牛春燕， 趙向陽

1 西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 消化內科， 西安 710077；2 南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院(東南大學附屬中大醫(yī)院溧水分院)消化內科， 南京 211200

近年來，免疫微環(huán)境的作用被逐漸重視，作為肝臟免疫細胞的重要組分，肝巨噬細胞在各類疾病發(fā)病機制中的核心作用及其靶向治療受到關注。巨噬細胞在體內廣泛分布，90%常駐于肝臟，是天然免疫系統(tǒng)的第一道防線，在生理環(huán)境下識別、清除壞死或凋亡的細胞碎片和病原體、呈遞抗原，參與適應性免疫和免疫監(jiān)視，起到“哨兵”作用，通過分泌抗炎細胞因子(如IL-10)而形成抗炎微環(huán)境、維持免疫穩(wěn)態(tài)；在病理狀態(tài)(如感染、損傷)下，激活的巨噬細胞產(chǎn)生和釋放大量炎性因子和細胞因子，并募集其他免疫細胞到局部參與抗感染或組織修復[1]。近年來對肝巨噬細胞在脂肪性肝病中的作用的研究，為開發(fā)靶向治療提供了機遇。

1 肝巨噬細胞

肝臟中有豐富的巨噬細胞，每100個肝臟細胞中即有20～40個巨噬細胞。肝巨噬細胞按照來源主要分為兩大類，卵黃囊來源的固有巨噬細胞即Kupffer細胞及外周血單核細胞來源的浸潤型巨噬細胞(monocyte-derived macrophage, MoMF)。

Kupffer細胞是最大的組織常駐型、組織特異性高效巨噬細胞群，具有高度的自我更新、異質性、非移行性和可塑性，可識別、吞噬并降解細胞碎片、外來物質和抗原，并且呈遞抗原[2]，在肝臟炎癥的啟動、延續(xù)和修復以及啟動固有和獲得性免疫反應中起到核心作用。在不同病理情況下，巨噬細胞可以被極化成具有不同表型、功能的兩種類型，M1型(促炎型)和M2型(抗炎型)，M1型主要由干擾素γ和脂多糖(LPS)激活，主要功能包括促炎、殺菌、抗腫瘤、釋放促炎因子(如TNFα、IL-1、IL-6、IL-12等)，M2型通過分泌細胞因子(IL-10、IL-4/IL-13、TGFβ等)下調炎癥反應和促進組織修復，基于誘導激活物不同M2型可被進一步分為4種亞型：M2a(由IL-4和IL-13誘導)、M2b(由免疫復合物誘導)、M2c(由IL-10、TGFβ和糖皮質激素誘導)、M2d[由IL-6、Toll樣受體(TLR)配體和腺苷誘導][3]。

MoMF主要通過趨化因子CCR2、C-C基序配體2(CCL2)或單核細胞趨化蛋白1募集進入肝臟，分為Ly-6Chigh(Ly-6C+)型(引起器官損傷)及Ly-6Clow(Ly-6C-)型(促進器官修復)[4]。

2 肝巨噬細胞與脂肪性肝病及相關肝癌

2.1 肝巨噬細胞與酒精性肝病(ALD) ALD可由酒精性脂肪肝逐漸進展為酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化。在ALD進展過程中，肝內M1、M2表型Kupffer細胞以及相關炎癥基因、M1/M2標志物、細胞因子、趨化因子表達均顯著增加[5]，單核巨噬細胞聚集增加，可能與急慢性ALD時腸道通透性增加和門靜脈高水平內毒素、LPS導致Kupffer細胞過度激活有關[6]。激活Kupffer細胞、肝星狀細胞(HSC)、肝竇內皮細胞內的TLR4信號通路可促進血管生成和纖維化形成，導致肝纖維化。因此，TLR途徑和LPS介導的損傷，包括內質網(wǎng)激活，可能是開發(fā)治療ALD的潛在新靶點。

