番木瓜離體培養(yǎng)再生體系研究進(jìn)展

幸潔華 陳愛君 戴沛美 林楚芳 涂紅艷

摘 要：雜交育種是番木瓜傳統(tǒng)的育種方式，但育種難度大，費(fèi)時(shí)且雜交成本較高。采用組織培養(yǎng)方法可以快速實(shí)現(xiàn)番木瓜優(yōu)良品種種苗的繁殖，降低育種成本和難度，保證品種純度。高效離體培養(yǎng)再生體系的建立是番木瓜組織培養(yǎng)實(shí)用化的首要條件，其中外植體的選擇和培養(yǎng)條件尤為重要。本文綜述了番木瓜離體培養(yǎng)植株再生的器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，并對(duì)兩種途徑中不同外植體誘導(dǎo)效率及培養(yǎng)條件進(jìn)行比較，以期為番木瓜植株再生體系研究提供參考。

關(guān)鍵詞：番木瓜 離體培養(yǎng) 再生體系 器官發(fā)生 體細(xì)胞胚胎發(fā)生

中圖分類號(hào)：S667.9? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： The traditional breeding method of Carica papaya is hybrid breeding， which is difficult， time-consuming and costly. Tissue culture is economic， efficient， and practical for the production of pure and excellent varieties of Carica papaya. Explants and culture conditions are especially important for the establishment of high efficient regeneration system in tissue culture of Carica papaya. This article reviews the organogenesis and somatic embryogenesis of plant regeneration in tissue culture of Carica papaya， and compares their induction efficiencies and culture conditions in order to provide references for the further research of regeneration plant system of Carica papaya.

Key words： Carica papaya; in vitro culture; regeneration system; organogenesis; somatic embryogenesis

番木瓜（Carica papaya）俗稱乳瓜、萬(wàn)壽果，是番木瓜科（Caricaceae）番木瓜屬（Carica）多年生草本植物[1]，是熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要水果。番木瓜果實(shí)風(fēng)味好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，此外，番木瓜還具有重要的工業(yè)價(jià)值。

雜交育種是番木瓜傳統(tǒng)的育種方式，但是育種時(shí)間長(zhǎng)、成本較高，且番木瓜植株性別復(fù)雜，種子不耐藏，自然發(fā)芽率不高[2]等因素也影響育種效率。番木瓜屬于異花授粉植物，后代性狀分離嚴(yán)重，個(gè)體抗病性差異很大，用種子繁殖的育種方式難以保持優(yōu)良種質(zhì)特性[3]。環(huán)斑病毒病引起番木瓜產(chǎn)量下降，是目前阻礙番木瓜產(chǎn)業(yè)的主要因素。預(yù)防此病的主要手段是制備轉(zhuǎn)基因番木瓜植株[4]，但是在一定程度上也影響了消費(fèi)者的選擇。建立番木瓜離體器官植株再生途徑培育組培幼苗，可以克服常規(guī)育種的缺陷，實(shí)現(xiàn)規(guī)模化種苗的生產(chǎn)，也是獲得無毒種苗的途徑。再生植株體系的建立有利于創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，如具有抗逆性及功能性的種質(zhì)資源，這將大大提高番木瓜育種水平。

器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞胚胎（簡(jiǎn)稱體胚）發(fā)生途徑是兩種常用的番木瓜離體植株再生途徑。器官發(fā)生是指外植體在離體培養(yǎng)條件下形成根、莖、芽、花、枝條等器官的過程。體胚發(fā)生是指體細(xì)胞組織在離體培養(yǎng)條件下產(chǎn)生與正常受精卵發(fā)育方式類似的胚胎結(jié)構(gòu)[5]。

植物的器官發(fā)生和體胚發(fā)生均可通過直接和間接發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)。直接途徑是指從外植體上直接誘導(dǎo)出芽或體胚，間接途徑是指外植體先經(jīng)過誘導(dǎo)獲得愈傷組織，再由愈傷組織誘導(dǎo)出芽或體胚。本文主要對(duì)番木瓜離體再生體系的器官直接發(fā)生途徑和體胚間接發(fā)生途徑進(jìn)行了總結(jié)和討論。

