王 芳，李漢青，何家才

頜骨缺損修復(fù)的傳統(tǒng)骨替代材料如自體骨、異體骨等，在臨床應(yīng)用中存在不可忽視的局限性[1]。骨組織工程因具有骨再生能力、無免疫源性、創(chuàng)傷小的優(yōu)勢，應(yīng)用前景廣泛，但血管化問題限制了其臨床應(yīng)用于大體積頜骨缺損的修復(fù)，因此具有促進骨再生和血管形成的雙重調(diào)控因子逐漸成為研究熱點[2-3]。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene- related peptide，CGRP)是神經(jīng)肽類物質(zhì)，體內(nèi)含量豐富且生物學(xué)效應(yīng)廣泛，血管擴張作用顯著[4]。同時近年CGRP在調(diào)控骨折愈合、骨重塑中的重要作用引起了關(guān)注[5-6]。因此，CGRP有望成為組織工程骨中具有促進骨再生和血管形成的雙重調(diào)控因子，但CGRP對間充質(zhì)干細胞成骨成血管能力影響的研究尚未深入。鑒于此，該實驗體外運用CGRP探討其對人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化和成血管能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器胎牛血清(以色列Biolnd公司)；胰酶消化液、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)； PBS緩沖劑 (美國Solarbio公司)；CGRP(美國Sigma公司)；CCK-8試劑(日本同仁公司)；CO2恒溫孵箱(美國 Thermo公司)；茜素紅(美國Sigma公司)；BCIP/ NBT堿性磷酸酯酶試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司) ；OCN、VEGF、RUNX2兔單克隆抗體(美國Abcam公司)；PCR引物(上海生物工程股份有限公司)；實時熒光定量 PCR儀(美國Stratagene公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)；酶標儀(美國Bio-tek公司)；流式細胞儀(美國 Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1hPDLSCs體外分離培養(yǎng) 于臨床收集牙周健康且無齲壞因正畸需要而拔除的前磨牙，超凈臺內(nèi)，離體牙用含3倍雙抗的PBS沖洗。使用手術(shù)刀片從牙根表面的中1/3輕輕刮取牙周膜組織(避免根尖組織和牙齦混入)，盡量剪碎，以合適的密度鋪在6孔板皿底，加入適量含20%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，避免晃動培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每3 d左右換液，鏡下觀察當細胞生長達皿底60%左右時，用胰酶消化傳代。

1.2.2流式細胞術(shù)檢測hPDLSCs表型 取第2～3代hPDLSCs，消化后PBS洗滌2遍，使細胞懸液密度為5×106/ml，并向每個EP管加入200 μl細胞懸液。分別使用空白對照、CD34、CD45、CD44、CD90、CD105、CD146抗體標記，避光孵育， PBS洗滌2遍，細胞篩過濾細胞團塊以防阻塞機器，上機檢測。

1.2.3CCK-8檢測CGRP對hPDLSCs增殖能力的影響 實驗組根據(jù)培養(yǎng)液中CGRP的濃度分別分為0 mol/L組、10-10mol/L組、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組、10-6mol/L組。取對數(shù)生長期的hPDLSCs，以4×103/孔接種于96孔板，次日分別加入不同濃度的CGRP(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)，培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后，棄上清液，每孔加入90 μl標準培養(yǎng)基+10 μl的CCK-8液，孵育2 h在避光環(huán)境中，酶標儀測定450 nm處的吸光度(optical density,OD)值，每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.2.4RT-PCR檢測 實驗分為5組分別為0 mol/L組、10-10mol/L組、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組。將hPDLSCs均勻鋪于6孔板密度調(diào)整為1×105/孔，培養(yǎng)12 h，每孔分別加入含不同濃度CGRP(0、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)3、7、14 d分別提取細胞總RNA，進行RT-PCR定量檢測分析成骨成血管相關(guān)基因堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、核心結(jié)合因子2(runt-relatedtranscription factor2，RUNX2)、骨鈣素(osteocalin，OCN)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達水平。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物列表

1.2.5Western blot檢測 實驗分組同1.2.4。將hPDLSCs均勻鋪于6孔板密度為1×105/孔，培養(yǎng)12 h，每孔分別加入含不同濃度CGRP(0、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)第7、14天分別將各組細胞裂解、提取蛋白。Bradfort蛋白定量后進行凝膠電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜，然后5% BSA封閉液封閉(室溫1 h)，分別加一抗β-actin(1 ∶ 1 000)、RUNX2、OCN(1 ∶ 500)， VEGF(1 ∶ 2 000)，4 ℃環(huán)境下過夜，加入相應(yīng)二抗(1 ∶ 5 000)，孵育1 h，蛋白條帶滴加ECL顯色液，曝光成像。

