羅 瓊， 王春明， 廖航宇， 陳錕靈， 潘明新

1 南方醫(yī)科大學(xué)附屬衡陽醫(yī)院(衡陽市中心醫(yī)院) 普通外科， 湖南 衡陽 421000；2 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 肝膽二科， 廣州 510282

肝癌是全球癌癥死亡的第二大主要原因[1]，僅中國就占病例總數(shù)和死亡總數(shù)的50%[2]。目前，肝癌尚無合適的預(yù)后指標(biāo)，找到合適的預(yù)后指標(biāo)有利于改善預(yù)后和個(gè)體化治療。N-myc下游調(diào)控基因(N-myc downstream regulated gene,NDRG)家族由4個(gè)成員組成：NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4。分子功能涵蓋了廣泛的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞發(fā)育和分化，應(yīng)激反應(yīng)和增殖，腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[3-4]。NDRG家族與肝細(xì)胞癌(HCC)的臨床病理特征及其預(yù)后之間的關(guān)系已有部分報(bào)道[5-7]，但結(jié)論仍存在爭議。因此，本研究通過大數(shù)據(jù)資料分析了NDRG家族在HCC中的診斷和預(yù)后價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)頁分析工具 ONCOMINE平臺[8]是在線癌癥數(shù)據(jù)庫。利用ONCOMINE平臺分析NDRG家族在不同癌癥的表達(dá)譜，并利用Chen Liver和Wurmbach Liver的測序數(shù)據(jù)，比較這兩個(gè)測序數(shù)據(jù)中HCC標(biāo)本中NDRG家族的mRNA表達(dá)與正常對照中的mRNA表達(dá)差異。

GEPIA[9]是基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)的在線分析工具。利用GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC組織和正常肝組織中的NDRG家族的mRNA表達(dá)差異，以及HCC不同病理分期中的mRNA表達(dá)差異。本研究共收集TCGA數(shù)據(jù)庫中419例HCC組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析NDRG家族表達(dá)差異，將其分為肝癌組(n=369)和正常肝組織組(n=50)。

Kaplan-Meier Plotter[10]是一個(gè)基于GEO、EGA和TCGA數(shù)據(jù)庫的生存分析工具，包含HCC患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和生存信息。利用該網(wǎng)頁生存分析工具分析HCC患者的總生存期(overall survival，OS)，無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)。本研究共收集GEO數(shù)據(jù)庫中364例HCC組織的NDRG家族基因表達(dá)數(shù)據(jù)，分為低表達(dá)組[NDRG1(212例)、NDRG2(185例)、NDRG3(182例)、NDRG4(184例)]和高表達(dá)組[NDRG1(152例)、NDRG2(179例)、NDRG3(182例)、NDRG4(180例)]。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8.2.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)采用；生存分析采用log-rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者NDRG家族的轉(zhuǎn)錄水平 利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫比較不同類型癌組織與正常組織中的NDRG家族的轉(zhuǎn)錄水平(圖1)。對Chen Liver的數(shù)據(jù)集中197個(gè)標(biāo)本進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，HCC中的NDRG1和NDRG3過表達(dá)(P值均<0.05)，但NDRG4在HCC組織中的表達(dá)低于正常肝組織(P=0.657)(表1)。

對Wurmbach Liver數(shù)據(jù)集75個(gè)標(biāo)本進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，HCC中NDRG2低表達(dá)(P=1.000)(表1)。因差異倍數(shù)log2FC<2，進(jìn)一步進(jìn)行亞組分析。從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE6764)中檢索Wurmbach Liver的測序數(shù)據(jù)，分析NDRG2在HCC不同病理分期的轉(zhuǎn)錄水平，各分期分別與正常肝組織比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖2)。

表1 NDRG家族在ChenLiver、Wurmbach數(shù)據(jù)集HCC組織與正常組織中mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異

圖2WurmbachLiver測序數(shù)據(jù)中HCC不同臨床分期NDRG2mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異

2.2 NDRG家族mRNA水平與HCC臨床病理特征的關(guān)系 利用TCGA數(shù)據(jù)中的GEPIA工具比較HCC組織和正常肝組織之間NDRG家族的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，HCC組織中NDRG1/3的表達(dá)水平高于正常肝組織，而NDRG2在HCC組織中的表達(dá)水平低于正常肝組織(P值均<0.05)(圖3a)。 不同病理分期NDRG1/2/3/4表達(dá)差異組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(NDRG1:F=3.67,P<0.05;NDRG2:F=2.97,P<0.05;NDRG3:F=5.51,P<0.05;NDRG4:F=3.56,P<0.05)(圖3b)。

2.3 生存分析 使用Kaplan-Meier生存分析工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫中的364例HCC患者NDRG家族的表達(dá)水平對生存影響的差異，結(jié)果顯示，NDRG1/3高轉(zhuǎn)錄組與低轉(zhuǎn)錄組相比，OS和PFS均顯著縮短(P值均<0.05)。NDRG1高轉(zhuǎn)錄組中位OS 37.8個(gè)月，中位PFS為13.33個(gè)月；低轉(zhuǎn)錄組中位OS為70.5個(gè)月，中位PFS為29.17個(gè)月。NDRG3高轉(zhuǎn)錄組中位OS為38.3個(gè)月，中位PFS為13.27；低轉(zhuǎn)錄組中位OS為71個(gè)月，中位PFS為29.77個(gè)月。NDRG2低轉(zhuǎn)錄組與高轉(zhuǎn)錄組相比，OS和PFS均顯著縮短(P值均<0.05)。NDRG2高轉(zhuǎn)錄組中位OS為81.9個(gè)月，中位PFS為29.73個(gè)月；低轉(zhuǎn)錄組中位OS為38.3個(gè)月，中位PFS為13.27個(gè)月。NDRG4高低轉(zhuǎn)錄組間OS無明顯差異(P>0.05)，高轉(zhuǎn)錄組與低轉(zhuǎn)錄組相比PFS顯著延長(P<0.05)。高轉(zhuǎn)錄組中位PFS為29.3個(gè)月，低轉(zhuǎn)錄組PFS為13.03個(gè)月(圖4)。

