董 靖 胥 寧 劉永濤 張露珊 楊秋紅楊移斌 周 順 宋 懌 艾曉輝

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 420223; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100039)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種常見的條件性致病菌, 廣泛存在于自然界中, 可引起水生動物、陸生動物和人的多種感染性疾病[1]。嗜水氣單胞菌是淡水養(yǎng)殖的主要病原菌之一, 常引起養(yǎng)殖魚類的嚴(yán)重疾病, 是嚴(yán)重威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要病原菌[2]。長期以來, 水產(chǎn)養(yǎng)殖動物嗜水氣單胞菌感染的治療主要依賴于抗菌藥物, 但由于抗菌藥物的長期不合理使用導(dǎo)致嗜水氣單胞菌出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性[3]。此外, 化學(xué)抗菌藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的廣泛使用對水環(huán)境造成了一定程度的污染[4]。近年來研究表明, 嗜水氣單胞菌的致病力與其分泌的外毒素密切相關(guān), 因此抗毒力策略成為近年來研究抗嗜水氣單胞菌感染藥物的新途徑[5]。

嗜水氣單胞菌能分泌多種毒力因子, 包括溶血素、氣溶素和腸毒素等。氣溶素是嗜水氣單胞菌分泌的主要毒力因子, 與嗜水氣單胞菌的致病性密切相關(guān), 是鑒別致病性嗜水氣單胞菌的標(biāo)志[6]。氣溶素具有溶血性、腸毒性和細(xì)胞毒性, 成熟的氣溶素能結(jié)合到真核細(xì)胞表面特定的糖蛋白受體, 插入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層并形成具有孔道的七聚體,破壞細(xì)胞的滲透壓平衡并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。氣溶素對多種真核動物細(xì)胞敏感。研究發(fā)現(xiàn), 敲除氣溶素基因的嗜水氣單胞菌相比較野生型其致病力顯著下降甚至消失[8]。因此, 氣溶素成為研究抗嗜水氣單胞菌感染藥物的新靶標(biāo)。

和厚樸酚是中藥厚樸的主要成分之一, 具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗癌等多種生物學(xué)活性[9]。然而和厚樸酚對嗜水氣單胞菌毒力因子表達(dá)的影響尚無報道。本研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚在亞抑菌濃度下通過抑制嗜水氣單胞菌氣溶素編碼基因aerA的轉(zhuǎn)錄降低氣溶素的分泌, 降低嗜水氣單胞菌的致病力, 從而提高斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌感染模型的存活率。

1 材料與方法

1.1 菌株與實驗動物

嗜水氣單胞菌XS-91-4-1由中國科學(xué)院水生生物研究所李愛華研究員饋贈; 健康斑點叉尾鮰(200±10) g由本實驗室飼養(yǎng)。

1.2 試驗材料

和厚樸酚、恩諾沙星(含量＞98%)購自中國食品藥品檢定研究院; TaKaRa RNA PCR kit (AMV)和SYBR Premix ExTaq購自TaKaRa公司; 兔抗氣溶素多克隆抗體由本實驗室制備保存; 辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自鼎國生物公司;脫纖維羊血購自南京茂捷微生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

最小抑菌濃度(MIC)的測定采用美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)推薦的肉湯微量稀釋法測定和厚樸酚、恩諾沙星對嗜水氣單胞菌XS-91-4-1的最小抑菌濃度[10]。

生長曲線將嗜水氣單胞菌XS-91-4-1在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長前期(A600=0.3,28℃), 將培養(yǎng)菌分別置于6個50 mL的錐形瓶中,每瓶20 mL, 分別加入不同濃度(1、2、4、8、16 μg/mL)的和厚樸酚, 在28℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)5h, 每30min取菌液測定一次OD600的吸收值, 不加藥物的錐形瓶設(shè)置為陰性對照組。

