翟思佳 黃巧 廖行偉 劉宇超 尹時華

廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧530000)

水楊酸鈉作為臨床常用藥品之一，特別是在西方國家被廣泛大量使用。大劑量的水楊酸鈉可以對從耳蝸到中樞神經(jīng)的不同聽覺系統(tǒng)層次造成聽覺損害，對耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的損傷尤甚[1,2]，并可體現(xiàn)在聽性腦干反應（ABR）和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)的改變[3,4]。水楊酸鈉對聽覺系統(tǒng)毒副作用中最明顯的三大癥狀是耳鳴、聽力下降和言語認知能力減低[5]，長期的臨床實踐發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉可以引起可逆性的耳鳴，有文獻報道給予水楊酸鈉200mg/日，持續(xù)兩周，即可建立耳鳴動物模型[6]。目前對于水楊酸鈉的作用機制尚未完全明確，尚需進一步研究。

死亡相關蛋白激酶1(death associated protein kinase 1，DAPK1)是一種鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與機體多種病理生理過程[7]，其缺失與癌癥、炎癥[8]、腦卒中[9]、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病[10]等疾病密切相關。那么DAPK1是否也參與了在水楊酸鈉誘導聽覺損害的過程呢？為此，本研究采用水楊酸鈉誘導聽覺損傷建立大鼠模型，通過ABR、DPOAE等電生理方法、HE染色及免疫組化等形態(tài)學方法檢測耳蝸的病理生理變化；基于DAPK1的轉錄表達情況，探討水楊酸鈉能否調(diào)控DAPK1表達。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 實驗動物

40只耳廓反應靈敏，未暴露于噪聲及耳毒性藥物環(huán)境的健康雄性SD大鼠(體重約300 g)購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑

DAPK1兔抗鼠多克隆抗體購自boster公司；SBAC二抗試劑盒購自boster公司；TRIZOL購自TaKaRa公司；逆轉錄盒與熒光定量PCR試劑盒均購于天根生化科技有限公司。

2.1 研究方法

2.1.1 實驗動物分組及造模

實驗前進行雙側ABR和DPOAE測試，選取反應閾小于40dB和耳聲發(fā)射篩查通過的大鼠40只，隨機分為兩組，每組20只。A組為等量生理鹽水對照組；B組為水楊酸鈉給藥實驗組，給藥方式為腹腔注射。水楊酸鈉注射量為350mg/kg/d，連續(xù)注射7天。

2.1.2 ABR檢測

于實驗前及給藥結束后動物處死前對對照組及水楊酸鈉組大鼠雙耳分別進行ABR和DPOAE測試。麻醉后的大鼠置于隔聲室,記錄電極扎入額頂正中，參考電極接同側耳廓，鼻尖接地。click短聲刺激，刺激率21次／秒，帶通濾波300～3000Hz，觀察時程15ms，疊加次數(shù)1024次,強度從90dB SPL開始遞減,以能引出可分辨Ⅱ波的最小刺激強度為ABR反應閾，并重復檢測2次。

2.1.3 DPOAE檢測

于實驗前及給藥結束后動物處死前對對照組及水楊酸鈉組大鼠雙耳分別進行DPOAE測試。麻醉后的大鼠置于隔聲室,刺激聲強度L1=65dB SPL,L2=70dB SPL,取2k、3k、4k、6k、8k、10k共6個頻率點進行測試,記錄各頻率左、右耳的平均DPOAE反應幅值。

2.1.4 標本取材及切片制備

最后一次水楊酸鈉給藥12h后，待大鼠麻醉充分后，打開胸腔進行心臟灌注，待眼珠、四肢末端發(fā)白后快速斷頭，取出聽泡后剝離出耳蝸，在解剖顯微鏡下于蝸尖處挑開小孔，用1mL注射器由蝸頂灌注4%多聚甲醛固定液，再將標本置于4%多聚甲醛中，在4℃冰箱內(nèi)固定48h。隨后將耳蝸置于10%EDTA溶液室溫脫鈣1個月，隔天更換一次脫鈣液。乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟定向包埋后平行耳蝸縱軸連續(xù)切片，片厚4μm。

2.1.5 HE染色

石蠟切片置于60℃烤箱30min，將切片取出進行二甲苯脫蠟和梯度酒精水化；蒸餾水沖洗，蘇木素染色1min，水洗；蒸餾水浸泡1min；1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水返藍30min，伊紅染色2min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，晾干封片，鏡檢。

