羅 燕，施軍平

1 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺(tái)， 杭州 310015; 2 杭州師范大學(xué) 肝病與代謝研究所， 杭州 310015

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球排名第二的致死性腫瘤。隨著肥胖和糖尿病的流行，非酒精性脂肪性肝炎/非酒精性脂肪性肝病(NASH/NAFLD)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為西方發(fā)達(dá)國(guó)家HCC的主要病因之一[1]。NAFLD的疾病譜包括單純性脂肪肝、NASH、肝纖維化、肝硬化和HCC。盡管在我國(guó)病毒性肝炎仍為當(dāng)前HCC的首要病因，隨著NAFLD患病率逐年增高，NAFLD相關(guān)HCC(NAFLD-HCC)的發(fā)病率也在悄然上升。相對(duì)于病毒性肝炎相關(guān)HCC，NAFLD-HCC病程更隱匿，其腫瘤往往更大，預(yù)后更差[2]。目前，臨床上尚缺乏治療NASH的特效藥物，也無(wú)有效手段預(yù)防NAFLD-HCC的發(fā)生。因此，加強(qiáng)對(duì)NAFLD-HCC發(fā)病機(jī)制研究，尋找有效的預(yù)防及治療NAFLD-HCC的藥物和手段具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 臨床特征

NAFLD是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)。目前，NAFLD在世界范圍內(nèi)的患病率為25%～30%，約4%～22%的HCC病例歸因于NAFLD[3]。NAFLD已成為隱源性肝硬化和原因不明HCC的常見(jiàn)病因。一項(xiàng)大規(guī)模的回顧性隊(duì)列研究[4]結(jié)果表明，采用超聲診斷NAFLD患者發(fā)展為HCC的年發(fā)病率為0.043%。Bengtsson等[5]對(duì)2004年-2017年在瑞典卡羅琳斯卡大學(xué)醫(yī)院就診的1562例HCC患者分析發(fā)現(xiàn)，37%的NAFLD-HCC患者無(wú)肝硬化，且90%的非肝硬化NAFLD-HCC患者在就診時(shí)年齡≥65歲，研究證實(shí)非肝硬化HCC在NAFLD中比在其他引起HCC的病因中更常見(jiàn)，盡管在診斷時(shí)年齡較大，腫瘤較大，但非肝硬化NAFLD-HCC與其他肝癌患者的生存率相似。Leung等[2]發(fā)現(xiàn)非肝硬化NAFLD-HCC的腫瘤體積比有纖維化基礎(chǔ)的腫瘤更大，預(yù)后更差。由此可見(jiàn)，NAFLD-HCC疾病進(jìn)展隱匿，更易被忽視，往往會(huì)錯(cuò)過(guò)治療的最佳時(shí)機(jī)，深入發(fā)掘NAFLD-HCC的分子機(jī)制，制訂合理有效的防治策略具有重要的臨床意義。

2 NAFLD-HCC的分子機(jī)制

關(guān)于NASH的發(fā)病機(jī)制，目前比較公認(rèn)的“二次打擊”學(xué)說(shuō)，認(rèn)為第一次打擊主要是脂肪攝入增加、肝臟合成增加、脂肪酸β氧化障礙以及極低密度脂蛋白分泌減少引起脂質(zhì)蓄積，第二次打擊是氧化應(yīng)激進(jìn)一步導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥、壞死和纖維化。但多重打擊學(xué)說(shuō)認(rèn)為，肝臟炎癥是NASH向纖維化進(jìn)展的首要原因，而不是脂肪變性。NASH是多種因素同時(shí)作用的結(jié)果，包括遺傳變異、脂代謝異常、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙、免疫應(yīng)答改變和腸道微生物群失衡等。雖然肥胖及NASH/NAFLD促進(jìn)肝癌發(fā)生的機(jī)制目前尚不完全清楚，但多種腫瘤微環(huán)境因素，如促炎細(xì)胞因子升高、免疫細(xì)胞反應(yīng)、脂肪代謝失調(diào)、腸道微生物群改變等，均可引起或協(xié)同促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。