溶血試驗將嗜水氣單胞菌XS-91-4-1在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長前期(A600=0.3,28℃), 將培養(yǎng)菌分別置于5個50 mL的錐形瓶中,每瓶10 mL菌液, 分別加入濃度為0、1、2、4、8 μg/mL的和厚樸酚, 在28℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至A600=0.5時高速離心(8000×g, 1min)收集上清液。向收集的上清液中加入終濃度為10 μg/mL的胰蛋白酶在室溫反應(yīng)10min以激活上清液中的氣溶素。向1.5 mL離心管中加入100 μL激活的上清液, 875 μL溶血緩沖液, 25 μL脫纖維綿羊紅細(xì)胞, 充分混勻,在37℃條件下孵育20min后10000 ×g離心1min, 取上清液測定OD543的吸收值。去離子水作為陽性對照(100%溶血組), 溶血緩沖液作為陰性對照(0溶血組), 每組樣品的吸光度與陽性對照的比值作為溶血百分比, 每個濃度組均開展3個獨立的重復(fù)試驗。

免疫印跡試驗將嗜水氣單胞菌XS-91-4-1在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長前期(A600=0.3, 28℃), 將培養(yǎng)菌分別置于5個50 mL的錐形瓶中, 每瓶10 mL菌液, 分別加入濃度為0、1、2、4、8 μg/mL的和厚樸酚, 在28℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至A600=1.5時高速離心(8000×g, 1min)收集上清。培養(yǎng)物上清做SDS-PAGE電泳后采用濕法轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)印至0.45 μm的PVDF膜上, 5%脫脂奶粉封閉2h, 抗嗜水氣單胞菌氣溶素抗體常溫孵育1h,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗常溫孵育1h, 采用ECL發(fā)光液檢測上清液中氣溶素的含量。

熒光定量PCR試驗將嗜水氣單胞菌XS-91-4-1在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長前期(A600=0.3, 28℃), 將培養(yǎng)菌分別置于5個50 mL的錐形瓶中, 每瓶10mL菌液, 分別加入濃度為0、1、2、4、8 μg/mL的和厚樸酚, 在28℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至A600=1.5時高速離心(8000×g, 1min)收集菌體。菌體采用天根細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取菌體RNA, 采用TaKaRa RNA PCR kit(AMV)試劑盒合成cDNA, SYBR Premix ExTaq試劑盒進行熒光定量PCR試驗, 通過ΔΔCt法分析氣溶素編碼基因aerA的表達(dá)水平, 以16S rRNA作為內(nèi)參。每個藥物濃度組均開展3個獨立的重復(fù)試驗。

斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌感染模型60尾健康斑點叉尾鮰分別置于3個200 L的玻璃缸中, 每組20尾, 保持水溫為28℃, 溶氧5.5—5.7 mg/L, 攻毒前暫養(yǎng)7d。嗜水氣單胞菌XS-91-4-1菌株在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(A600=1.0), 將菌液離心, 菌體用無菌PBS洗滌2次后用麥?zhǔn)媳葷峁苤貞抑?.5×108CFU/mL, 陽性對照組和治療組每條魚腹腔注射200 μL稀釋好的菌液, 陰性對照組腹腔注射200 μL無菌PBS。治療組于感染后6h后口灌20 mg/kg的和厚樸酚, 每12h一次, 連續(xù)給藥3d, 每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。

統(tǒng)計分析體外試驗數(shù)據(jù)來自3個獨立的試驗結(jié)果, 以Mean±SD表示, 應(yīng)用SPSS 14.0軟件對不同處理組數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗; 存活率應(yīng)用Prism 5.0軟件進行l(wèi)og-rank分析。0.01＜P＜0.05代表差異顯著,P＜0.01代表差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚對嗜水氣單胞菌生長的影響

最小抑菌濃度試驗結(jié)果表明和厚樸酚、恩諾沙星對嗜水氣單胞菌XS-91-4-1的MIC分別為32和4 μg/mL, 該結(jié)果提示和厚樸酚對嗜水氣單胞菌XS-91-4-1有一定的抑菌活性, 而該菌株對恩諾沙星呈現(xiàn)一定程度的耐藥。當(dāng)采用不同濃度梯度的和厚樸酚與該菌株共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn), 和厚樸酚濃度在16 μg/mL以下時對嗜水氣單胞菌XS-91-4-1的生長幾乎無影響(圖1), 該結(jié)果提示和厚樸酚在亞抑菌濃度下對嗜水氣單胞菌的生長無抑制作用。