2.1.6 免疫組化

切片常規(guī)脫蠟后，用過氧化物室溫孵育10分鐘以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次。然后進行抗原修復：將切片浸入EDTA修復液中,微波爐中高火加熱至沸騰后斷電，間隔1-5min，中高火8min，自然冷卻，PBS洗三次。滴加封閉液于37℃放置30分鐘，甩去多余液體。滴加稀釋比為1:25的一抗（空白對照組在此步驟以PBS緩沖液代替一抗進行孵育），37℃2小時，PBS洗7分鐘×3次。滴加二抗，37℃30分鐘，PBS洗7分鐘×3次。滴加試劑SABC,37℃30分鐘，PBS洗7分鐘×3次。使用DAB顯色劑室溫顯色，蒸餾水洗滌。蘇木素復染，酒精分化，反藍，封片。顯微鏡觀察。細胞胞漿有棕黃色顆粒者為陽性表達，無棕黃色者為陰性表達。在200倍鏡視野下拍照，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測定單位面積陽性細胞表達的平均光密度值（Average optical densities，AOD）。

2.1.7 RNA提取

將大鼠麻醉后迅速取出雙側耳蝸，置入RNA保存液中，在解剖顯微鏡下剝離蝸殼，取出膜迷路組織，迅速放入已加入300μl TRIZOL的1.5mLEP管中，用玻璃研磨棒在EP管中快速研磨碎，另加入700μl TRIZOL，冰上放置10min。4℃ 12000g，離心5min，吸取上清液到另一無酶EP管中，加入200μl氯仿，震蕩15s，冰上靜置5min。4℃ 12000g，離心15min，小心吸取上層清液入新的無酶EP管中，切勿吸取到中間層。耳蝸組織中膠原含量高，本實驗采用mRNA改良提取法：用200μl異丙醇與200μl高鹽溶液（0.8mol/L檸檬酸鈉與1.2mol/L NaCl的混合液）沉淀RNA，提高RNA純度，顛倒混勻后冰上靜置10min。4℃12000g離心10min，棄上清保留沉淀，加入75%乙醇1mL洗滌沉淀。4℃12000g離心5min，倒去乙醇，用小槍頭吸取殘留液體，室溫晾干，然后將RNA溶于無酶水中，微量核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度，OD260/OD280比值必須在1.7～2.0之間。

2.1.8 熒光定量PCR

將mRNA反轉錄為cDNA，RT-PCR檢測各樣本DAPK1表達，反應條件:95℃30s，95℃5s，56℃30s，72℃30s，總共38個循環(huán)。以GPHAD為內(nèi)參對照，每組設3個復孔，重復3次，計算平均值。引物序列:DAPK1 F:5'-AAGGCCTCCTCTGTGTTCAAG-3'，R:5'-CCCTTGCACGTCAGTCCATAA-3'。GPHAD F:5'-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3'；R:5'-TGAACTTGCCGTGGGTAGAG3-3'。

2 結果

2.1 原給藥后各組動物ABR閾值比較

用ABR評估給藥前后各組大鼠的聽力情況（如圖1及圖2）。給藥前大鼠閾值為31.79±4.13 dB SPL，造模第7天對照組動物ABR閾值為32.14±3.78 dB SPL，實驗組為50±4.8dB SPL，給藥前、后對照組聽力閾值變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而給藥后水楊酸鈉組大鼠聽閾較給藥前及對照組均顯著升高,采用獨立t檢驗，t=-10.931，P＜0.001。且隨給聲刺激強度減小，各波潛伏期延長，波形分化逐漸變差，至閾值以下，波形不能辨認。這與吳莎[11]、陳抗松[12]等人的研究結果一致，大劑量注射水楊酸鈉明顯影響大鼠ABR閾值及波形，說明造模成功，大劑量水楊酸鈉對大鼠聽覺系統(tǒng)造成了一定損傷。

圖1 水楊酸鈉給藥前后各組大鼠ABR檢測結果波形變化A動物給藥前的測試波形；B給藥后對照組動物動物ABR波形；C給藥后水楊酸鈉組動物ABR波形。Fig.1 Waveform changes in ABR test results of rats in each group before and after salicylate administration.A shows the test waveform before animal administration;B shows the waveform of ABR in the control animal after administration;C is the the ABR waveform of the sodium salicylate group animal after administration.