注：a，NDRG家族在HCC與正常組織中mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異(T，肝癌組；N，正常肝組織組)；b，NDRG家族在HCC不同病理分期中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異(StageⅠ:癌細(xì)胞高分化;StageⅡ/Ⅲ:癌細(xì)胞中度分化;StageⅣ:癌細(xì)胞低度分化)。

圖3NDRG家族mRNA在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平(GEPIA)

3 討論

NDRG家族基因的失調(diào)在許多癌癥中都有報(bào)道。盡管已經(jīng)部分證實(shí)了NDRG基因在幾種癌癥的發(fā)生和預(yù)后中的作用，但尚未對HCC進(jìn)一步開展生物信息學(xué)分析。本研究首次探討了HCC中NDRG家族的表達(dá)對其預(yù)后的影響，以期利用大數(shù)據(jù)基因信息資料提高對HCC患者預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性，或?yàn)槠渲委熖峁撛诘男掳悬c(diǎn)。

NDRG1被證實(shí)為人類乳腺癌[13-14]、前列腺癌[15]和結(jié)腸直腸癌[16]中的抑制基因。關(guān)于NDRG1在HCC中的功能存在很多爭議。Song等[17]證實(shí)NDRG1通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)ITGB3表達(dá)來抑制HCC的增殖和轉(zhuǎn)移。Luo等[5]證實(shí)NDRG1是促癌基因。在本研究中，通過分析已有的測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，NDRG1在HCC組織中的表達(dá)高于正常組織，并且與HCC患者的腫瘤病理分期顯著相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)與認(rèn)為NDRG是促癌基因的結(jié)論是一致的。生存分析發(fā)現(xiàn)，NDRG1的高表達(dá)與OS和PFS顯著相關(guān)，NDRG1高表達(dá)組預(yù)后更差。

NDRG2在多種人類癌細(xì)胞中有異常表達(dá)，包括前列腺癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、食道鱗狀細(xì)胞癌和膽囊癌[18-22]。既往研究[23-24]發(fā)現(xiàn)，NDRG2調(diào)節(jié)膀胱癌中的細(xì)胞增殖和侵襲。Wang等[25]證實(shí)NDRG2在HCC組織中顯著下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤分期相關(guān)。一項(xiàng)回顧性研究[26]發(fā)現(xiàn)，NDRG2和CD24的聯(lián)合異常表達(dá)與HCC患者的無病生存期(disease-free survival，DFS)和OS相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)NDRG2在HCC組織中顯著下調(diào)，不同病理分期組間比較其表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。盡管在Wurmbach Liver測序數(shù)據(jù)中NDRG2在癌組織與正常組織的表達(dá)差異倍數(shù)<2，但進(jìn)一步亞組分析發(fā)現(xiàn)不同病理分期的NDRG2表達(dá)差異顯著。同時(shí)，生存分析提示NDRG2的低表達(dá)組的OS和PFS更差，表明NDRG2是HCC的抑癌基因。

NDRG3在細(xì)胞增殖、分化和其他生物學(xué)功能中起重要作用[27]。NDRG3的過表達(dá)被認(rèn)為與非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌和喉鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)[28-30]。Fan等[31]研究提示，miR-122通過靶向NDRG3在HBV相關(guān)HCC的發(fā)生中起重要作用，認(rèn)為miR-122和NDRG3可作為HBV相關(guān)HCC的診斷標(biāo)志物和潛在治療靶標(biāo)。一項(xiàng)回顧性研究[32]結(jié)果顯示，NDRG3表達(dá)是HCC患者DFS和OS的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。在本研究中，NDRG3在HCC組織中的表達(dá)高于正常組織。不同病理分期組間比較其表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NDRG3高表達(dá)組患者的OS、PFS更差。

目前，對NDRG4的研究相對較少。 NDRG4參與調(diào)節(jié)人類癌癥中的細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和血管生成[33]。NDRG4在許多腫瘤中的表達(dá)均降低，這表明它可能是抑癌基因。Melotte等[34]研究發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)腸組織相比，NDRG4在大腸癌中的表達(dá)降低，NDRG4的過表達(dá)可以在體外抑制集落形成以及細(xì)胞增殖和侵襲，表明NDRG4是大腸癌的抑癌基因。但是，尚無研究分析NDRG4在HCC中的預(yù)后價(jià)值，因此需要進(jìn)一步闡明。

綜上，NDRG家族在HCC組織中的差異表達(dá)可能對其發(fā)生發(fā)展中起重要作用。NDRG1/3高表達(dá)和NDRG2低表達(dá)也可以作為分子標(biāo)志物來鑒定HCC患者的高危亞組。NDRG1/2/3是HCC的潛在治療靶標(biāo)，NDRG1/2/3可以作為HCC預(yù)后的一種標(biāo)志物。