2.2 肝巨噬細胞與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 肝臟脂質過度積聚導致的脂毒性誘導了肝損傷的發(fā)生。低密度脂蛋白膽固醇在肝細胞脂滴膜上形成膽固醇晶體并激活THP1巨噬細胞從而上調TNFα、炎癥小體蛋白3(NLRP3)和IL-1β mRNA，膽固醇晶體可激活暴露于LPS的Kupffer細胞內的NLRP，因此通過溶解膽固醇和分散Kupffer細胞的結構降低膽固醇水平可使非酒精性脂肪性肝炎(NASH)緩解[1]。由腸道通透性、肝細胞脂性凋亡、腸道菌群、游離脂肪酸、膽固醇等增加導致的內毒素和細菌成分釋放，誘導了巨噬細胞的活化。Kupffer細胞和MoMF分泌的炎性細胞因子(如IL-1β、TNFα 和CCL2)作為成脂因子可促進NAFLD向NASH的發(fā)生及發(fā)展。最新一項研究[6]表明，大腸桿菌-LPS可通過TLR4途徑誘導巨噬細胞和血小板活化而加重NAFLD的肝損傷。NASH時受損肝細胞釋放的外泌體/胞外囊泡中含有線粒體DNA，Kupffer細胞可通過TLR9識別線粒體DNA而加重肝損傷的嚴重程度。巨噬細胞可依代謝微環(huán)境改變而易其表型，提示其在NAFLD中存在代謝重編程[7]。進展期NASH中的肝巨噬細胞聚集并呈現(xiàn)明顯的炎癥表型，這是NASH進展的一個特征。炎性巨噬細胞可通過幾種機制促進NASH進展：影響肝細胞脂肪變、吸引炎性淋巴細胞、刺激血管形成或促進肝纖維化。最新研究[8]發(fā)現(xiàn)一種NASH相關巨噬細胞，顯著表達骨髓細胞2上高水平的觸發(fā)受體，這是小鼠和人類NASH的一個特征，與疾病嚴重程度有關，而且對藥理學和飲食干預有應答；同時也證實了巨噬細胞(或其他非實質細胞)的重新編程。

2.3 肝巨噬細胞與纖維化 在肝損傷時，Kupffer細胞產(chǎn)生細胞因子，并通過分泌CCL2和CCL5使大量單核細胞向肝臟募集，后者分化為炎性巨噬細胞并釋放細胞因子、吸引其他免疫細胞如自然殺傷細胞，MoMF的數(shù)量可達到3～5倍，除了通過釋放TGFβ、IL-1β、血小板衍生生長因子(PDGF)和CCL2而促進纖維化外，還介導HSC活化、轉分化為可分泌TGFβ1和PDGF-bb的成纖維細胞。炎性和促纖維化巨噬細胞的募集依賴于CCL2-CCR2，CCL2、CCR2基因缺失或藥物抑制CCL2可減輕鼠的肝纖維化[9]。近期兩項臨床Ⅱ期試驗[10-11]應用凋亡信號調節(jié)激酶1(ASK1)的特異性抑制劑selonsertib或雙向CCR2/CCR5 抑制劑cenicriviroc治療NASH及纖維化患者，以巨噬細胞不同作用為靶向，觀察到抗纖維化作用。巨噬細胞來源的TGFβ1是最強的促纖維化因子，可導致HSC激活及細胞外基質產(chǎn)生和沉積。具有促纖維化、促炎功能的Ly-6ChighMoMF表型在微環(huán)境改變時可轉變?yōu)榭估w維化、抗炎Ly-6Clow表型，損傷停止/消除、細胞碎片被吞噬，以及自噬激活均可使巨噬細胞誘導為修復性表型，有助于肝纖維化逆轉。

2.4 肝巨噬細胞與肝癌 肝巨噬細胞促進形成腫瘤易感微環(huán)境，同時對腫瘤和其他基質細胞衍生信號作出反應，主動促進肝癌進展。腫瘤被認為是一種炎癥反應，在腫瘤早期M1型巨噬細胞在炎癥損傷、再生修復和清除過程中對腫瘤細胞免疫監(jiān)視同時也刺激腫瘤形成，而腫瘤一旦形成后則表型即由M1轉變?yōu)镸2，普遍表現(xiàn)出較低的抗原提呈和共刺激能力，并促進腫瘤生長、逃逸抗腫瘤免疫。腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage, TAM)起源于循環(huán)單核細胞，由CCL2、巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)、血管內皮生長因子等趨化進入腫瘤微環(huán)境，分化成為成熟肝巨噬細胞[12]。在HCC腫瘤微環(huán)境中，TAM大部分極化為M2表型，促進腫瘤生長和生存、血管生成、浸潤和轉移，但也表現(xiàn)出抗腫瘤免疫的作用。TAM釋放多種細胞因子、趨化因子和生長因子，其中IL-6和TGFβ促進腫瘤生長，TNFα、骨橋蛋白、基質金屬蛋白酶和IL-6促進腫瘤浸潤和轉移，TGFβ與IL-10聯(lián)合作用發(fā)揮抗腫瘤免疫反應作用，血管內皮生長因子、表皮生長因子、PDGF和TGFβ誘導血管生成。M2型TAM通過TLR4/信號傳導與活化轉錄因子3信號通路促進肝癌細胞遷移和上皮間質轉化，提示TLR4可能是一種新的腫瘤治療靶點[13]。TAM的數(shù)量和巨噬細胞相關標志物與肝細胞癌的進展和不良預后相關[14]。