1.2.6ALP染色 將hPDLSCs接種于12孔板密度為5×104/孔，12 h后更換為含不同濃度CGRP的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后One-Step TMNBT/BCIP溶液(PIERCE)染色，并拍照；hPDLSCs以4×103/孔的密度接種96孔板，培養(yǎng)方法同前，培養(yǎng)7 d后ALP檢測試劑盒處理，測量405 nm處OD值。

1.2.7茜素紅染色 hPDLSCs鋪板培養(yǎng)方法同ALP染色，培養(yǎng)21 d，2%茜素紅染液染色，觀察拍照；然后將10%氯化十六烷基吡啶加入已染色的各樣本孔中，待各孔結(jié)節(jié)完全溶解，取溶解液測562 nm處的OD值。

2 結(jié)果

2.1 hPDLSCs體外分離培養(yǎng)組織塊法分離和培養(yǎng)hPDLSCs，約5～8 d光鏡下可觀察到原代細胞從組織塊周圍遷移出，細胞多呈長梭形，快速生長后呈放射狀排列。傳代培養(yǎng)后，細胞貼壁牢固，狀態(tài)良好。見圖1。

2.2 hPDLSCs鑒定流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，hPDLSCs高表達間充質(zhì)干細胞細胞表面標志抗原CD44、CD90、CD105、CD146，低表達造血細胞表面標志抗原CD34和CD45。見圖2。

2.3 CCK-8檢測CGRP對hPDLSCs增殖能力的影響培養(yǎng)1 d，各組間細胞OD值無顯著差異；培養(yǎng)2、3、4、5 d，與0 mol/L組相比，10-8mol/L組、10-9mol/L組細胞OD值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=45.564、96.624、147.952、162.069，P<0.05)，10-7mol/L組、10-10mol/L組細胞OD值無明顯變化，10-6mol/L組細胞OD值明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明一定濃度范圍的CGRP促進hPDLSCs的細胞增殖，10-6mol/L組的CGRP抑制hPDLSCs的細胞增殖。見表2。

2.4 RT-PCR檢測CGRP對hPDLSCs成骨相關(guān)基因(ALP、RUNX2、OCN)和成血管相關(guān)基因VEGF表達的影響檢測成骨相關(guān)基因(ALP、RUNX2、OCN)和成血管相關(guān)基因VEGF在第3、7、14天的相對表達水平。結(jié)果表明：一定濃度CGRP作用于hPDLSCs，與0 mol/L組比較，ALP的表達水平在第3、7、14天時不同程度升高(F=12.383、55.967、958.389，P<0.05);Runx2的表達水平在第7、14天升高(F=46,341、395.544，P<0.05)；14 d時OCN表達水平明顯增加(F=389.195，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。VEGF的表達水平在第3天增加,持續(xù)至第14天 (F=73.210、201.754、295.48，P<0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

圖1 hPDLSCs體外培養(yǎng)

A:原代培養(yǎng)10 d ×100; B:第二代hPDLSCs ×100;C:第二代hPDLSCs ×500

圖2 流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物

A:CD34；B:CD45；C:CD44；D:CD90；E:CD105；F:CD146

表2 CCK-8檢測不同時間和組別的細胞OD值

與0 mol/L組比較：*P<0.05

2.5 Western blot檢測RUNX2、OCN、VEGF蛋白水平的表達Western blot結(jié)果顯示:第7、14天，與0 mol/L組比較10-9mol/L組、10-8mol/L組RUNX2、OCN、 VEGF表達水平不同程度增加(P<0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

2.6 ALP染色及茜素紅染色成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后的ALP染色結(jié)果表明:與0 mol/L組比較，10-10mol/L組、10-7mol/L組的ALP活性無明顯差異；10-9mol/L組、10-8mol/ L組的ALP活性明顯增高，半定量分析顯示分別為0 mol/L組的1.4倍和1.7倍(F=387.989，P<0.05);茜素紅染色結(jié)果顯示:成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，10-10mol/L組、10-7mol/L組結(jié)節(jié)生成量與0 mol/L組比較無明顯差異；10-9mol/L組、10-8mol/L組鈣結(jié)節(jié)生成明顯，半定量分析結(jié)果顯示分別為0 mol/L組的1.5倍和1.8倍(F=306.593，P<0.05)，見圖5、6。ALP染色及茜素紅染色半定量分析中OD值，見表3。