1 番木瓜離體植株再生體系的器官發(fā)生途徑

1.1 以不同外植體建立器官發(fā)生途徑

1.1.1 以側(cè)芽為外植體誘導(dǎo)器官發(fā)生

利用側(cè)芽使成熟番木瓜植株再生，成活率很低[6]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用側(cè)芽的誘導(dǎo)植株再生的技術(shù)得到改善，其再生植株的成活率得到有效的提高。將番木瓜的側(cè)芽作為外植體，在含有MS+BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 1 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，芽誘導(dǎo)率達(dá)40 %左右[7]。湯亞飛等[8]將番木瓜“穗黃”側(cè)芽接種于MS+BA 1 mg/L培養(yǎng)基中獲得不定芽，接著在2/3 MS+BA 0.4 mg/L+GA3 0.3 mg/L培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，也取得較好的誘導(dǎo)率;陳健等[9]用類似的方法和激素誘導(dǎo)的芽增殖系數(shù)為4.7。后有研究發(fā)現(xiàn)，番木瓜的側(cè)芽經(jīng)MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，再接種于MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 0.2? mg/L+ AD（腺嘌呤）2.0 mg/L培養(yǎng)基上，其增殖倍數(shù)高可達(dá)6.7倍[10]。除了利用BA、GA3、NAA來誘導(dǎo)芽，還有利用其他試劑來誘導(dǎo)的，效果也較好，如在MS+NAA 0.02 mg/L+BAP（苯并芘）0.2 mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽，出芽率可達(dá)50 %[11];用甘氨酸100 mg/L處理的番木瓜芽增殖率最高，用精氨酸100 mg/L處理的番木瓜芽長(zhǎng)最高，添加活性炭和氯化鈷處理的番木瓜芽增殖率和芽長(zhǎng)也得到增加[12]。

對(duì)側(cè)芽誘導(dǎo)后的組培苗進(jìn)行生根，發(fā)現(xiàn)IBA的濃度對(duì)番木瓜不定芽的生根率影響較大。較高濃度的IBA有利于番木瓜不定芽根系的誘導(dǎo)，選擇的基本培養(yǎng)基和NAA濃度范圍對(duì)出根率影響不顯著[9]。王麗萍等[13]發(fā)現(xiàn) IBA濃度為1 mg/L時(shí)，番木瓜誘導(dǎo)生根效果最好，生根率高達(dá)82.63 %，且生根長(zhǎng)勢(shì)較好，而隨著IBA濃度的增高，生根率降低，根數(shù)減少且質(zhì)量也差，這與王龍甫[10]的研究一致。但有研究表明，在IBA濃度為4 mg/L時(shí)，生根率最高可達(dá)90 %，移栽成活率達(dá)84 %[14]。Bindu等[12]在附加IBA 3 mg /L和AC 0.05 %的MS培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)的根更多。張秀春等[11]將誘導(dǎo)的不定芽在MS+IBA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，一周后再轉(zhuǎn)接至1/2MS與蛭石1∶2混合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根誘導(dǎo)率達(dá)90%以上[11]。

番木瓜組培苗的生根存在著品種或基因依賴性。不同品種在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)生根作用下，其生根率不同。在相同的生根環(huán)境下，番木瓜“梭羅”品種的生根率比“蜜紅”品種的生根率高出20 %左右[15]。

1.1.2 以莖段為外植體誘導(dǎo)器官發(fā)生

將番木瓜無菌種子苗的莖段作為外植體，接種到MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.01 mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出芽，平均增殖系數(shù)為5.2，接到MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L繼代增殖培養(yǎng)基時(shí)增殖系數(shù)高達(dá) 7.92，而且幼苗長(zhǎng)勢(shì)較好[16]。而在含有6-BA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基中，番木瓜莖段可以誘導(dǎo)出較多的芽，且芽苗態(tài)正常，基部有愈傷組織生成[17]。葉維雁等[18]發(fā)現(xiàn)較高濃度的6-BA（高于0.5 mg/L）會(huì)降低出芽率，以0.5 mg/L為最佳，同時(shí)，加以低濃度 NAA對(duì)腋芽萌芽率的提高具有顯著促進(jìn)作用，如在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中，腋芽萌芽率可達(dá)76.67%;“漳紅”番木瓜的莖段在激素組成為BA 0.6 mg/L+KT 0.2 mg/L+NAA 0.15 mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的芽增殖效果較好，且苗木長(zhǎng)勢(shì)好[7]。

