CK：對(duì)照處理 Control；Fh：水鐵礦處理 Ferrihydrite.誤差線為三組重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差,上方的小寫字母為不同處理培養(yǎng)前后的顯著性差異(P<0.05)

2 結(jié)果

2.1 古菌群落多樣性變化分析

基于16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)微生物群落大多由細(xì)菌構(gòu)成,古菌占比不足30%,且培養(yǎng)結(jié)束后僅CK處理中古菌所占比例顯著(P<0.05)升高,Fh處理中無(wú)顯著變化(圖1)。

進(jìn)一步從OTU水平上分析CK和Fh兩組處理中古菌群落組成的多樣性,發(fā)現(xiàn)兩組處理中香農(nóng)指數(shù)均極顯著下降(P<0.001),而辛普森指數(shù)極顯著上升(P<0.001,圖2)。這說(shuō)明添加甲酸鹽處理10天后,不僅降低了體系中古菌群落的物種多樣性,同時(shí)降低了OTU水平上古菌群落的均一性。另外,發(fā)現(xiàn)與CK相比,添加水鐵礦盡管可以降低微生物群落結(jié)構(gòu)中古菌的占比,但對(duì)古菌群落組成的多樣性沒(méi)明顯影響?；赪eighted normalized Unifrac算法的主坐標(biāo)分析(圖3)表明經(jīng)10天厭氧培養(yǎng),CK和Fh處理的古菌群落結(jié)構(gòu)均與培養(yǎng)前明顯不同,且兩者培養(yǎng)后的古菌群落組成也具有顯著差異；主坐標(biāo)解釋了總方差的82.84%。

圖2 培養(yǎng)前、后泥漿中古菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性指數(shù)(*** P<0.001)Fig.2 Barplot of Shannon index and Simpson index of archaea in CK and Fh treatments at day 0 and 10

圖3 培養(yǎng)前、后泥漿中古菌OTU水平的主坐標(biāo)分析圖Fig.3 Principal co-ordinate analysis plot for archaea community structure in CK and Fh treatments at OTU level

2.2 OTUs水平上古菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

為進(jìn)一步分析添加甲酸鹽和水鐵礦對(duì)古菌群落的影響,我們對(duì)比不同處理中培養(yǎng)前后每個(gè)OTU在體系中的相對(duì)豐度,最終發(fā)現(xiàn)OTU 2056,OTU 911,OTU 3870,OTU 2032,OTU 1970,OTU 2456,OTU 1931和OTU 895等8個(gè)培養(yǎng)后相對(duì)豐度發(fā)生顯著(P<0.05)變化的OTU(圖4)。其中,僅OTU 2056和OTU 911相對(duì)豐度升高,分別占CK和Fh處理古菌群落的80%和76%；根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析,兩者均與Methanobacterium具有較近的親緣關(guān)系。OTU 2032和OTU 2456僅在CK處理中相對(duì)豐度下降,它們與Methanosarcina具有較高的相似性；而OTU 1931和OTU 895相對(duì)豐度變化僅發(fā)生于Fh處理中,與Methanocellales較為相似。

圖4 厭氧培養(yǎng)10天后CK處理和Fh處理中相對(duì)豐度顯著變化的OTUs及其系統(tǒng)發(fā)育分析(*P<0.05,*** P<0.01,*** P<0.001)Fig.4 Phylogenetic tree of OTUs whose relative abundance change significantly after 10-day anaerobic incubations in control and Fh treatment

圖5 厭氧培養(yǎng)10天后Fh和CK處理中OTU差異的韋恩圖 Fig.5 Venn diagram of OTU difference between CK and Fh after 10-day incubations

3 討論

甲酸是生物大分子降解過(guò)程中除乙酸外又一重要的中間代謝產(chǎn)物[18],也是大多H2營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌可以利用的一種底物[10]。從能量角度上,除直接還原CO2/CO途徑以外,以甲酸鹽為電子供體是微生物最容易產(chǎn)甲烷的途徑[10]。本研究結(jié)果顯示,以甲酸鹽為底物進(jìn)行泥漿厭氧培養(yǎng)后,體系的古菌群落結(jié)構(gòu)從OTU水平上發(fā)生了明顯的改變(圖3),其物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)的均一性均顯著降低(P<0.05,圖2)。造成這一結(jié)果的原因是添加甲酸鹽刺激了OTU 2056和OTU 911的顯著富集(P<0.001,圖4),使其成為古菌中的主要優(yōu)勢(shì)種,從而降低了其他如Methanosarcina、Methanocellales和Crenarchaeote等類似古菌的相對(duì)豐度。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示這兩個(gè)OTU均與Methanobacteriumbryantii有較高的相似性。M.bryantii在系統(tǒng)發(fā)育上與M.formicicum相似,兩者都能利用甲酸鹽產(chǎn)H2和CH4[19]。Bryant等最早發(fā)現(xiàn)M.bryantii可以利用S菌株氧化乙醇的產(chǎn)物H2合成甲烷,降低了H2累積對(duì)S菌株生長(zhǎng)的抑制,從而實(shí)現(xiàn)了兩者的互營(yíng)共生[20]。之后,Guyot等也發(fā)現(xiàn)M.bryantii可以利用甲酸,與DesulfovibriovulgarisJJ共生產(chǎn)甲烷[21]。我們的體系中是否也存在著這種互營(yíng)關(guān)系有待進(jìn)一步確認(rèn)。

水稻土中存在著豐富的鐵氧化物,在周期性灌溉-排水的管理模式下,鐵也發(fā)生了活躍的價(jià)態(tài)變化,并影響著其他生命活動(dòng)[13,22]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加水鐵礦培養(yǎng)后,古菌在全部微生物群落中的占比沒(méi)有發(fā)生明顯變化,顯著低于CK處理(P<0.05)。這與早期的研究報(bào)道一致。微生物(細(xì)菌)介導(dǎo)的鐵還原與產(chǎn)甲烷過(guò)程競(jìng)爭(zhēng)電子和底物,因此與不發(fā)生鐵還原相比,產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制[5]。但我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),CK和Fh處理培養(yǎng)前后古菌群落的α多樣性沒(méi)有差異,且培養(yǎng)后兩個(gè)處理組中的優(yōu)勢(shì)種均為OTU 2056和OTU 911,占比也相似。這說(shuō)明添加水鐵礦對(duì)古菌群落的遷移沒(méi)有主導(dǎo)作用。培養(yǎng)后83% OTUs同時(shí)存在于CK和Fh處理中(圖5),也驗(yàn)證了這一結(jié)論。

4 結(jié)論

添加甲酸鹽可以有效地富集土壤中Methanobacteriumbryantii的類似微生物；添加鐵氧化物只能從總體上減少古菌占微生物總體的比重,但對(duì)古菌群落的多樣性和均一度以及顯著富集的菌株類型沒(méi)有影響。因此,在有機(jī)物的厭氧降解過(guò)程中,鐵氧化物可能只通過(guò)抑制產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)減少甲烷的釋放,而對(duì)主要發(fā)揮功能的菌株不具選擇作用。