2.2 和厚樸酚抑制嗜水氣單胞菌上清液的溶血活性

通過溶血試驗發(fā)現(xiàn)和厚樸酚能劑量依賴性的降低和厚樸酚與嗜水氣單胞菌XS-91-4-1菌株共培養(yǎng)上清液的溶血活性。當(dāng)和厚樸酚的濃度分別為1、2、4、8 μg/mL時, 嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物上清的溶血活性從無藥物處理組的83.65%分別下降至65.33%、55.27%、36.48%和18.95% (圖2)。

2.3 和厚樸酚抑制嗜水氣單胞菌氣溶素的表達(dá)

通過溶血試驗表明, 和厚樸酚處理后可以降低嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物上清的溶血活性, 為了進一步證實該抑制作用是否由于和厚樸酚處理后抑制了嗜水氣單胞菌氣溶素的表達(dá)而導(dǎo)致的, 本研究通過蛋白免疫印跡試驗分析了共培養(yǎng)上清液中氣溶素的含量。不同濃度和厚樸酚與嗜水氣單胞菌共培養(yǎng)后能降低其培養(yǎng)物上清液中氣溶素的表達(dá)量(圖3)。

圖1 和厚樸酚與嗜水氣單胞菌共培養(yǎng)后的生長曲線Fig. 1 Growth curves of A. hydrophila co-cultured with different concentrations of honokiol

圖2 和厚樸酚與嗜水氣單胞菌XS-91-4-1共培養(yǎng)上清的溶血活性Fig. 2 Hemolytic activity of supernatants of A. hydrophila XS-91-4-1 co- cultured with honokiol

圖3 嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物上清中氣溶素的表達(dá)量Fig. 3 Expression of aerolysin in A. hydrophila supernatant

2.4 和厚樸酚抑制嗜水氣單胞菌aerA基因的轉(zhuǎn)錄

嗜水氣單胞菌氣溶素是由aerA編碼的蛋白, 本研究通過熒光定量PCR法分析了和厚樸酚對嗜水氣單胞菌氣溶素編碼基因轉(zhuǎn)錄的影響。如圖4所示, 與空白組相比, 和厚樸酚處理后嗜水氣單胞菌aerA基因的轉(zhuǎn)錄降低, 當(dāng)藥物濃度為8 μg/mL時aerA基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)了5.26倍。

2.5 和厚樸酚治療能降低斑點叉尾鮰感染模型的死亡率

根據(jù)體外試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)和厚樸酚能顯著降低氣溶素的表達(dá), 提示其對斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌感染模型有潛在的治療作用。治療試驗發(fā)現(xiàn), 陽性對照組8d內(nèi)存活率為10%(圖5), 感染魚出現(xiàn)了體表潰瘍等癥狀; 口灌20 mg/kg和厚樸酚的試驗魚存活率為70%(圖5); 陰性對照組存活率為100%(圖5);與陽性對照組相比, 和厚樸酚治療后其存活率顯著提高。該結(jié)果表明, 和厚樸酚對斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌感染具有良好的治療效果。

圖4 和厚樸酚對aerA基因表達(dá)的影響Fig. 4 The effect of honokiol on the expression of aerA gene

圖5 和厚樸酚對斑點叉尾鮰嗜水氣單胞菌感染模型的治療作用Fig. 5 The protective effect of honokiol against A. hydrophila infection in a channel catfish model