3 肝巨噬細胞靶向治療

來自臨床前期的研究(有些已處于臨床Ⅱ期及Ⅲ期)提供了巨噬細胞和單核細胞靶向治療在緩解脂肪性肝炎、纖維化、代謝性疾病方面的證據(jù)，有望成為個體化治療的有效候選方案。目前針對肝巨噬細胞的靶向治療方法主要有三大類(表1)：(1)巨噬細胞極化/重編程的調節(jié)；(2)抑制Kupffer細胞活化；(3)抑制單核細胞向肝臟的募集。由于巨噬細胞具有強大的清除能力，因而使用納米粒子作為靶點使其成為潛在治療方向。TAM靶向治療肝細胞癌的方案包括通過消除腫瘤中的TAM減少TAM的數(shù)量、阻斷MoMF的募集以及重編程TAM使其極化為抗腫瘤表型。

3.1 抑制Kupffer細胞活化和損傷反應 固有巨噬細胞識別肝臟損傷后將啟動后續(xù)的肝臟炎癥級聯(lián)反應。TLR2、TLR3及TLR4激動劑抑制PRRs可減輕肝臟炎癥和級聯(lián)反應[5]。廣譜抗菌藥減少細菌異位及TLR4依賴的巨噬細胞激活可減輕脂肪性肝炎、纖維化以及肝癌[15]。通過益生菌、抗生素、糞菌移植或調節(jié)膽汁酸組分改善腸屏障、腸道菌群及內毒素血癥可能減輕肝臟巨噬細胞激活。同樣，靶向NLRP激活的藥物也有可能延緩肝內炎癥進程[16]。ASK1特異性抑制劑selonsertib可影響巨噬細胞活化，具有強烈的抗纖維化作用，并可改善匯管區(qū)炎癥、肝細胞凋亡壞死[17]。脂質體包裹親油性姜黃素和鈣三醇均為NF-κB抑制劑，二者可被肝巨噬細胞和樹突狀細胞攝取，抑制肝臟炎癥、脂質堆積和胰島素抵抗[18]。

表1 肝巨噬細胞的靶向治療策略

3.2 調節(jié)巨噬細胞極化、分化/重編程 巨噬細胞的不同表型具有不同功能，因此，可通過一些手段促進巨噬細胞極化和(或)應用納米粒子對巨噬細胞選擇性重編程，使其從致病性表型轉為促進疾病緩解和肝臟再生的恢復性表型。納米粒子非常小，在巨噬細胞靶向給藥中具有優(yōu)勢，可以作為納米載體用于診斷和靶向給藥治療肝病。納米粒子被修飾后與靶向細胞結合并在靶點部位釋放，可減少巨噬細胞的非特異性攝取、改變免疫細胞的反應性，延長納米粒子在循環(huán)系統(tǒng)中的停留時間、由此降低其毒性。巨噬細胞特別是Kupffer細胞具有很強的清除能力、天然高效及非特異性攝取大部分納米材料的能力，在靶向治療肝臟炎癥和纖維化中發(fā)揮重要作用。Kupffer細胞可被甘露糖受體靶向或被特定的納米材料激活，極化為促炎表型。小干擾RNA抑制的TNFα經(jīng)甘露糖修飾后結合納米粒子，通過巨噬細胞傳遞途徑給藥可預防模型鼠急性肝損傷及死亡，地塞米松脂質體可通過誘導巨噬細胞M2型的激活改善模型動物的急慢性肝損傷[19]。脾酪氨酸激酶抑制劑R406可抑制免疫細胞浸潤、巨噬細胞激活，從而減輕ALD；使用修飾的納米粒子轉運小分子脾酪氨酸激酶抑制劑R406的高效給藥方式可減輕膽堿缺乏飲食誘導的NASH[20]。干擾素基因激活蛋白是經(jīng)典的天然免疫信號通路調節(jié)蛋白，僅在非實質性細胞特別是Kupffer細胞表達，干擾素基因激活蛋白缺陷或使用NF-κB抑制劑預處理可減輕NAFLD并延緩其進展[21]。糖尿病治療藥物利拉魯肽可提高NAFLD鼠肝臟中Kupffer細胞的M2/M1比值，改善肝脂肪變。