圖2 水楊酸鈉給藥前后各組ABR反應閾檢測情況（n=40,control group為對照組，SS group為水楊酸鈉組；橫坐標為水楊酸鈉給藥時間，縱坐標為ABR聽力閾值。給藥后control組動物ABR閾值為32.14±3.78 dB SPL，SS組為50±4.8dB SPL，SS組較control組顯著升高，且P＜0.01,t=-10.931，P=0.000）。Fig.2 Detection of ABR response threshold before and after sodium salicylate administration(n=40,SS group is sodium salicylate group;abscissa is sodium salicylate administration time,ordinate is ABR hearing threshold.After administration,the ABR threshold of the control group was 32.14±3.78 dB SPL,and the SS group was 50±4.8dB SPL.The SS group was significantly higher than the control group,and P＜0.01 t=-10.931，P=0.000).

2.2 原給藥后各組動物DPOAE值比較

于給藥前選擇耳聲發(fā)射篩查通過的大鼠進行實驗，給藥結束后再次對各組大鼠進行耳聲發(fā)射檢測，采用獨立t檢驗進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)造模7天后水楊酸鈉組大鼠較給藥前及對照組2k（t=3.131,P=0.004）、3k（t=2.909,P=0.008）、4k（t=3.530 P=0.002）、6K（t=2.340,P=0.029）、8k（t=3.676,P=0.001）DPOAE幅值顯著下降，而對照組給藥前后DPOAE幅值無明顯變化，P＞0.05（如表1與圖3所示），提示大劑量水楊酸鈉給藥造成了聽力損失，聽覺損傷[13]。

圖3 水楊酸鈉給藥前后各組DPOAE檢測情況（before modeling為給藥前大鼠(n=40),control group為對照組(n=20)，SS-group為水楊酸鈉組(n=20)；橫坐標為耳聲發(fā)射頻率，縱坐標為DP值。給藥后水楊酸鈉組較給藥前及對照組2k（t=3.131,P=0.004）、3k（t=2.909,P=0.008）、4k（t=3.530 P=0.002）、6k（t=2.340,P=0.029）、8k（t=3.676,P=0.001）DPOAE幅值顯著下降，且P＜0.05；而對照組較給藥前DPOAE幅值無明顯變化，P＞0.05。）Fig.3 Detection of DPOAE in each group before and after salicylate administration(SS group is sodium salicylate group;abscissa is DPOAE frequency,ordinate is DP value.The amplitude of DPOAE in the SS group(n=20)was significantly lower than animals before SS administrator(n=40)and the control group(n=20)in 2k（t=3.131,P=0.004）,3k（t=2.909,P=0.008）,4k（t=3.530 P=0.002）,6k（t=2.340,P=0.029）,8k（t=3.676,P=0.001）,and P＜0.05.However,the control group had no significant change in the amplitude of DPOAE compared to animals before modeling,P＞0.05.

2.3 HE染色觀測給藥后各組動物耳蝸損傷情況

造模7d后，通過HE染色觀察各組大鼠耳蝸損傷情況，可以觀察到對照組耳蝸結構正常（如圖4A）；而水楊酸鈉組耳蝸SNG細胞明顯變形，移位，部分溶解消失，Corti器也存在有一定程度的細胞萎縮，螺旋緣、血管紋未見明顯變化（如圖4B）。說明造模后水楊酸鈉組大鼠較對照組的顯著損傷主要集中在SNG區(qū)域，大劑量注射水楊酸鈉明顯影響大鼠聽覺器官耳蝸。

圖4 HE染色觀察各組耳蝸損傷情況A箭頭所指為給藥后對照組耳蝸SNG區(qū)域；B箭頭所指為給藥后水楊酸鈉組耳蝸SNG區(qū)域；C箭頭所指為給藥后對照組Corti器；D箭頭所指為水楊酸鈉組Corti器。A，B×400；C，D×200。Fig.4 HE staining was used to observe the cochlear injury in each group A arrow indicates the cochlear SNG area of the control group after administration;B arrow indicates the cochlea SNG area of sodium salicylate group after administration.;C arrows refer to the Corti device in the control group;D arrows refer to the Corti device in the sodium salicylate group.A,B×400;C,D×200.)