3 討論

抗生素是20世紀(jì)醫(yī)學(xué)上最偉大的發(fā)現(xiàn)之一, 成為治療動物和人類細(xì)菌性感染的主要手段, 有力保障了人類健康和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[11]。自青霉素應(yīng)用于臨床治療細(xì)菌性感染后, 大量的抗生素被相繼發(fā)現(xiàn)[12]。盡管抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)和使用為臨床治療細(xì)菌性感染做出了巨大貢獻(xiàn), 但由于長期的不合理使用導(dǎo)致了大量耐藥菌甚至多重耐藥菌的產(chǎn)生[13]。自20世紀(jì)60年代開始, 化學(xué)抗菌藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用日益廣泛, 但隨后也帶來了嚴(yán)重的耐藥性問題, 對人類的健康也造成了潛在的威脅[14]。因此, 亟待研發(fā)新的抗菌藥物以應(yīng)對耐藥菌感染的挑戰(zhàn)?？苟玖λ幬锸墙陙硌芯康臒狳c之一, 該類藥物不會對病原菌的生存造成選擇性壓力, 因此不易導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生[15]。

成孔毒素(Pore-forming toxins, PFTs)在細(xì)菌致病過程中其重要作用, 是一種潛在的抗毒力藥物研究靶標(biāo), 如金黃色葡萄球菌溶血素、肺炎鏈球菌溶血素和嗜水氣單胞菌氣溶素等[16]。Chakraborty等[8]構(gòu)建了嗜水氣單胞菌氣溶素缺失菌株, 通過他們的研究發(fā)現(xiàn), 氣溶素缺失后該菌株對中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯著下降, 對小鼠動物模型的致病劑量顯著上升, 而回補菌株又獲得了與野生型菌株類似的致病力。Rama 等[17]研究發(fā)現(xiàn), 迷迭香酸能通過抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)降低嗜水氣單胞菌毒力因子的表達(dá)而降低其致病力。杜娜等[18]研究發(fā)現(xiàn), 腹腔注射氣溶素抗血清對異育銀鯽嗜水氣單胞菌感染有較好的保護作用。以上研究表明, 氣溶素可以作為研究抗嗜水氣單胞菌感染藥物研究的靶標(biāo)。

和厚樸酚是一種木質(zhì)素類化合物, 通過最小抑菌濃度測定發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗菌活性。但通過生長曲線試驗發(fā)現(xiàn), 和厚樸酚在亞抑菌濃度下(8 μg/mL及以下濃度)對受試嗜水氣單胞菌的生長沒有影響。Meng等[19]研究發(fā)現(xiàn), 和厚樸酚與李斯特桿菌(Listeria monocytogenes)共培養(yǎng)后能通過抑制其溶血素編碼基因hly轉(zhuǎn)錄而降低其溶血素在培養(yǎng)物上清中的表達(dá)量, 從而降低李斯特桿菌的致病力。但和厚樸酚對嗜水氣單胞菌氣溶素表達(dá)的抑制作用尚未有報道。通過本研究發(fā)現(xiàn), 1 μg/mL以上濃度的厚樸酚對嗜水氣單胞菌氣共培養(yǎng)物上清的溶血活性有極顯著的抑制作用; 蛋白免疫印記和熒光定量PCR試驗發(fā)現(xiàn)和厚樸酚能通過抑制氣溶素編碼基因aerA的轉(zhuǎn)錄而降低上清液中氣溶素的含量。陳江鳳等[20]研究了碳酸氫鈉對嗜水氣單胞菌氣溶素基因表達(dá)的影響, 發(fā)現(xiàn)添加碳酸氫鈉能降低氣溶素基因等毒力因子的表達(dá), 從而提高嗜水氣單胞菌對斑馬魚(Barchydanio rerio var)的致死劑量。但該研究中碳酸氫鈉的劑量較高, 如作為內(nèi)服制劑在動物體內(nèi)難以達(dá)到有效濃度。本試驗在體外研究部分為了提高和厚樸酚的溶解性將其溶解在二甲基亞砜(DMSO)中, 制備了濃度為40960 μg/mL的儲液; 體內(nèi)試驗時采用40% PEG400作為溶劑制備了和厚樸酚乳化劑, 當(dāng)給斑點叉尾鮰灌服20 mg/kg劑量時取得了顯著(P=0.0019)的治療效果[21]。因此, 厚樸酚可以作為治療斑點叉尾鮰耐藥性嗜水氣單胞菌感染的候選藥物。