微小RNA-155/含有SH2結(jié)構(gòu)的5肌醇磷酸酶-1與非酒精性脂肪性肝病患者發(fā)生心血管事件的相關(guān)性

王 凡， 孫 武， 馬玉林， 蔣紅君

云南省第一人民醫(yī)院(昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院) 檢驗科， 昆明 650032

近年來，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已經(jīng)成為臨床最為常見的非感染性肝臟疾病[1]。NAFLD是由非過度飲酒或其他明確肝損傷因素所導(dǎo)致的，以肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的脂肪沉積為主要特征[2]。研究[3]顯示，脂肪肝與心血管病之間存在著密切聯(lián)系。NAFLD是代謝綜合征在肝臟中的表現(xiàn)，而代謝綜合征是導(dǎo)致動脈粥樣硬化以及臨床心腦血管事件發(fā)生的主要原因之一[4]。有學(xué)者[5]提出，NAFLD不僅是心血管疾病的發(fā)生標(biāo)志，甚至是心血管疾病的早期中間狀態(tài)。目前，微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)作為理想的心血管疾病標(biāo)志物之一，對心血管疾病的早期診斷、臨床風(fēng)險評估以及預(yù)后判斷等方面均具有重要作用[6-7]，本研究旨在分析miR-155及其靶基因含有SH2結(jié)構(gòu)的5肌醇磷酸酶-1(SH2-containing inositol phosphatase-1, SHIP-1)與NAFLD患者心血管事件的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年3月-2019年7月本院收治的NAFLD患者，作為NAFLD組；并選擇同時期在本院健康體檢的健康志愿者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2010年《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[8]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)對照組志愿者無內(nèi)科相關(guān)疾病、代謝性疾病等。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并風(fēng)濕性心臟病、瓣膜病、心肌病、肺心病患者；(2)合并酒精性脂肪肝、病毒性肝炎、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷以及肝硬化等肝臟疾病患者；(3)合并惡性腫瘤、甲狀腺功能亢進(jìn)、腎臟疾病或服用影響肝功能藥物患者；(4)妊娠期及哺乳期婦女。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)指標(biāo)檢測 測量兩組受試者身高及體質(zhì)量，計算BMI；測量血壓，包括收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)；抽取兩組受試者清晨空腹靜脈血，檢測受試者空腹血糖(FPG)、TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、GGT、TBil水平。FPG檢測采用葡萄糖氧化酶偶聯(lián)比色法(GOD-POD法)，其余指標(biāo)檢測采用全自動生化分析儀，檢測嚴(yán)格參照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.2.2 miR-155及SHIP-1 mRNA檢測 采用熒光定量PCR法檢測miR-155及SHIP-1 mRNA，采用Trizol法提取外周血全血總RNA，測定RNA濃度、純度以及完整性，采用TaKaRa公司RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用引物設(shè)計軟件Premier5.0分別設(shè)計mRNA及基因熒光定量PCR引物，具體見表1，引物合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。以25 μl/孔qPCR反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，包括12.5 μl SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)、1.0 μl Gol Forward Primer、1.0 μl Uni-miR qPCR Primer、0.5 μl ROX Reference Dye(50×)、2.0 μl cDNA溶液、8.0 μl dH2O。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s、60 ℃ 11 s共進(jìn)行40個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用△△Ct法計算基因相對表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

1.3 倫理學(xué)審查 本研究已通過云南省第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號：2017倫審第51號)，所有受試者均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入NAFLD組104例，對照組110例。NAFLD組中男68例、女36例，年齡43～65歲，平均年齡(52.17±8.92)歲，病程3個月～16年，平均病程(4.18±1.39)年，病情輕度62例、中重度42例。對照組中男65例、女45例，年齡45～60歲，平均年齡(51.20±9.83)歲。經(jīng)比較，兩組受試者性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)，具有可比性。

2.2 兩組各指標(biāo)比較 兩組SBP、DBP水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)，NAFLD組患者BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT、TBil水平明顯高于對照組，HDL-C水平明顯低于對照組，miR-155 mRNA相對表達(dá)量明顯高于對照組，SHIP-1 mRNA相對表達(dá)量明顯低于對照組，且miR-155/SHIP-1值、心血管事件發(fā)生率均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)(表2)。

2.3 不同miR-155/SHIP-1值NAFLD組患者各指標(biāo)比較 參考文獻(xiàn)[6]，根據(jù)患者miR-155/SHIP-1值將患者分為3組，3組間DBP、SBP水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)，而3組BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、GGT、TBil心血管事件比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(表3)。