2.1 炎癥因子及信號(hào)通路 90%以上的HCC發(fā)生在肝臟炎癥的背景下，慢性炎癥誘發(fā)免疫細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，包括TNFα、IL-6、瘦素、脂聯(lián)素、趨化因子等。TNFα?xí)M(jìn)一步激活NF-кB和c-Jun氨基末端激酶等信號(hào)分子，造成DNA損傷，增加基因突變率。IL-6可以激活致癌轉(zhuǎn)錄因子——信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)，從而增加細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞存活、血管生成、侵襲、遷移和腫瘤的生長(zhǎng)。趨化素樣因子1可以通過(guò)IL-6/STAT3信號(hào)通路誘發(fā)在原發(fā)性肝癌中的炎癌轉(zhuǎn)化[6]。在單純性脂肪肝和NASH患者血清中瘦素的水平往往較高，瘦素與HCC細(xì)胞中相應(yīng)受體結(jié)合可激活JAK2/STAT、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶信號(hào)通路，同時(shí)可以上調(diào)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的永生化[7]。脂聯(lián)素可抑制瘦素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖和侵襲。脂聯(lián)素是一種抗炎細(xì)胞因子，由脂肪組織細(xì)胞分泌。許多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示脂聯(lián)素可以激活A(yù)MP依賴蛋白激酶(AMPK)，抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物和其他促癌信號(hào)分子，也可以通過(guò)激活A(yù)MPK增加胰島素的敏感性，減輕炎癥[8]。瘦素和脂聯(lián)素在炎癥導(dǎo)致的纖維化生成和血管生成中是相互拮抗的作用。

NAFLD-HCC的發(fā)生發(fā)展與炎癥及腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的突變有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[9]發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J小鼠長(zhǎng)期暴露于高脂飲食可導(dǎo)致NASH和自發(fā)性HCC的高發(fā)生率，對(duì)HCC小鼠腫瘤組織和非腫瘤組織的mRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，主要參與的兩個(gè)信號(hào)通路分別以Myc和NF-кB為中心。對(duì)二乙基亞硝酸(DEN)合并高脂誘導(dǎo)的ob/ob肥胖小鼠和DEN合并普通飲食誘導(dǎo)的野生型小鼠的腫瘤組織和瘤旁組織進(jìn)行全外顯子組測(cè)序及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠中有8個(gè)重要的通路存在明顯的失調(diào)，分別為Calcium信號(hào)通路、間隙連接通路、黏著斑通路、細(xì)胞因子間的相互作用、促性腺激素釋放激素信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和腫瘤信號(hào)通路。在瘦小鼠中僅有MAPK信號(hào)通路和腫瘤信號(hào)通路兩個(gè)通路改變[10]。對(duì)鏈脲佐菌素合并高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的NASH-HCC小鼠腫瘤組織與非腫瘤組織轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，主要涉及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Calcium信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路等[11]。

2.2 參與NAFLD-HCC的免疫細(xì)胞 NAFLD患者存在衰老現(xiàn)象，衰老細(xì)胞能分泌大量的炎癥因子、趨化因子等衰老相關(guān)分泌表型 (senescence associated secretory phenotype，SASP)，SASP可改變組織局部微環(huán)境，從而促進(jìn)炎癥和組織修復(fù)、血管生成、細(xì)胞增殖，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。前列腺素E2及趨化因子CCL2可以影響自身抗腫瘤免疫功能而發(fā)揮促癌作用。SASP會(huì)影響周圍實(shí)質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及免疫細(xì)胞構(gòu)成腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生[12]。

骨髓來(lái)源的抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)具有免疫抑制活性，可使癌癥逃避免疫監(jiān)測(cè)。MDSC可減少T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤，從而大大降低免疫檢查點(diǎn)治療的臨床療效[13]。在肝癌患者腫瘤組織和血液中均發(fā)現(xiàn)MDSC升高，HCC中的MDSC能夠抑制T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，激活調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞。一項(xiàng)研究[14]發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者肝X受體激動(dòng)劑GW3965耐藥與MDSC的升高有關(guān)，升高的MDSC主要是粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。MDSC還能產(chǎn)生高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶9，從細(xì)胞外基質(zhì)釋放血管生成因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管的生長(zhǎng)。

中性粒細(xì)胞是人體內(nèi)最主要的固有免疫細(xì)胞之一，在炎癥性應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。外周血中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值增高作為機(jī)體慢性炎癥狀態(tài)的標(biāo)志，是HCC在內(nèi)多種惡性腫瘤預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子[15]，且在多種腫瘤瘤體中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞募集和浸潤(rùn)?？梢?jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)這一慢性炎癥狀態(tài)是惡性腫瘤發(fā)生的重要因素。來(lái)自Hepatology的研究[16]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)DNAase干預(yù)和PAD4-/-小鼠兩種方法抑制中性粒細(xì)胞細(xì)胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NET)形成，并不會(huì)改善脂肪變，但是對(duì)炎癥有減輕作用，最終降低NASH-HCC的發(fā)生，而游離脂肪酸可以促進(jìn)NET的形成。通過(guò)綠色熒光蛋白標(biāo)記骨髓細(xì)胞發(fā)現(xiàn)NASH-HCC小鼠在12周前表現(xiàn)出中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、NET形成，而在12周后主要為巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。Bijnen等[17]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠的脂肪組織巨噬細(xì)胞可以募集中性粒細(xì)胞，從而誘導(dǎo)肝巨噬細(xì)胞積累，促進(jìn)NASH的發(fā)展。中性粒細(xì)胞釋放的彈性蛋白酶和脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2通過(guò)神經(jīng)酰胺和CXC趨化因子受體2，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在肝內(nèi)浸潤(rùn)同時(shí)激活Kupffer細(xì)胞，推動(dòng)NASH進(jìn)展[18-19]。

肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞在長(zhǎng)期慢性炎癥浸潤(rùn)刺激下可以促進(jìn)HCC的發(fā)生和發(fā)展。Kupffer細(xì)胞是定居在肝內(nèi)的固定巨噬細(xì)胞。定位于肝竇隙內(nèi)，肝臟受到損傷時(shí)可激活Kupffer細(xì)胞，免疫激活后，其表面Toll樣受體與免疫原膜表面配體結(jié)合，釋放NO、花生四烯酸、水解酶等協(xié)助破壞抗原，同時(shí)釋放各種細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、TNFα等，Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)在肝損傷修復(fù)及再生等方面有著非常重要的作用，與原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。

2.3 脂質(zhì)代謝失調(diào) 脂代謝失調(diào)是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)新標(biāo)志。傳統(tǒng)上認(rèn)為瓦博格效應(yīng)(Warburg effect)是腫瘤細(xì)胞代謝的主要特征，糖酵解產(chǎn)能是癌細(xì)胞能量的主要來(lái)源。然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞之所以生長(zhǎng)迅速且能快速適應(yīng)各種逆境，與其代謝重編程密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境的改變?nèi)缛毖?、谷氨酰胺和乳酸的含量等均?huì)影響腫瘤細(xì)胞的代謝。脂肪酸合成酶(FASN)是一個(gè)代謝性癌基因，在多種腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)升高，F(xiàn)ASN抑制劑對(duì)腫瘤的治療有積極作用[20]。Beloribi-Djefaflia等[21]對(duì)HCC進(jìn)行了全基因組表達(dá)譜和代謝譜分析，發(fā)現(xiàn)硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)參與的脂質(zhì)合成通路與HCC患者的進(jìn)展和臨床結(jié)局顯著相關(guān)。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c參與調(diào)控FASN、SCD1、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的表達(dá)，也與腫瘤的生長(zhǎng)密切相關(guān)。

在HCC患者中，侵襲性強(qiáng)的腫瘤組織中可以檢測(cè)到脂質(zhì)生成的異常激活。許多脂肪相關(guān)腫瘤在抗血管生成治療方案中表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐藥屬性?？寡苌蓵?huì)引起缺氧致使腫瘤細(xì)胞代謝重編程，激活A(yù)MPK-ACC-肉堿?；D(zhuǎn)移酶1(CPT1)信號(hào)通路，促進(jìn)脂肪酸代謝供能[22]。ω-3多不飽和脂肪酸可以通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和前列腺素E2的表達(dá)減輕血管新生從而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[23]。因此，在脂肪性相關(guān)腫瘤中，同時(shí)靶向血管生成和脂質(zhì)代謝治療脂肪性相關(guān)腫瘤是一種理想有效的治療模式。

膽固醇也參與了NAFLD-HCC的發(fā)生和發(fā)展。在飲食誘導(dǎo)的NASH及NAFLD-HCC動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，單純高脂飲食僅引起單純的肝細(xì)胞脂肪變，而高脂高膽固醇喂養(yǎng)的小鼠發(fā)展為NASH。添加膽固醇會(huì)促進(jìn)炎癥因子MCP-1、IL-1β和TNFα的表達(dá)。膽固醇會(huì)引起Ras、蛋白激酶B、Src、鈣信號(hào)的改變及代謝失調(diào)從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，膽固醇可以調(diào)節(jié)不同受體的功能，參與囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)膽固醇是類固醇激素的前體，對(duì)乳腺癌和前列腺癌具有公認(rèn)的促進(jìn)作用。