3 討論

臨床上hPDLSCs通常取自正畸牙或阻生齒，獲取hPDLSCs時患者額外創(chuàng)傷較小。有研究[7-8]表明hPDLSCs具有多向分化潛能，如分化為成骨樣細胞、脂肪樣細胞、神經(jīng)樣細胞等。研究[7]發(fā)現(xiàn)hPDLSCs在體外培養(yǎng)過程中，其增殖率明顯高于骨髓間充質(zhì)干細胞和牙髓干細胞， 因此在組織再生研究中有廣闊的應(yīng)用前景。本實驗采用組織貼壁法培養(yǎng)hPDLSCs，方法成熟且操作方便。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示hPDLSCs表面間充質(zhì)干細胞細胞表面標志抗原CD44(99.82%)、CD90(98.75%)、CD105(99.75%)、CD146(68.98%)表達為陽性，造血細胞表面標志抗原CD34(0.10%)、CD45(0.13%)表達為陰性，表明分離培養(yǎng)的細胞符合間充質(zhì)干細胞的特性，可用于后續(xù)實驗。

圖3 RT-PCR檢測成骨分化相關(guān)基因和VEGF基因表達

A:ALP；B:RUNX2；C: OCN；D:VEGF；與0 mol/L組比較：*P<0.05

表3 ALP染色和茜素紅染色半定量分析中的OD值

半定量分析0 mol/L10-10 mol/L10-9 mol/L10-8 mol/L10-7 mol/LALP染色1.105±0.0421.130±0.0361.570±0.009?1.867±0.032?1.189±0.020茜素紅染色0.863±0.0430.87±0.0281.289±0.036?1.530±0.057?0.832±0.028

與0 mol/L組比較：*P<0.05

圖4 Western blot 檢測RUNX2、OCN、VEGF蛋白水平的表達

A:蛋白條帶；B:RUNX2；C:OCN；D：VEGF；1：0 mol/L；2：10-10mol/L；3：10-9mol/L；4：10-8mol/L；5：10-7mol/L；與0 mol/L組比較：*P<0.05

圖5 ALP染色及茜素紅染色

圖6 ALP染色及茜素紅染色半定量分析

A：ALP染色半定量分析；B：茜素紅染色半定量分析；1：0 mol/L;2:10-10mol/L；3：10-9mol/L；4：10-8mol/L；5：10-7mol/L; 與0 mol/L組比較：*P<0.05

血管化對于修復(fù)大體積的頜骨缺損非常重要，它可以提供營養(yǎng)物來支持支架內(nèi)的細胞并及時排出代謝物促進新骨形成[3]。VEGF是目前公認的最強的促血管形成的生長因子，可促進內(nèi)皮細胞的增殖和分化并誘導(dǎo)新血管形成[9]。CCK-8結(jié)果表明濃度為10-8mol/L的CGRP顯著促進hPDLSCs增殖。RT-PCR和Western blot 檢測結(jié)果顯示一定濃度的CGRP使VEGF的基因和蛋白表達量上升，說明CGRP能促進hPDLSCs分泌VEGF，故推測CGRP可通過提高hPDLSCs成血管能力間接提高骨修復(fù)能力。

CGRP是骨組織中分布最廣泛的神經(jīng)肽，被認為是骨骼的天然活化劑，其潛在的治療效果受到越來越多的關(guān)注[10]。體外實驗顯示CGRP特異性受體降鈣素受體樣受體存在于成骨細胞和破骨細胞上，CGRP可促進成骨細胞的分化和增殖[11]，抑制破骨細胞的發(fā)育[12]。Zhou et al[13]研究發(fā)現(xiàn)CGRP可通過激活Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進BMSC成骨分化。ALP是成骨分化過程中的標志物，轉(zhuǎn)錄因子RUNX2有著調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞向成骨前細胞的分化的作用，OCN在骨形成和骨轉(zhuǎn)換中都起著重要作用。因此ALP、RUNX2、OCN的表達水平的反映著hPDLSCs的成骨分化能力[14]。RT-PCR、Western blot檢測、ALP染色和茜素紅染色結(jié)果顯示，10-8mol/L濃度組的CGRP可顯著提高hPDLSCs成骨分化能力。