楊冬靜，謝逸萍，孫厚俊，張成玲,馬居奎，李宗蕓，馬代夫,*

(1．江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116；2．江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，江蘇 徐州 221131)

【研究意義】隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，采用基因工程技術(shù)進行農(nóng)作物性狀的定向改良已成為現(xiàn)實。近年來，國內(nèi)外學(xué)者也有大量關(guān)于轉(zhuǎn)基因甘薯增強抗病性以及抗逆性狀的研究和報道?！厩叭说难芯窟M展】在甘薯抗病基因克隆和品種抗病性改良方面，陳觀水等[1](2007)分離到抗病基因IbNPR1；王鈺等[2](2008)從甘薯中分離抗病基因同源序列(RGA)；Kim等[3](2012)報道病原菌侵染后IbERF1和IbERF2在葉片中的表達量明顯上升，推測它們可能參與調(diào)控甘薯抗病反應(yīng)；柏潔[4](2014)分離了IbSPR1和IbSGT1；Zhai等[5](2015)報道IbMIPS1不僅可提高甘薯的耐鹽和耐旱性，還能提高甘薯的抗莖線蟲病的性能。Li 等[6](2017)分離到甘薯蔓割病抗病基因IbSWEET10，并在在蔓割病敏感甘薯品種栗子香中進行IbSWEET10基因的過表達和干擾，結(jié)果表明過表達IbSWEET10基因能夠促進轉(zhuǎn)基因植株葉片中糖分的向外運輸，降低了轉(zhuǎn)基因株系中的糖含量，進而減少了病原菌生長繁殖所需的能量物質(zhì)，從而顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株對蔓割病的抗病性。【本研究切入點】蔗糖轉(zhuǎn)化酶(Invertase)是植物體內(nèi)蔗糖代謝的關(guān)鍵酶，在正常生長發(fā)育條件下，蔗糖轉(zhuǎn)化酶不可逆地催化蔗糖分解為葡萄糖和果糖。越來越多的研究表明，蔗糖轉(zhuǎn)化酶可被生物和非生物脅迫因子誘導(dǎo)，說明了蔗糖轉(zhuǎn)化酶不僅是糖分的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是多種逆境調(diào)控途徑中的重要成員[7-9]。而蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制子是轉(zhuǎn)化酶翻譯后的一個重要調(diào)控因子，通過與轉(zhuǎn)化酶互作形成復(fù)合物來調(diào)控其活性[10]。在甘薯中，本課題組前期分離得到IbINH全長開放閱讀框(ORF)，但是該基因的功能尚不清晰，是否參與甘薯抗病抗逆調(diào)控有待進一步研究。本文在此基礎(chǔ)上，進一步通過NCBI搜索其他作物中編碼INH蛋白質(zhì)的氨基酸序列，擬采用系列生物信息學(xué)軟件對對其氨基酸序列的組成、理化性質(zhì)，蛋白質(zhì)磷酸化位點、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽預(yù)測、二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)亞細胞定位以及功能結(jié)構(gòu)域等進行預(yù)測和比較分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】蛋白質(zhì)功能預(yù)測和INH蛋白序列比較分析可為深入研究IbINH的功能提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 INH序列來源

本課題組前期從甘薯中克隆并測序獲得IbINH基因的全長ORF，采用在線translate tool將核苷酸序列翻譯為氨基酸序列。從NCBI數(shù)據(jù)庫下載番茄等其余19種作物INH蛋白質(zhì)的氨基酸序列，序列登錄號分別如下：煙草(Nicotianatabacum)，登錄號：XP_016474343；辣椒(Capsicumannuum)，登錄號：XP_016551458；番茄(Solanumlycopersicum),登錄號：AGC75063；南方菟絲子(Cuscutaaustralis)，登錄號：RAL38588；馬鈴薯(Solanumtuberosum)，登錄號：AYV96510；小果咖啡(Coffeaarabica)，登錄號：XP_027115869；向日葵(Helianthusannuus)，登錄號：XP_022000364；洋薊(Cynaracardunculusvar. scolymus)，登錄號：XP_024985897；黃花蒿(Artemisiaannua)，登錄號：PWA72117；芝麻(Sesamumindicum)，登錄號：XP_011096732；茶樹(Camelliasinensis)，登錄號：XP_028100701；黃猴花(Erythrantheguttata)，登錄號：XP_012827426；粉紅鐘花(Handroanthusimpetiginosus)，登錄號：PIN23254；糙葉山黃麻(Parasponiaandersonii)，登錄號：PON64913；蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)，登錄號：XP_003609825；葡萄(Vitisvinifera)，登錄號：RVW26474；蓖麻(Ricinuscommunis)，登錄號：XP_002519258；橙子(Citrussinensis)，登錄號：XP_006488813；山荊子(Malusbaccata)，登錄號：TQE03219。