3.3 抑制單核細胞募集 MoMF被Kupffer細胞募集進入肝臟后，放大并維持肝臟炎癥，MoMF募集由趨化因子受體CCL2-CCR2 等相互作用而驅動[22]，因此，可通過靶向性減少或干擾趨化因子信號傳導而減少MoMF募集的數(shù)量。雙向CCR2/CCR5抑制劑cenicriviroc可有效阻斷CCL2介導的向肝MoMF募集，并具有抗肝腎纖維化作用。CCR2抑制劑propagermanium、CCL5/RANTES抑制劑Maraviroc可減輕肝脂肪變、肝臟炎癥、纖維化和NASH的發(fā)展。CCL2抑制劑——RNA-適體分子mNOX-E36可抑制早期Ly6C+MoMF的向肝募集并且將Ly6C+MoMF轉變?yōu)長y6C-MoMF，從而有利于纖維化的緩解。以上研究提示，CCL/CCR途徑參與巨噬細胞的募集，顯示出潛在的治療作用。目前，已有針對該途徑的抑制劑被開發(fā)用于代謝性疾病(如2型糖尿病)及其并發(fā)癥(如糖尿病腎病)的研究。MCSF1具有可結晶片段結構，可促進肝巨噬細胞聚集，MCSF1-Fc誘導Kupffer細胞增殖、單核細胞浸潤及巨噬細胞分化，從而增強肝損傷的天然免疫[23]。這種方法可能使肝臟疾病或巨噬細胞功能受損階段的疾病減輕。Tipelukast(MN-001)是一種口服生物可利用的小分子白三烯受體拮抗劑，在臨床前期動物實驗中顯示出抗炎、抗纖維化作用，機制包括：拮抗白三烯受體，抑制前列腺素E(主要為3、4)，抑制5-脂氧合酶，下調炎癥基因表達(如CCR2、單核細胞趨化蛋白1)[24]。

3.4 HCC的TAM靶向治療

3.4.1 耗竭/消除TAM 脂質體是一種人工制備的囊泡，注射后可被巨噬細胞吞噬。它們可以裝載于氯膦酸鹽(一種用于骨質疏松癥的雙膦酸鹽)，在吞噬脂質體的巨噬細胞內釋放后誘導巨噬細胞凋亡。氯膦酸鹽包封的脂質體可部分消除TAM，減慢腫瘤生長，不僅腫瘤中TAM總數(shù)減少，而且M2型TAM數(shù)量也顯著減少，因此認為TAM大部分消除后，剩余的TAM經(jīng)歷了表型轉換[25]。選擇性消除僅有促腫瘤作用、而不是所有具有吞噬功能的巨噬細胞，是TAM靶向治療面臨的挑戰(zhàn)。使用巨噬細胞亞群特異性標志物，通過與SPECT或PET示蹤劑耦合的納米體Kupffer細胞特異性或TAM特異性靶點，可完成Kupffer細胞和M2型TAM的特異性成像[26]。需要強調的是TAM在微環(huán)境中與其他細胞緊密連接，被消除后其他細胞將在多大程度上補償它們耗盡后的功能尚不清楚。

3.4.2 抑制MoMF募集 單核細胞浸潤是腫瘤微環(huán)境中TAM最重要的來源。CCL2和相應的CCL2-CCR2信號軸是抑制單核細胞募集的重要靶點。CCR2拮抗劑可抑制肝細胞癌生長，減少外周血Ly6Chigh炎性單核細胞浸潤，繼而降低TAM數(shù)量，而且減少大部分由M2型TAM產(chǎn)生的細胞因子，剩余的TAM向M1表型轉化[14]。多種細胞因子參與吸引單核細胞，因此，靶向某一通路并不能完全消除募集，CCL2-CCR2或雙相CCR5/CCR2抑制劑可有效抑制腫瘤生長[27]。TAM在腫瘤微環(huán)境中能生存多長時間，以及何時開始抑制單核細胞募集治療仍有爭議。因為不同時期、不同微環(huán)境中TAM具有不同甚至相反功能。

3.4.3 TAM的重編程極化 黃芩苷是一種存在于多種藥用植物中的天然黃酮，可通過啟動TAM，使其重編程為M1樣表型，抑制小鼠肝癌的生長。黃芩苷處理的巨噬細胞與肝癌細胞共培養(yǎng)使體外增殖和遷移能力降低[28]。CSF1及其受體CSF-1R調節(jié)巨噬細胞的分化和功能，CSF-1R被競爭性阻斷后顯著延遲小鼠異種移植的腫瘤生長。該化合物在體外抑制了巨噬細胞的增殖，但在體內并未降低巨噬細胞的浸潤，基因表達結果顯示，腫瘤治療中的TAM向M1表型發(fā)生了極化[29]。