不同的培養(yǎng)基會(huì)影響莖段誘導(dǎo)的試管苗的生根率。MS的水平、IBA、NAA、AC（活性炭）的濃度過高或過低均會(huì)影響番木瓜的生根率，且影響程度為 IBA>AC>NAA>MS培養(yǎng)基，最佳誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基配方為MS+IBA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+AC 0.02 g/L[19]。還有研究表明，莖段在1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后再進(jìn)行生根培養(yǎng)，那么生根率和每株生根數(shù)均顯著高于不定芽直接進(jìn)行生根培養(yǎng)獲得的生根率和每株生根數(shù)[18]，推測(cè)原因是，經(jīng)1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)后的不定芽體內(nèi)較高濃度的6-BA和KT得到一定程度的稀釋。

通過比較分析，可以認(rèn)為在以莖段作為外植體進(jìn)行番木瓜植株再生過程中，前期的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA的濃度對(duì)于出芽有較大的影響，以0.5 mg/L為最佳。后續(xù)的試管苗生根的誘導(dǎo)中，一定濃度的IBA和AC會(huì)促進(jìn)根生長(zhǎng)。

1.1.3 以胚軸為外植體誘導(dǎo)器官發(fā)生

以胚軸為外植體再生番木瓜植株的方法簡(jiǎn)單，由于再生植株是直接發(fā)育而不受愈傷組織期的干擾，避免了再生體間的體細(xì)胞無性系變異，重現(xiàn)性也比較好。以胚軸為外植體再生番木瓜植株的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是胚軸誘導(dǎo)出芽。在含有添加不同濃度的TDZ（噻苯?。┑腗S培養(yǎng)基上誘導(dǎo)以番木瓜上胚軸段為外植體的不定芽，以TDZ 0.55 mg/L效果佳：芽再生頻率最高和每株外植體形成最多的芽[20]。將番木瓜無菌苗的下胚軸莖段作為外植體誘導(dǎo)芽時(shí)，在MS+6-BA 0.75 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中可獲得93.3 %的出芽率，而當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)出芽率僅為40%，6-BA濃度調(diào)至1 mg/L時(shí)，出芽率為66.6 %，可以看出，過高或過低的6-BA濃度可能對(duì)下胚軸莖段出芽的誘導(dǎo)具有抑制作用[21]。

1.1.4 以莖尖為外植體誘導(dǎo)器官發(fā)生

莖尖的分化程度較低，是生產(chǎn)脫毒苗的理想材料，同時(shí)利用莖尖培育的再生植株成活率相對(duì)較高[22]。

1989年我國(guó)首次報(bào)道番木瓜大田苗莖尖和側(cè)芽離體培養(yǎng)成功[3]。莖尖在添加BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上，芽誘導(dǎo)增殖系數(shù)較高，可達(dá)6倍以上[23，24]，且誘導(dǎo)的芽生長(zhǎng)速度快[25]。但也有研究表明，BA 0.8 mg/L+NAA 0.2 mg/L的激素組合培養(yǎng)基最適合莖尖誘導(dǎo)芽，誘導(dǎo)成苗率可達(dá)87.6 %，增殖系數(shù)可達(dá)8。而將BA的濃度增加至0.8～1.5 mg/L時(shí)，不僅不能提高增殖系數(shù)，反而增加了芽苗的玻璃化率及變異率[26]。

除了激素，蔗糖的濃度也會(huì)影響莖尖的誘導(dǎo)效果，如隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的提高，番木瓜試管苗的株高顯著降低，芽增殖系數(shù)顯著增加[26]。