1.2 序列分析方法

利用在線軟件ProtParam分析INH編碼的氨基酸殘基數(shù)目、氨基酸組成、相對分子量、理論等電點等理化性質(zhì)；采用NetPhos 3.1server進行INH蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測；采用Protscale對INH蛋白質(zhì)親水性或疏水性預(yù)測；采用SOPMA對INH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；采用TMHMM進行INH蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測；INH蛋白質(zhì)信號肽采用Signal3.0軟件進行預(yù)測；利用WoLF PROST對INH蛋白質(zhì)亞細胞定位進行預(yù)測；NCBI在線對INH蛋白質(zhì)序列保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 INH的氨基酸組成以及理化性質(zhì)的預(yù)測分析

通過在線軟件Physicochemical Property ProtParam分析甘薯等20種作物中INH蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)目、理論等電點、相對分子量、氨基酸組成及高含量氨基酸所占比例以及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和疏水性/親水性，結(jié)果如表1所示，20種INH蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)目介于147～193，相對分子量介于15 324.10～21 374.97。參試INH蛋白質(zhì)中，甘薯、煙草、辣椒、番茄、南方菟絲子、馬鈴薯、芝麻、黃猴花、糙葉山黃麻、葡萄和山荊子等11種INH的理論等電點均為酸性等電點，其余9種作物INH蛋白質(zhì)的理論等電點為堿性等電點。高含量氨基酸及其比例分析結(jié)果顯示，供試20種INH蛋白質(zhì)高含量氨基酸主要為亮氨酸、絲氨酸、丙氨酸和纈氨酸。穩(wěn)定性預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，甘薯在內(nèi)的12種INH蛋白質(zhì)為穩(wěn)定性蛋白質(zhì)，南方菟絲子等其余8種INH蛋白質(zhì)為非穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。

表1 INH蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測分析

2.2 INH蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測及分析

以Threshold大于0.5為標(biāo)準(zhǔn)，如表2所示，預(yù)測參試的20種INH蛋白質(zhì)磷酸化位點和數(shù)量結(jié)果表明,供試的INH蛋白質(zhì)磷酸化位點數(shù)量最多的是絲氨酸，其次為蘇氨酸，此外番茄、馬鈴薯、小果咖啡、向日葵、黃花蒿、芝麻、糙葉山黃麻、蒺藜苜蓿、葡萄和蓖麻分別有1、1、1、3、2、1、2、1、1和1個磷酸化位點為酪氨酸。

表2 INH蛋白質(zhì)磷酸化作用位點預(yù)測結(jié)果

續(xù)表2 Continued table 2

INH來源JAZ1蛋白磷酸化位點數(shù)量絲氨酸蘇氨酸酪氨酸粉紅鐘花860糙葉山黃麻1472蒺藜苜蓿8111葡萄21101蓖麻951橙子840山荊子1530

2.3 INH蛋白質(zhì)的疏水性/親水性的預(yù)測和分析

如圖1所示，甘薯INH蛋白質(zhì)IbINH多肽鏈第26，27位絲氨酸(S)分值最低，為-2.656，親水性最強；第54位甘氨酸(G) 分值最高，為2.278，疏水性最強；總體來看，INH蛋白質(zhì)親水氨基酸數(shù)目大于疏水氨基酸數(shù)目，且親水性總平均值為-0.017，因此，推測IbINH蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。采用同樣的方法預(yù)測其他植物INH蛋白質(zhì)疏水性/親水性，從預(yù)測結(jié)果推測辣椒、番茄、馬鈴薯、向日葵、黃花蒿、粉紅鐘花、糙葉山黃麻、蒺藜苜蓿、葡萄和山荊子等INH蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)；而其余作物的INH蛋白質(zhì)推測為疏水性蛋白質(zhì)。

圖1 IbINH蛋白質(zhì)親水性/疏水性預(yù)測Fig.1 IbINH protein hydrophobicity / hydrophobicity prediction

圖2 IbINH蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測Fig.2 IbINH protein signal peptide prediction

2.4 INH信號肽的預(yù)測分析

如圖2所示，IbINH蛋白質(zhì)可能含有信號肽，信號肽概率為0.900，信號錨定概率為0.000，最大切割位點概率為0.856，位于17～18。

2.5 INH蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測和分析

如圖3所示，未發(fā)現(xiàn)IbINH有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域；其他INH蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，向日葵、黃花蒿、蒺藜苜蓿和蓖麻等4種INH具有跨膜結(jié)構(gòu)域，其中向日葵INH跨膜結(jié)構(gòu)域位于13～35位氨基酸(圖4)；黃花蒿INH跨膜結(jié)構(gòu)域位于20～42位氨基酸；蒺藜苜蓿INH跨膜結(jié)構(gòu)域位于7～26位氨基酸；蓖麻INH跨膜結(jié)構(gòu)域位于12～31位氨基酸。甘薯等其他16種物種中INH均未發(fā)現(xiàn)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.6 INH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及各元件含量預(yù)測