表1 水楊酸鈉給藥前后各組大鼠耳聲發(fā)射檢測結果變化Table 1 Changes in DPOAE test results of rats in each group before and after salicylate administration

2.4 免疫組化檢測各組大鼠耳蝸中DAPK1蛋白表達

造模成功后，運用免疫組化技術檢測各組耳蝸中DAPK1蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)DAPK1在對照組和水楊酸鈉組的大鼠耳蝸中均有表達，主要表達于螺旋神經(jīng)節(jié)(SNG)處，以及螺旋緣(SLM)、血管紋（StV）、Corti器(OC)也有一定表達。在圖5A正常對照組中各區(qū)域呈強陽性表達，圖5B水楊酸鈉組中呈弱陽性表達，5C空白陰性對照組中呈陰性表達，其中實驗組較對照組DAPK1表達明顯減少，發(fā)生DAPK1表達差異變化的區(qū)域與HE觀測到的水楊酸鈉誘導的耳蝸組織細胞損傷的部位大致相同，主要集中于SNG區(qū)域，這說明水楊酸鈉致耳蝸SNG損傷的同時下調(diào)了該區(qū)域的DAPK1表達，二者具有緊密關聯(lián)。進行光密度計數(shù)，正常對照組的平均光密度值（AOD）為0.022±0.002，水楊酸鈉組為0.012±0.003,采用獨立t檢驗統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉組表達較正常對照組表達減少（t=8.687，P=0.000），差異具有統(tǒng)計學意義（見圖6）。

圖5 免疫組化染色檢測各組DAPK1表達情況A正常對照組；B水楊酸鈉給藥組；C空白陰性對照組。紅色箭頭所示為SNG，藍色箭頭為OC，綠色箭頭為StV，黑色箭頭為SLM。A,B,C×200。Fig.5 Immunohistochemical staining for the expression of DAPK1 in each group A normal control group,B sodium salicylate administration group,C blank negative control group.The red arrow shows SNG,blue arrow is OC,green arrow is StV,black arrow is SLM.A,B,C×200.

圖6 各組大鼠耳蝸DAPK1表達平均光密度計數(shù)（AOD）control：對照組(n=10)，SS：水楊酸鈉組(n=10)，橫坐標為組別，縱坐標為AOD值，*P＜0.01。Fig.6 Mean optical density count(AOD)of DAPK1 in the cochlea of each group was detected control:the control group(n=10),SS:the sodium salicylate administrator group(n=10),abscissa is group,ordinate isAOD value,*P＜0.01.

2.5 熒光定量PCR

提取DAPK1 mRNA OD260/OD280比值在1.7～2.0之間，熒光定量反應曲線見圖7，計算2-△CT作為DAPK1 mRNA的相對表達量，control組的相對表達量為1.03±0.33，SS組為0.10±0.04。采用獨立t檢驗統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉組mRNA相對表達量較對照組表達減少（t=7.891，P=0.000），差異具有統(tǒng)計學意義（見圖8），L.WEI等人曾發(fā)現(xiàn)耳蝸器官體外培養(yǎng)過程中，經(jīng)水楊酸鈉處理12h后PCR檢測發(fā)現(xiàn)DAPK1基因下調(diào)[14]，這與本研究關于耳蝸的動物在體研究的結果相一致，均提示聽覺耳蝸損傷伴隨DAPK1的下調(diào)。

圖7 熒光定量PCR反應曲線A對照組擴增曲線；B對照組溶解曲線；C為水楊酸鈉組擴增曲線；D為水楊酸鈉組溶解曲線。對照組DAPK1 mRNA的△CT為4.54±0.56，水楊酸鈉組為7.94±0.62。Fig.7 Fluorescence quantitative PCR reaction curve A control curve of the control group;B dissolution curve of the control group;C amplification curve of the sodium salicylate group;D dissolution curve of the sodium salicylate group.The DAPK1 mRNA of the control group△CT was 4.54±0.56,and sodium salicylate group was 7.94±0.62.

圖8 各組DAPK1 mRNA的相對表達量control:對照組(n=10)，SS:水楊酸鈉組(n=10)，橫坐標為組別，縱坐標為mRNA相對表達量，*P＜0.01。Fig.8 Relative expression of DAPK1 mRNA in each group control:the control group,SS:the sodium salicylate group,abscissa is group,ordinate is mRNA relative expression,*P＜0.01.

