張福娟

(朝陽師范高等?？茖W(xué)校 生化工程系，遼寧 朝陽 122000)

0 引言

我國是世界畜牧生產(chǎn)大國之一.隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，人畜共糧矛盾凸顯，環(huán)境污染的惡化和農(nóng)藥抗生素的殘留造成的各種食品安全問題也日益增多，一種能夠緩解這些問題的方法便是研發(fā)微生態(tài)發(fā)酵飼料[1-3].微生態(tài)發(fā)酵飼料通過菌種發(fā)酵產(chǎn)生豐富的酶系和益生菌，減少甚至替代抗生素的使用，降低環(huán)境污染，減少農(nóng)藥殘留，提高動物的生產(chǎn)性能和肉品的安全性，是當(dāng)前畜牧養(yǎng)殖發(fā)展的新趨勢[4-5].目前，微生態(tài)發(fā)酵飼料多以單一菌種為主，這類發(fā)酵方式往往功效小且效果單一.多菌種發(fā)酵飼料能夠改善此類問題，但多菌種發(fā)酵方式由于受到多菌種之間生長條件的相互制約，發(fā)酵過程比較復(fù)雜，發(fā)酵產(chǎn)物難以控制[6-7]，所以多菌種共同發(fā)酵生產(chǎn)飼料是研究難點(diǎn)[8].

本研究中以飼料常用原料麩皮作為主要發(fā)酵基質(zhì)，以黑曲霉和熱帶假絲酵母作為發(fā)酵菌劑進(jìn)行微生態(tài)固態(tài)發(fā)酵飼料實(shí)驗(yàn)，成品最終的粗纖維和粗蛋白含量作為衡量指標(biāo)，探索微生態(tài)固態(tài)發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，為微生態(tài)發(fā)酵飼料的生產(chǎn)和研發(fā)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料和菌種

麩皮：市售.

黑曲霉和熱帶假絲酵母：均購于中國科學(xué)院微生物研究所菌保中心.

1.1.2 藥品

氫氧化鈉、98%硫酸、無水硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅、無水乙醇、溴甲酚綠、硼酸、蔗糖、硫酸銨，全部為分析純試劑；石蕊試紙.

1.1.3 儀器與設(shè)備

微量凱氏定氮裝置，DHG-914385-Ⅲ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)，9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱(蘇州江東精密儀器有限公司)，AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，SW-CJ-2FD型超凈工作臺(上海予騰生物科技有限公司)，高壓滅菌鍋(上海茸研儀器有限公司)，容量瓶，移液管，酸式滴定管，錐形瓶，電子萬用爐.

1.1.4 培養(yǎng)基

1.1.4.1 PDA固體培養(yǎng)基

取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1000 mL ,80 ℃浸泡1 h，用紗布過濾，然后補(bǔ)足失水至1000 mL,121 ℃滅菌20 min，即得20%馬鈴薯浸汁，貯存?zhèn)溆?每100 mL馬鈴薯浸汁加入2 g葡萄糖，加熱煮沸后每100 mL馬鈴薯浸汁加入2 g瓊脂，繼續(xù)加熱融化并補(bǔ)足失水,分裝，加塞，包扎,高壓蒸汽滅菌(121 ℃滅菌20 min),臥斜，使試管內(nèi)部液體呈斜面狀態(tài)，待冷卻后30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，排除冷凝水，觀察試管培養(yǎng)基表面光滑無菌則可以接菌.

1.1.4.2 PDA液體培養(yǎng)基

馬鈴薯20%，葡萄糖2%.具體制作：取200 g去皮的馬鈴薯，切成塊煮沸30 min，然后用200目紗布過濾，再加入上述其他原料補(bǔ)足1000 mL水，121 ℃滅菌20 min.

1.1.4.3 麥芽汁培養(yǎng)基

12°Bx 麥芽汁，121 ℃滅菌20 min.

1.1.4.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

裝料：按照一定的含水量對麩皮進(jìn)行拌料，每kg混合料加入2 mL濃硫酸；裝入三角瓶內(nèi)(50 g/瓶)，高度20～25 cm；用棉塞堵塞封口，再用16層無菌紗布封口；高壓蒸汽滅菌，100 Pa 滅菌20 min；自然冷卻.

接菌：按照一定的比例將斜面發(fā)酵菌株接種至物料上，一定溫度下培養(yǎng)一定時間.

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1.1 菌種活化

將保存的菌種分別接到PDA斜面培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng) 24～72 h，再轉(zhuǎn)接2～3次，備用.

1.2.1.2 種子液的制備

接種一環(huán)經(jīng)活化后的黑曲霉于PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng) 24～72 h；接種一環(huán)經(jīng)活化后的熱帶假絲酵母于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng) 24 h.

1.2.1.3 固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將制備好的黑曲霉種子液和熱帶假絲酵母種子液按照一定配比混合，按照不同的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行組合，開展發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.發(fā)酵結(jié)束后，60 ℃下烘干，測定發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白和粗纖維含量.

1.2.2 測定方法

粗纖維的測定：飼料中粗纖維含量的測定方法[9].

粗蛋白的檢測：采用凱氏定氮法檢測[10].