以莖尖為外植體誘導(dǎo)的試管苗不僅誘導(dǎo)率較好，而且生根率和移栽成活率也高。如將番木瓜的無菌芽繼代生根，在MS+IBA 1.5 mg/L+AC（>2 g/L）的生根培養(yǎng)基上，可正常生根，并可以形成完整的植株，將試管苗移栽到室外，成活率達(dá)80 %[23]。在添加1/2MS+IBA 0.3 mg/L培養(yǎng)基上，試管苗的生根率達(dá)到89.3%，大規(guī)模移栽的成活率高達(dá)90%以上[26]。在IBA 0.75 mg/L+NAA 0.05 mg/L+KT 0.01 mg/L的生根培養(yǎng)基中，平均催根率達(dá)到81.1%;將誘導(dǎo)生根后的組培苗置于50 mg/L的生根劑（雙吉爾-GGR）里浸泡8 h，平均成活率達(dá)到91.1 %，且番木瓜苗生長(zhǎng)速度很快，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)[25]。

可以看出以番木瓜莖尖為外植體，無論是其芽的誘導(dǎo)增殖率、根的誘導(dǎo)率、移栽成活率，都普遍較高，效率可達(dá)80 %以上，且試管苗的生長(zhǎng)較好，是比較理想的外植體材料。

1.2 以不同外植體建立器官發(fā)生途徑的比較

1.2.1 不同外植體器官發(fā)生的效率比較

不同的外植體離體器官誘導(dǎo)成苗各有優(yōu)劣。如以側(cè)芽誘導(dǎo)時(shí)，雖然生根率較高，但是芽誘導(dǎo)率和增殖率較低。莖段的芽增殖系數(shù)較高，幼苗長(zhǎng)勢(shì)也較好，但是莖段腋芽的出芽率低，且生根率和移栽成活率較低。以胚軸誘導(dǎo)時(shí)，出芽率和生根率均很高，但可能使用不是很多。而以番木瓜莖尖為外植體，無論是其芽的誘導(dǎo)增殖率、根的誘導(dǎo)率、移栽成活率，都普遍較高，且莖尖建立培養(yǎng)體系的時(shí)間較短，但采集莖尖對(duì)有限的優(yōu)良兩性株是一種損失。綜合來看，莖尖更適合作為外植體進(jìn)行番木瓜的離體再生。但是，番木瓜具有基因或品種依賴性，同一外植體不同品種也會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)效率不同。

1.2.2 不同外植體器官發(fā)生的培養(yǎng)條件比較

在以不同外植體進(jìn)行番木瓜離體器官發(fā)生時(shí)，施加外源植物激素的種類和濃度對(duì)離體器官的再生起著重要作用，特別是NAA和6-BA這兩種激素。NAA和6-BA濃度過高或者過低都會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)效率低下，綜合上述來看，以番木瓜離體器官作為外植體進(jìn)行芽誘導(dǎo)時(shí)，BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L誘導(dǎo)效果較好[10，16，18，23-25]。

2 番木瓜離體植株再生體系的體胚發(fā)生途徑

2.1 以不同外植體建立體胚發(fā)生途徑

2.1.1 以胚珠為外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生

Litz等[27]于1982年，首次將胚珠誘導(dǎo)愈傷組織，在此基礎(chǔ)上誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚，并再生植株獲得成功。對(duì)番木瓜“穗中紅”和“園優(yōu)一號(hào)”兩個(gè)品種的受精胚珠進(jìn)行培養(yǎng)，在含有改良MS+ADS（硫酸腺嘌呤）160 mg/L+NAA 1 mg/L+BA 0.5 mg/L+GA3 1 mg/L +蔗糖 4%培養(yǎng)基中，可以獲得理想胚性愈傷組織和體胚，接著在MS+ADS 160 mg/L+NAA 1 mg/L+KT 0.5 mg/L+GA3 1 mg/L+蔗糖 4 %培養(yǎng)基中體胚產(chǎn)生正常具三裂片和根系的小植株[28]。可以看出，在依賴于培養(yǎng)基外源激素條件下，即NAA（或IAA）、BA（或KT）和GA的特定配比組合，以胚珠作為外植體可以誘導(dǎo)胚珠愈傷組織及胚性愈傷組織，體胚可以發(fā)育成苗，并能產(chǎn)生正常的具三裂片葉片的完整植株。