3.4.4 阻斷TAM產(chǎn)物的下游效應 TAM是肝細胞癌進展過程中一個重要的旁分泌IL-6來源。在由內質網(wǎng)應激激活的三個未折疊的蛋白反應途徑中，最保守的是需要肌醇的酶1α- X 盒結合蛋白 1信號, 該信號通路通過調節(jié)IL-6-信號傳導與活化轉錄因子3信號傳導通路的激活而促進肝癌細胞增殖。經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的治療類風濕關節(jié)炎的抗IL-6受體抗體tocilizumab可阻斷IL-6信號，在體內外均能抑制TAM刺激的腫瘤干細胞活性[30]。

4 巨噬細胞靶向治療脂肪性肝病及相關肝癌面臨的挑戰(zhàn)及展望

4.1 挑戰(zhàn) 肝巨噬細胞是炎癥、纖維化、肝癌發(fā)生的重要參與者，是疾病進展的關鍵因素。導致巨噬細胞募集、損傷反應或分化的中樞通路在動物與人體之間存在較大差異，因此巨噬細胞靶向治療從實驗轉化為臨床應用尚面臨諸多挑戰(zhàn)：(1)動物模型與人體的巨噬細胞及其亞群表型、功能存在諸多差異，而且模型僅能反映發(fā)病機制的某一特定方面，而人類在一些方面的異質性，導致巨噬細胞功能的更大差異；(2)肝巨噬細胞在不同背景下、甚至在疾病的不同階段具有迥異的表型和功能，目前的靶向治療方法僅有利于某一方面而對其他方面則起到不利甚至相反作用，有必要探索適應于不同背景、不同疾病階段功能的巨噬細胞靶向治療；(3)減少炎性肝巨噬細胞的治療性干預有可能引起相反的結果，即增加巨噬細胞的數(shù)量和功能，是否會導致或加重嚴重感染，對于存在嚴重免疫功能障礙者(如終末期肝病合并高風險致命性感染)是利是弊尚缺乏依據(jù)；(4)基于納米醫(yī)療中的脂質體具有理想的費-效比，但可引起劑量依賴性毒性，怎樣最大程度降低毒性、增強療效也是研究中所面臨的技術挑戰(zhàn)，而且大部分技術尚未在肝臟及巨噬細胞中得到驗證。

4.2 展望 由于從藥物輸送到診斷和成像領域的廣泛應用，納米醫(yī)學發(fā)展迅速，如脂質體和聚合物膠束，已經(jīng)被批準用于癌癥治療。最新的單細胞RNA測序、多參數(shù)組織學分析、系統(tǒng)生物學方法、多對肝臟活檢的利用將有助于克服某些技術困難。固體脂質納米粒在室溫和體溫下穩(wěn)定，使藥物釋放時間延長，并可減少非特異性細胞的攝取，從而降低藥物毒性。氧化鈰納米顆粒具有抗氧化，抗炎和抗脂肪變特性，主要積累在肝臟中，影響蛋白質磷酸化，減少巨噬細胞浸潤和炎癥基因表達，增強肝細胞凋亡活性，減弱其增殖，有望成為新的治療手段[31]。除趨化因子外，炎性細胞因子也參與改變巨噬細胞的激活和組織募集，如IL-17A軸影響NAFLD肝巨噬細胞募集，應用基因缺失或IL-17受體拮抗劑通過耗竭巨噬細胞可減輕NAFLD及ALD相關肝脂肪變、炎癥、纖維化和肝癌[32]。鈣黏蛋白-11在肝纖維化過程中增加[33]，提示鈣黏蛋白-11可能是巨噬細胞治療肝纖維化的潛在靶點。除了關注Kupffer細胞的極化/分化調節(jié)以外，如何將MoMF由Ly-6Chigh向Ly-6Clow轉換可以作為新的研究方向[5]。近期一些研究[34-35]揭示了新的治療前景，期待在未來轉化用于臨床。有些問題尚需進一步明確：不同巨噬細胞表型的意義和功能是什么？能否利用重新編程選擇性表型巨噬細胞來解決疾病？如何在不影響其他巨噬細胞表型和其他細胞類型功能的情況下誘導疾病消退，從而減少不利影響？