游離脂肪酸及其代謝產(chǎn)物通過(guò)誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)積累而成為脂毒性的重要介質(zhì)，脂質(zhì)過(guò)積累導(dǎo)致脂毒性肝細(xì)胞損傷和NAFLD的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸可以上調(diào)肝臟MPST的表達(dá)，進(jìn)而抑制胱硫醚-γ-裂解酶/H2S通路，導(dǎo)致NAFLD發(fā)生。HCC患者血清的代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)C24∶1(cis-15)神經(jīng)酸和C24∶0二十四烷酸含量極低，幾乎檢測(cè)不到。C23∶0二十三烷酸在前列腺癌患者腫瘤與瘤旁組織的代謝組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中的含量明顯高于非腫瘤組織。Lu等[24]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)80例肝癌組織及癌旁非癌組織進(jìn)行?；鈮A代謝譜分析，發(fā)現(xiàn)在HCC組織中飽和長(zhǎng)鏈?；鈮A增加，短鏈和中鏈肉堿減少。CPT2在HCC組織中表達(dá)下降。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CPT2的下調(diào)顯著增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的致瘤活性和轉(zhuǎn)移潛能。在DEN誘導(dǎo)的NASH-HCC小鼠腫瘤組織中CPT2的表達(dá)也顯著下調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CPT2基因功能異常可造成代謝物?；鈮A堆積，促進(jìn)HCC發(fā)生。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[25]中，將肉堿加入高脂飲食飼料中誘導(dǎo)NASH-HCC模型，發(fā)現(xiàn)肉堿可以加重NASH-HCC。提示CPT2缺陷引起的脂肪酸代謝障礙可以促進(jìn)NASH-HCC的發(fā)生，CPT2可以作為NASH-HCC監(jiān)測(cè)和治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

2.4 腸道微生物 NAFLD患者腸道菌群結(jié)構(gòu)和炎癥有關(guān)，表現(xiàn)為擬桿菌和瘤胃球菌科增多，雙歧桿菌屬減少[26]。NAFLD患者腸道細(xì)菌的過(guò)度生長(zhǎng)可促進(jìn)胰島素抵抗和膽堿缺乏等的出現(xiàn)，并且與脂肪肝嚴(yán)重程度相關(guān)。肥胖能引起腸道微生物構(gòu)成和數(shù)量改變，增加腸道通透性和血漿內(nèi)毒素水平，促使脂多糖從腸道轉(zhuǎn)運(yùn)至門靜脈系統(tǒng)，依次激活Toll樣受體和NF-кB，促進(jìn)炎癥及腫瘤的發(fā)生。給予抗生素和腸道滅菌可降低肥胖小鼠中的HCC患病率，提示菌群失調(diào)在HCC的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

隨著代謝組學(xué)廣泛應(yīng)用和發(fā)展，許多小分子代謝產(chǎn)物如膽汁酸、短鏈脂肪酸等均被發(fā)現(xiàn)與NAFLD-HCC的發(fā)生相關(guān)。腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)物脫氧膽酸可以促進(jìn)DNA損傷，是 SASP 的觸發(fā)因子。Yoshimoto等[27]發(fā)現(xiàn)抑制脫氧膽酸生成可以抑制肥胖小鼠體內(nèi)的肝癌生長(zhǎng)。腸道菌群的代謝產(chǎn)物也可通過(guò)調(diào)節(jié)宿主免疫誘導(dǎo)NAFLD和NAFLD-HCC的炎癥反應(yīng)。肥胖誘導(dǎo)的小鼠腸道革蘭陽(yáng)性菌成分脂磷壁酸移位到肝，可與脫氧膽酸協(xié)同作用，促進(jìn)前列腺素E2通過(guò)EP4受體抑制CD8+T淋巴細(xì)胞抗腫瘤免疫，促進(jìn)HCC的發(fā)生[28]。從健康人群供體中分離的11個(gè)菌株聯(lián)合體可以通過(guò)誘導(dǎo)IFNγ促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體的抗腫瘤效應(yīng)[29]。

多組學(xué)技術(shù)及生信分析在臨床和基礎(chǔ)研究上的聯(lián)用，使NAFLD-HCC的機(jī)制研究也更加深入和精準(zhǔn)。其中炎癌轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)代謝重編程、腸道微生物及其代謝產(chǎn)物以及它們?cè)诿庖呒?xì)胞中的相互作用均是NAFLD-HCC目前研究的熱點(diǎn)。針對(duì)NAFLD及其相關(guān)HCC發(fā)病率逐年升高的趨勢(shì)，剖析炎癌轉(zhuǎn)化、代謝改變及肝腸軸在腫瘤發(fā)生中的內(nèi)在機(jī)理，確定HCC的功能分子靶點(diǎn)，將有助于NAFLD-HCC的精準(zhǔn)預(yù)防及開(kāi)發(fā)新的治療策略，以減輕未來(lái)的疾病負(fù)擔(dān)。