2.1.2 以子葉為外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生

以番木瓜“穗中紅”和“Hawaii solo Sunset”兩個(gè)品種的小芽子葉為外植體，在MS+2，4-D 1 mg/L+BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基上，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)94.93 %，5周后子葉全部愈傷化;將獲得的愈傷組織接種于MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+CH（水解酪蛋白）500 mg/L培養(yǎng)基，獲得的體胚多且能正常成苗;同時(shí)發(fā)現(xiàn)添加ADS 160 mg/L+CH 500 mg/L雖能顯著提高體胚的發(fā)生率，但是增加了畸形胚的比率，有的畸形胚發(fā)育到最后僅有一片葉[29]。

蔡雪玲等[30]將2個(gè)番木瓜品種的子葉接種于改良MS（有機(jī)元素全量，其他元素減半）+2，4-D 1 mg/L+KT 1 mg/L+Gln（谷氨酰胺）0.4 g/L+AC 1 g/L培養(yǎng)基中，愈傷組織的誘導(dǎo)率低至0～3.9 %。此結(jié)果與曾繼吾等[29]的研究結(jié)果不盡相同，可能原因是所取子葉日齡不同。曾繼吾選用的子葉較成熟，幼苗已經(jīng)長(zhǎng)出了葉片，而蔡雪玲選取的是剛剛展開的子葉，葉齡較短[30]?？梢钥闯?，子葉日齡會(huì)影響愈傷組織的誘導(dǎo)率，子葉日齡越大則誘導(dǎo)率越低，因此在用子葉作為外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生時(shí)，應(yīng)取葉齡較年輕的子葉。

2.1.3 以幼胚為外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生

將番木瓜的幼胚作為外植體，在MS+2，4-D 1 mg/L+BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)85.6 %[29]。當(dāng)開花后自然授粉低于90 d的幼胚完全不能夠誘導(dǎo)愈傷組織，大于120 d的效果較差，而處于90～120 d的幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的效果最佳[31]，這一點(diǎn)并與Fitch 等[32]的研究結(jié)果較一致。當(dāng)2，4-D濃度控制在0～10 mg/L的范圍內(nèi)，番木瓜幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的增高而增加[31]，在2，4-D 10 mg/L的培養(yǎng)基較適合于番木瓜幼胚誘導(dǎo)愈傷組織、幼胚誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)和體胚誘導(dǎo)[30]。這些研究表明以適宜成熟度的幼胚為外植體可以獲得較高的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

2.1.4 以葉片為外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生

周鵬等[33]以番木瓜實(shí)生苗葉片為外植體，在MS+KT 0.5 mg/L+2，4-D 1 mg/L+蔗糖3 %～4 %培養(yǎng)基上可以誘導(dǎo)出愈傷組織，并獲得胚狀體及不定芽再生植株，在一定培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)得到植株。以番木瓜 “漳紅”品種組培苗的葉片和葉柄為外植體，在改良MS（有機(jī)元素全量，其他元素減半）+2，4-D 1 mg/L+BA 0.5 mg/L+KT 0.5mg/L+Glu（葡萄糖）400 mg/L+蔗糖3 %的固體培養(yǎng)基上，可以誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織。采用兩步生根法，將胚性愈傷所形成的體胚再生植株先接種于1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+AC 1mg/L的固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)移至1/2 MS+AC 1g/L+VB2 9.4 mg/L的固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，生根效果最好，移栽成活率可達(dá)45 %以上 [34]。以番木瓜葉片為外植體，在改良MS（有機(jī)元素全量，其他元素減半）+2，4-D 10 mg/L+NAA 5 mg/L+KT 2 mg/L+BA 0.5 mg/L+AC 1 g/L培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織的比例達(dá)78 %，但質(zhì)量較差，而且體胚發(fā)生率極低，只有7.84 %[30]。

可以看出，以葉片為外植體誘導(dǎo)體胚時(shí)，獲得的愈傷組織質(zhì)量較差，體胚發(fā)生率也不高，推測(cè)原因是葉片屬于分化程度較高的器官，相比未成熟胚等一些來自于胚或者幼嫩組織，其胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及體胚發(fā)生的難度較高。