對甘薯等20種作物INH蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，如表3所示，供試INH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要元件為α-螺旋，其所占比例為55.96 %～72.62 %；其次為無規(guī)則卷曲，其所占比例為21.89 %～29.05 %；延伸鏈所占比例較小，為3.57 %～12.44 %；β-轉(zhuǎn)角占比最低，為1.12 %～3.65 %。

圖3 IbINH蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測Fig.3 IbINH protein transmembrane region prediction

圖4 向日葵INH蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測Fig.4 Transmembrane region prediction for INH protein of sunflower

表3 INH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及各元件含量預(yù)測

2.7 INH蛋白質(zhì)亞細胞定位預(yù)測和分析

如表4所示，供試INH可能定位在細胞質(zhì)、細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞外、高爾基體、液泡、過氧化物酶體、囊泡以及質(zhì)膜等細胞器中，其中IbINH定位在細胞質(zhì)的可能性最大，為26.1 %；定位在線粒體中的可能性其次，為17.4 %，也可能定位在細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞外、高爾基體和液泡等細胞器中。

2.8 INH蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和分析

對INH蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，供試植物INH蛋白質(zhì)均含有典型的PMEI-like超級家族功能結(jié)構(gòu)域(圖5)，因此，推測這些INH蛋白質(zhì)可能具有較為相似的功能。

表4 INH蛋白質(zhì)亞細胞定位預(yù)測

續(xù)表4 Continued table 4

INH來源蛋白質(zhì)亞細胞定位細胞質(zhì)細胞核線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞外高爾基體液泡過氧化物酶體囊泡質(zhì)膜芝麻17.413.026.117.413.0-8.74.3--茶樹4.356.521.717.4------黃猴花34.817.434.84.3--8.7---粉紅鐘花21.717.417.413.013.04.313.0---糙葉山黃麻-11.122.2-66.7-----蒺藜苜蓿-11.122.2-66.7-----葡萄-52.234.8-13.0-----蓖麻--22.2-77.8-----橙子--22.233.333.3-11.1---山荊子4.382.68.7----4.3--

圖5 IbINH氨基酸序列功能域預(yù)測Fig.5 IbINH functional prediction of amino acid sequence

2.9 IbINH蛋白質(zhì)同源建模分析

通過SWISS-MODEL在線軟件對IbINH進行蛋白質(zhì)同源建模，模型如圖6所示，從該三維結(jié)構(gòu)圖可以看出，IbINH的三維空間結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致。

3 討 論

近年來，隨著植物大規(guī)模的測序使得植物基因序列信息迅速地積累，且已證實蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制子在馬鈴薯[12]、玉米[13]、番茄[14-15]、煙草[16]等作物中廣泛存在。但對于該基因的克隆和功能闡述才剛剛開始。主要研究報道是在馬鈴薯中INH的功能研究發(fā)現(xiàn)該基因參與馬鈴薯塊莖低溫糖化的調(diào)控[17]；Biofig等[18-19]報道了在病原菌脅迫條件下，通過抑制轉(zhuǎn)化酶抑制子活性，可增強感染部分的己糖含量來抵御病菌的侵染；葉雪凌等[20]研究發(fā)現(xiàn)在黃萎病菌侵染后，野生茄根中StINH1呈下調(diào)表達，表明轉(zhuǎn)化酶抑制子可能參與植物防衛(wèi)反應(yīng)。

圖6 甘薯等INH蛋白質(zhì)空間三位結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 SWISS MODEL prediction of INH proteins

本研究利用前期研究中分離到的甘薯轉(zhuǎn)化酶抑制子全長ORF以及根據(jù)GenBank中已公布的INH同源序列，采用系列生物信息學(xué)軟件對其進行生物信息學(xué)分析，從中盡量發(fā)掘信息，從而有助于指導(dǎo)進一步的實驗研究。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，IbINH與其他作物中INH同源性并不高，但從二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果來看，供試INH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要元件均為α-螺旋，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角所占比例較少，且功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)供試植物INH蛋白質(zhì)均含有典型的PMEI-like超級家族功能結(jié)構(gòu)域，因此推測這些INH蛋白質(zhì)可能具有較為相似的功能。但是，由于INH的序列同源性較低，僅僅通過序列分析很難準(zhǔn)確預(yù)測不同作物中INH的功能，在甘薯中轉(zhuǎn)化酶抑制子是否具有參與調(diào)控甘薯抗病抗逆的功能值得我們下一步去深入研究。

4 結(jié) 論

本研究采用系列生物信息學(xué)軟件比較分析了包括甘薯在內(nèi)的20種INH的氨基酸序列，結(jié)果顯示IbINH同其他作物中INH一樣均含有典型的PMEI-like超級家族功能結(jié)構(gòu)域，二級結(jié)構(gòu)組成和比例也比較相似，INH蛋白質(zhì)定位在細胞質(zhì)的可能性最大，但是各種INH的親疏水性、穩(wěn)定性以及跨膜結(jié)構(gòu)域等不盡相同。本文為進一步研究IbINH基因功能提供了參考，為改良甘薯抗性提供了重要的基因資源。