表2 兩組受試者各指標(biāo)比較

表3 不同miR-155/SHIP-1值NAFLD組患者各指標(biāo)比較

注：1)與≤2組比較,P<0.05；2)與2～3組比較,P<0.05。

表4 miR-155/SHIP-1值與各指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4 miR-155/SHIP-1值與各指標(biāo)相關(guān)性分析 miR-155/SHIP-1值與BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT及TBil呈顯著正相關(guān)(P值均<0.05)，與HDL-C呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)(表4)。

2.5 miR-155/SHIP-1值對患者心血管事件發(fā)生預(yù)測價值 發(fā)生心血管事件的NAFLD患者miR-155/SHIP-1值為3.642±1.082，未發(fā)生心血管事件的NAFLD患者miR-155/SHIP-1值為2.237±0.703，前者明顯高于后者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.104，P<0.05)。采用ROC曲線分析miR-155/SHIP-1值對患者心血管事件發(fā)生預(yù)測價值，ROC曲線下面積為0.902(圖1)。

3 討論

NAFLD是由于非酒精因素所導(dǎo)致的一類肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積型疾病，屬于一種代謝應(yīng)激性肝損傷，具有較高的發(fā)生率，且患者可進(jìn)一步發(fā)生成為肝硬化，需引起臨床工作者的重視[9]。近些年來，國內(nèi)多項研究顯示NAFLD與心血管事件的發(fā)生具有密切聯(lián)系[10]。心血管事件發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)為動脈粥樣硬化，分子生物學(xué)研究[11]顯示，NAFLD可通過過氧化應(yīng)急、內(nèi)分泌激素、炎癥以及糖脂代謝異常等多種途徑損傷機(jī)體動脈內(nèi)膜，繼而導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生。目前，心血管事件已經(jīng)成為NAFLD患者死亡的主要原因[12]。

miRNA屬于轉(zhuǎn)錄本長度在22～25 nt范圍內(nèi)的非編碼RNA，可通過對靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控來影響細(xì)胞的生化、分化、增殖以及凋亡。miR-155不僅能夠?qū)C(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)控，同時還能夠參與機(jī)體的各種炎癥過程[13]。此外，在激活的免疫細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)miR-155高表達(dá)，并且通過免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞分化以及細(xì)胞因子的分泌參與機(jī)體的免疫調(diào)控反應(yīng)過程[14]。研究[15]顯示，miR-155與機(jī)體炎癥因子(包括IL-6、TNFα以及IFNγ)表達(dá)密切相關(guān)，miR-155表達(dá)的升高可能是嚴(yán)重心血管意外發(fā)生的重要機(jī)制之一。SHIP-1是miR-155重要的作用靶點，可抑制巨噬細(xì)胞所引發(fā)的炎癥反應(yīng)。由于miR-155與SHIP-1 mRNA 3’端UTR相結(jié)合，當(dāng)miR-155表達(dá)增高時，可導(dǎo)致SHIP-1表達(dá)的明顯降低[16-17]。有報道[18]miR-155/SHIP-1表達(dá)與經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后患者嚴(yán)重心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)，但是關(guān)于miR-155/SHIP-1表達(dá)與NAFLD患者心血管事件的發(fā)生關(guān)系，目前尚無相關(guān)報道。

本研究結(jié)果顯示，兩組受試者血壓SBP、DBP比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，NAFLD組患者BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT以及TBil明顯高于對照組，NAFLD組患者HDL-C水平明顯低于對照組；同時NAFLD組患者心血管事件發(fā)生率明顯高于對照組，上述結(jié)果與既往研究[19-20]結(jié)果相似，提示NAFLD患者出現(xiàn)糖脂代謝以及肝功能異常，且心血管事件發(fā)生率較正常健康人群明顯升高。此外，本研究結(jié)果提示NAFLD患者可見miR-155/SHIP-1表達(dá)異常，miR-155表達(dá)升高而SHIP-1表達(dá)降低。進(jìn)一步分析miR-155/SHIP-1值與NAFLD患者糖脂代謝及心血管事件發(fā)生的相關(guān)性，結(jié)果顯示，NAFLD患者miR-155/SHIP-1表達(dá)異常與糖脂代謝及肝功能密切相關(guān)，可能是疾病進(jìn)展的重要機(jī)制。采用ROC曲線分析miR-155/SHIP-1值對患者心血管事件發(fā)生預(yù)測價值，提示NAFLD患者miR-155/SHIP-1表達(dá)情況可有效預(yù)測患者心血管事件的發(fā)生，進(jìn)一步顯示miR-155/SHIP-1在NAFLD患者心血管疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，NAFLD患者出現(xiàn)明顯的糖脂代謝及miR-155/SHIP-1表達(dá)異常，其糖脂代謝及肝功能異常與miR-155/SHIP-1表達(dá)密切相關(guān)。因此，miR-155/SHIP-1表達(dá)可有效預(yù)測患者心血管事件發(fā)生。