2.1.5 以莖為外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生

Yie等 [35]將番木瓜的莖段接種在NAA 1 mg/L+ KT 0.1 mg/L的培養(yǎng)基中，獲得愈傷組織，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有低濃度IAA（0～0.5 mg/L）和較高濃度KT（1～2 mg/L）的培養(yǎng)基，可再生得到苗和胚狀體。 在MS+NAA 2 mg/L+KT 1 mg/L+GA 1 mg/L +AC 0.2 mg/L培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)番木瓜莖的愈傷組織生長(zhǎng)量和體胚生長(zhǎng)量多，且成熟體胚在不含激素的培養(yǎng)基上成苗率高達(dá)71.8 %[36]。在1/2 MS+2，4-D 2 mg/L+Glu 400 mg/L+蔗糖6%培養(yǎng)基，也可以將番木瓜的莖段誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，進(jìn)而誘導(dǎo)長(zhǎng)出胚狀體[37]。

2.1.6 以根為外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生

關(guān)于用根誘導(dǎo)番木瓜愈傷組織研究較早，根作為外植體的愈傷發(fā)生率較低。Chen等[38]用根作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得的愈傷組織較少，但每個(gè)外植體的愈傷組織可產(chǎn)生100多個(gè)體細(xì)胞胚。將番木瓜的根為外植體時(shí)，在含有改良MS（1/2MS無機(jī)鹽+B5維生素+CH 500 mg/L+谷氨酞胺 200 mg/L+甘氨酸2 mg/L）+NAA 2 mg/L+KT 1 mg/L+GA 1 mg/L+AC 2 g/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織和體胚的效果最佳，如可以獲得中等數(shù)量的愈傷組織和大量的體胚;在體胚誘導(dǎo)成再生植株過程中，在MS0（不含激素）培養(yǎng)基上體胚的愈傷化很少，成苗率最高，達(dá)到71.8 %，但生長(zhǎng)較為緩慢[36]。

將番木瓜幼根接種于附加NAA 1 mg/L+KT 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L的改良MS（1/2 MS無機(jī)鹽+B5維生素+CH 500 mg/L+谷氨酞胺 200 mg/L+甘氨酸2 mg/L）培養(yǎng)基上，可以獲得100 %的誘導(dǎo)率，并且大量的愈傷組織并具有良好的胚性潛能;在含有NAA 0.25 mg/L+KT 0.25 mg/L的改良MS（1/2MS無機(jī)鹽+B5維生素+CH 500 mg/L+谷氨酞胺 200 mg/L+甘氨酸2 mg/L）培養(yǎng)基上，愈傷組織可以連續(xù)繼代并得到大量體胚[39]。此外，單獨(dú)添加NAA或者GA并不適合體胚的發(fā)育，而KT有利于體胚的發(fā)育，且濃度為 0.5 mg/L最佳。同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明1～3 g/L的活性炭有利于以根為外植體誘導(dǎo)的體胚發(fā)生[39]。

2.1.7 以胚軸為外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生

以“夏威夷”番木瓜的四個(gè)品種的下胚軸作為外植體，接種于改良的MS培養(yǎng)基中，均可以誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，在相同的條件下，四個(gè)番木瓜品種的誘導(dǎo)效率不同[40]，由此可以看出番木瓜品種會(huì)影響誘導(dǎo)效率。將下胚軸作為外植體，在含有椰乳、ABA（脫落酸）及蔗糖的MS固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織，經(jīng)分化培養(yǎng)可以獲得番木瓜子葉型胚狀體，而后接種于1/2 MS培養(yǎng)基中，植株再生率約78 %，煉苗成活率可達(dá)95 %以上[41]。該研究表明，在培養(yǎng)基中添加ABA可抑制體胚細(xì)胞過速分裂而產(chǎn)生次生胚，并能提高子葉正常胚的發(fā)生頻率，推測(cè)可能的原因是ABA能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存物質(zhì)（蛋白質(zhì)、甘油三酯類、脂類等）產(chǎn)量的增加，進(jìn)而提高糖類的攝取量或淀粉的合成量，使胚狀體的形態(tài)和生理發(fā)生變化[41]。還有研究表明，培養(yǎng)基MS+2，4-D 10 mg/L+NAA 5 mg/L+KT 2 mg/L+BA 0.5 mg/L+AC 1 g/L適合幼胚誘導(dǎo)愈傷組織，但是同樣也適合下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)，并且誘導(dǎo)率較高，為70.59 %，但體胚發(fā)生率極低，只有3.64 % [30]。