3 討論

大劑量的水楊酸鈉可以對從耳蝸到中樞神經(jīng)的不同聽覺系統(tǒng)層次造成聽覺損害，尤其損傷耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)，造成耳鳴、聽力下降和言語認知能力減低。本研究通過電生理檢測發(fā)現(xiàn)SS組的ABR閾移變大、DP幅度下降，說明水楊酸鈉給藥造成動物模型聽覺損傷。通過形態(tài)學方法觀測耳蝸組織切片，發(fā)現(xiàn)SS給藥后耳蝸的細胞損傷主要在SNG區(qū)域，Corti器也有一定程度萎縮，其余部位螺旋緣、血管紋等形態(tài)學變化并不明顯。而免疫組化、熒光定量PCR結果顯示SS組DAPK1的轉錄表達較control組顯著下調(diào),并且下調(diào)改變集中在耳蝸的螺旋神經(jīng)節(jié)(SNG)區(qū)域，以及螺旋緣(SLM)、血管紋（StV）、Corti器(OC)，發(fā)生DAPK1表達差異變化的部位與HE觀測到的水楊酸鈉誘導的耳蝸組織細胞損傷的部位大致相同，均主要集中于SNG區(qū)域，這說明水楊酸鈉致耳蝸SNG損傷的同時下調(diào)了該區(qū)域的DAPK1表達，二者具有緊密關聯(lián)。L.WEI等人[14]也曾發(fā)現(xiàn)耳蝸SNG原代細胞體外培養(yǎng)過程中，經(jīng)水楊酸鈉處理12h后PCR檢測發(fā)現(xiàn)在螺旋神經(jīng)節(jié)損傷的同時SNG細胞中的DAPK1基因下調(diào)，本研究的結果與其相一致。綜上所述，我們證實在動物模型聽覺損傷過程中，螺旋神經(jīng)節(jié)損傷的同時SNG細胞中的DAPK1表達下降，水楊酸鈉可能通過調(diào)節(jié)SNG中DAPK1的轉錄表達而損傷聽覺系統(tǒng)，繼而造成耳鳴、聽力下降和言語認知能力減低等癥狀出現(xiàn)。

DAPK1具有在細胞凋亡和炎性調(diào)節(jié)的雙重作用。一方面，DAPK1作為γ-干擾素誘導的程序性細胞死亡的陽性介質，在各類疾病研究中往往作為正性促凋亡因子，參與細胞凋亡通路[15]。而本課題組前期研究證實水楊酸鈉誘導SNG凋亡[16]，結合DAPK1在水楊酸鈉模型中的下調(diào)，DAPK1可能具有雙重凋亡調(diào)控作用，既可促進凋亡，亦可抑制凋亡，但DAPK1負性調(diào)控凋亡的文章至今鮮有報道，尚需進一步探討研究。另一方面，DAPK1扮演炎性調(diào)節(jié)角色，既具有產(chǎn)生IL-1β和IL-18等促炎信號傳導的作用，同時也可以負調(diào)控多種炎癥基因[17]，例如DAPK1抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）或脂多糖（LPS）誘導的NF-κB活化和促炎細胞因子的表達[18]，因此DAPK1在炎性反應調(diào)節(jié)過程中對不同細胞類型和環(huán)境因素的改變將會做出不同的調(diào)節(jié)反應。其中DAPK1作為抗炎因子參與多種疾病[8,19]。在DAPK敲除鼠模型中，LPS誘導NF-κB表達，加劇了肺的炎癥反應[20]。在腸道炎癥中，DAPK甲基化導致DAPK低表達，使炎癥的嚴重程度增加[21]。

最新研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥是水楊酸鈉誘導聽覺損傷的新機制，水楊酸鈉會導致多種炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-1在耳蝸中上調(diào)[22,23]，而DAPK1作為抗炎因子可抑制多種炎癥因子，結合本研究發(fā)現(xiàn)DAPK1由于水楊酸鈉的耳毒性作用而表達下調(diào)，我們不妨推測DAPK1在水楊酸鈉模型中對螺旋神經(jīng)節(jié)細胞扮演著抑制炎性反應的角色，水楊酸鈉可能通過下調(diào)DAPK1而使耳蝸的促炎因子過表達，造成耳蝸的炎性反應，繼而導致聽覺損傷。因此，我們認為DAPK1參與水楊酸鈉致聽覺系統(tǒng)損傷繼而發(fā)生耳鳴、聽力下降的過程，尤其是螺旋神經(jīng)節(jié)的損傷。并推測水楊酸鈉可能通過下調(diào)DAPK1誘導耳蝸炎癥因子的產(chǎn)生來完成這個過程，但其具體調(diào)節(jié)機制仍需進一步探究。