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

將發(fā)酵影響因子梯度化設(shè)計，其中含水量分別為40%、50%、60%、70%和80%，發(fā)酵溫度分別為26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃和38 ℃，發(fā)酵時間分別為24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，接種量分別為5%、10%、15%、20%和25%.四個因素、五個水平進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以粗蛋白和粗纖維含量為衡量指標(biāo)，確定單因素最佳發(fā)酵條件，為正交試驗(yàn)水平的選取提供主要參考.

1.2.4 正交試驗(yàn)

以粗蛋白、粗纖維含量為評價指標(biāo)，依次進(jìn)行黑曲霉與熱帶假絲酵母比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和含水量的單因素實(shí)驗(yàn), 并確定四因素三水平的最佳參數(shù)，進(jìn)行單因素分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 含水量對發(fā)酵底物的影響

從表1可以看出，含水量單因素實(shí)驗(yàn)中黑曲霉固態(tài)發(fā)酵含水量在40%～70%時，蛋白質(zhì)含量隨含水量的升高而增加，在70%以上卻又隨含水量的升高而逐漸降低，最優(yōu)含水量為70%，粗蛋白質(zhì)含量為22.5569%；粗纖維含量呈現(xiàn)先迅速下降再上升趨勢，含水量70%時粗纖維含量最低，為5.14%.熱帶假絲酵母發(fā)酵在含水量40%～70%時，蛋白質(zhì)含量隨含水量的升高而增加，之后隨著含水量增加蛋白質(zhì)含量下降，因此最優(yōu)含水量為70%，粗蛋白質(zhì)含量為18.5731%，此時粗纖維含量也是最低，為8.34%.所以，正交試驗(yàn)選取含水量水平參數(shù)分別為60%、70%和80%.

表1 不同含水量對黑曲霉和熱帶假絲酵母單菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的影響 單位：%

2.2 溫度對發(fā)酵底物的影響

從表2可以看出，溫度單因素實(shí)驗(yàn)中黑曲霉固態(tài)發(fā)酵最優(yōu)溫度為29 ℃，粗蛋白含量最高，為22.9314%，粗纖維含量最低，為6.40%.熱帶假絲酵母固態(tài)發(fā)酵蛋白質(zhì)含量最高、粗纖維含量最低點(diǎn)為32 ℃.所以，正交試驗(yàn)選取溫度參數(shù)分別為29 ℃、32 ℃和35 ℃.

表2 不同溫度對黑曲霉和熱帶假絲酵母單菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的影響 單位：%

2.3 時間對發(fā)酵底物的影響

從表3可以看出，時間單因素實(shí)驗(yàn)中，黑曲霉固態(tài)發(fā)酵隨時間的增長粗蛋白含量逐漸增加，粗纖維含量逐漸降低，變化幅度最大是在前期發(fā)酵24～48 h，隨后緩慢增長.熱帶假絲酵母也是在24～48 h指標(biāo)變化幅度最大.可見，兩類菌種發(fā)酵活躍期接近，有利于最大發(fā)揮效能.正交試驗(yàn)選取時間水平分別為48 h、60 h和72 h.

表3 不同時間對黑曲霉和熱帶假絲酵母單菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的影響 單位：%

2.4 接菌量對發(fā)酵底物的影響

從表4可以看出，接菌量單因素實(shí)驗(yàn)中黑曲霉固態(tài)發(fā)酵最優(yōu)接菌量為20%，熱帶假絲酵母固態(tài)發(fā)酵最優(yōu)接菌量為10%.所以，正交試驗(yàn)選取接種總量為20%，黑曲霉與熱帶假絲酵母菌種配比分別為2∶1、1∶1和3∶1.

表4 不同接菌量對黑曲霉和熱帶假絲酵母單菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的影響 單位：%

2.5 混菌的正交試驗(yàn)

由表5可見，以粗蛋白含量為衡量指標(biāo)，得黑曲霉和熱帶假絲酵母混菌發(fā)酵影響次序依次為B>C>A>D，粗蛋白含量最高的最優(yōu)組合為B2C1A2D3.以粗纖維含量為固態(tài)發(fā)酵衡量指標(biāo)，得黑曲霉和熱帶假絲酵母混菌發(fā)酵影響次序依次為B>C>D>A，粗纖維含量越低越符合微生態(tài)發(fā)酵飼料需要，所以最優(yōu)組合為B2C1D3A2.兩個衡量指標(biāo)得到一致的參數(shù)組合，這也與理論預(yù)期一致.

表5 黑曲霉和熱帶假絲酵母混菌固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)檢測結(jié)果

3 結(jié)論

黑曲霉和熱帶假絲酵母兩菌種組合發(fā)酵高產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶，提高飼料利用率，即最優(yōu)參數(shù)為：麩皮含水量70%，菌種配比為黑曲霉∶熱帶假絲酵母=2∶1，發(fā)酵溫度為32 ℃，發(fā)酵時間為72 h.在此工藝參數(shù)下固態(tài)發(fā)酵麩皮，蛋白質(zhì)含量最高，粗纖維含量最低，符合微生態(tài)發(fā)酵飼料產(chǎn)品預(yù)期.