2.2 以不同外植體建立體胚發(fā)生途徑的比較

2.2.1不同外植體體胚發(fā)生的效率比較

外植體類型和狀況是成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的關(guān)鍵。來源于不同器官外植體，誘導(dǎo)愈傷組織和體胚的能力是不同的。從上述分析可以看出，誘導(dǎo)體胚發(fā)生的最佳材料是細(xì)胞分裂旺盛的幼嫩組織，如子葉、幼胚。幼胚不僅容易產(chǎn)生胚性愈傷組織，而且胚胎發(fā)生能力強(qiáng)，是誘導(dǎo)體胚的理想材料[30]。番木瓜幼胚的成熟程度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響不同，開花后自然授粉90～120 d的幼胚效果為最佳[31]。此外，以幼胚誘導(dǎo)體胚的實(shí)驗(yàn)操作較簡(jiǎn)單、用時(shí)較短、材料可充分利用。

葉片和葉柄分化程度較高，愈傷誘導(dǎo)分化能力低于幼胚。根作為外植體的愈傷發(fā)生率比莖作為外植體的低，但來自根的愈傷組織分化體胚的能力較莖的高。番木瓜子葉日齡對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率有影響，葉齡較短的子葉誘導(dǎo)效果為最佳。

2.2.2 不同外植體體胚發(fā)生的培養(yǎng)條件比較

體胚發(fā)生的培養(yǎng)效果很大程度上受到培養(yǎng)基的影響，培養(yǎng)基各成分的組成與比例直接影響著誘導(dǎo)效果甚至試驗(yàn)的成敗。在體胚發(fā)生過程中，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的種類及比例在胚性愈傷組織誘導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用，生長(zhǎng)素包括2，4-D、IAA、NAA等，細(xì)胞分裂素包括6-BA、KT等。如在以子葉、幼胚、葉片、莖、下胚軸等作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，培養(yǎng)基中都添加一定濃度的2，4-D，一般為1 mg/L[29，30，33，34]。NAA+ KT+ GA或NAA+6-BA+ GA的激素組合培養(yǎng)基常用于胚珠、根、莖等外植體的誘導(dǎo)[28，36，37，39]。

ABA與細(xì)胞胚性啟動(dòng)和表達(dá)有關(guān)，因此添加ABA可促進(jìn)愈傷組織的體胚發(fā)生[41]。培養(yǎng)基中的碳源主要為蔗糖，作為外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)的滲透壓調(diào)節(jié)物和能源，對(duì)胚狀體的發(fā)育有重要影響，其濃度一般控制在3 %～6 %[28，33，34，37]。

3 小結(jié)與展望

以離體器官和體胚為外植體建立番木瓜再生體系是目前常用的育種手段，在實(shí)際應(yīng)用中效率、時(shí)間等各有不同。以器官發(fā)生途徑建立番木瓜再生體系，其難度要求較低，操作較方便，培養(yǎng)周期較短，出苗較快。以體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑建立番木瓜再生體系，可以獲得數(shù)量較多的體胚細(xì)胞，且遺傳穩(wěn)定、繁殖速度快，但是誘導(dǎo)周期較長(zhǎng)，體細(xì)胞胚胎并不能全部萌發(fā)成正常苗。而且，器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生的效率都會(huì)與外植體的類型和培養(yǎng)條件密切有關(guān)。因此建立番木瓜再生體系需要依據(jù)品種等實(shí)際因素選擇合適的外植體并控制適宜的培養(yǎng)條件。

薄片培養(yǎng)可能是將來番木瓜離體培養(yǎng)再生體系的方向。薄片培養(yǎng)是將外植體橫切成厚約0.3～1.0 mm的薄片，在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，也是獲得再生植株的一種方式。該培養(yǎng)方式具有材料范圍廣、激素用量少、培養(yǎng)周期短、再生頻率高等優(yōu)點(diǎn)[42]。隨著研究的深入，番木瓜的再生體系會(huì)不斷完善，為縮短番木瓜育種年限、降低育種難度和提高番木瓜的種質(zhì)特性提供可行的手段。

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