郭麗娜，趙敏英，劉盼

早期自然流產(chǎn)是指妊娠12周之內(nèi)發(fā)生的流產(chǎn)，是臨床重點關(guān)注課題，但其涉及諸多復(fù)雜因素，約有60%的早期流產(chǎn)與胚胎染色體異常有關(guān)。常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法診斷存在較高的誤診率及漏診率，不利于臨床對自然流產(chǎn)風(fēng)險的預(yù)測。目前研究認(rèn)為加深胚胎染色體異常的診斷效能有利于提高自然流產(chǎn)風(fēng)險的預(yù)測能力，高通量測序技術(shù)檢測自然流產(chǎn)對判斷胚胎染色體有無異常具有重要作用[1-2]。王德剛等[3]研究表明，臨床采用高通量測序技術(shù)獲取全基因組數(shù)據(jù)，可作為胚胎染色體異常的診斷依據(jù)。但目前關(guān)于該方法的臨床研究仍然較少。因此，本研究選取2018年3月—2019年3月石家莊市第一醫(yī)院（我院）收治的39例自然流產(chǎn)患者，通過高通量測序技術(shù)檢測胚胎染色體，為臨床采用高通量測序技術(shù)提高胚胎染色體異常診斷水平提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年3月—2019年3月我院收治的39例自然流產(chǎn)患者。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①流產(chǎn)前影像學(xué)檢查提示胚胎停育者；②自愿參與本研究，主動提出流產(chǎn)絨毛組織染色體檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕期發(fā)生感染者；②既往有害物質(zhì)接觸史者。39例患者年齡23～38歲，平均（28.91±6.21）歲；流產(chǎn)孕周7～12周，平均（9.28±1.46）周；連續(xù)2次自然流產(chǎn)者13例，首次流產(chǎn)者4例，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者22例。

1.2 方法

1.2.1 高通量測序檢測①組織標(biāo)本留?。航o患者準(zhǔn)備私密空間，在保護(hù)患者隱私、知情同意的前提下行清宮術(shù)，給予患者常規(guī)外陰以及陰道等區(qū)域消毒，根據(jù)標(biāo)本留取原則留取胚胎絨毛組織10 g。②使用無菌鹽水多次漂洗絨毛樣組織標(biāo)本，提取基因組DNA。通過紫外可見分光光度計測定所提取DNA的濃度及純度，隨后利用瓊脂凝膠電泳判斷DNA片段的完整性。③將提取的基因組DNA打斷成小片段核酸，采用打斷后的基因組DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建。補平打斷后DNA小片段的5′端突出末端或削平3′端突出末端。采用T4 DNA連接酶，把接頭連接到DNA片段兩端，用瓊脂凝膠切膠回收的方法選擇合適范圍的片段回收，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增進(jìn)行富集。隨后再次進(jìn)行片段的選擇與純化從而得到DNA小片段文庫。利用ABI PRISM 310型基因測序儀進(jìn)行高通量測序分析。④將高通量測序針?biāo)脭?shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過序列對比觀察染色體是否存在異常。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析對采集的絨毛標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)處理，培養(yǎng)4～5 d。常規(guī)使用消化法處理細(xì)胞、制片、染色，根據(jù)鏡下觀察結(jié)果，計數(shù)20個中期分裂相，分析3～5個核型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；定性資料用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用配對卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析共檢測39例絨毛樣本，檢測失敗4例，檢測成功率89.74%。結(jié)果顯示，染色體異常21例，占樣本總例數(shù)的53.85%，染色體未見明顯異常14例（35.90%）。

在21例染色體異常樣本中，染色體數(shù)目異常19例，包括非整倍體11例（52.38%），其中三體7例（63.64%），主要涉及22號和16號染色體；單體5例（23.81%），均為Turner綜合征；四體3例（14.29%）。染色體結(jié)構(gòu)異常2例（9.52%）。見表1。

表1 21例染色體核型異常結(jié)果

2.2 高通量測序分析結(jié)果 高通量測序檢測成功率為100%。未見明顯異常的樣本共14例（35.90%），染色體異常共25例，占樣本總例數(shù)的64.10%。其中細(xì)胞培養(yǎng)檢測染色體異常的21例中，高通量測序檢測發(fā)現(xiàn)21例染色體異常，二者檢測結(jié)果一致；未見明顯異常的14例樣本中，發(fā)現(xiàn)1例三體嵌合體（46,XX/47,XX+21）、2例拷貝數(shù)變化（CNVs）[46，XX，del（4）（p16），見圖1；46，XX，del（11）（q23）]；4例檢測失敗中的樣本中，發(fā)現(xiàn)1例CNVs[46，XY，del（1）（q21）]，見圖2。

圖1 高通量測序檢測CNVs結(jié)果；46．XX，del（4）（p16）

圖2 高通量測序檢測CNVs結(jié)果；46，XY，del（1）（q21）

2.3 2種分析結(jié)果比較 高通量測序總檢出率雖高于細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析總檢出率[64.10%（25/39）vs.53.85%（21/39）]，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.250，P=0.134）。

3 討論

自然流產(chǎn)的遺傳學(xué)機制主要體現(xiàn)在染色體數(shù)目的異常變化上。當(dāng)遺傳缺陷在染色體數(shù)目異常影響下增大，進(jìn)而導(dǎo)致大量基因增加或缺失，破壞基因平衡，從而影響細(xì)胞增殖，將無法繼續(xù)妊娠，最終誘發(fā)自然流產(chǎn)[4-5]。

目前細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析在科研領(lǐng)域受到重點關(guān)注，其在自然流產(chǎn)遺傳學(xué)病因的診斷中發(fā)揮重要作用，但是其存在標(biāo)本要求高、檢測時間長等局限性[7-8]。研究表明，在細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析操作過程中需要經(jīng)過諸多步驟，繁瑣的環(huán)節(jié)影響了其推廣，而且環(huán)節(jié)越多微生物感染風(fēng)險越高，培養(yǎng)失敗率越高，加之染色體亞端粒區(qū)域的診斷難度較高，使用細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析無法獲取該區(qū)域的具體信息，即使利用高精密設(shè)備進(jìn)行小片段CNVs仍無法獲取診斷依據(jù)，所以諸多局限性使得細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析不能完全作為判斷染色體有無異常的依據(jù)[9]。

高通量測序技術(shù)可一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短。本研究的創(chuàng)新點即利用高通量測序技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析進(jìn)行對比，反映高通量測序技術(shù)的具體優(yōu)勢。研究表明，高通量測序技術(shù)可通過調(diào)整測序的深度及覆蓋度加強染色體亞端粒區(qū)域的觀察，獲取準(zhǔn)確的判斷依據(jù)，進(jìn)而為臨床了解自然流產(chǎn)的遺傳學(xué)病因提供依據(jù)，提示高通量測序技術(shù)可有效提高自然流產(chǎn)胚胎染色體異常的檢出率[10-12]。本研究結(jié)果顯示，高通量測序技術(shù)對于染色體異常的檢出率高于細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析，且在細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析中未發(fā)現(xiàn)異常的標(biāo)本，利用高通量測序技術(shù)也可檢出染色體異常，但二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與樣本量較小有關(guān)。但是在比較兩種方法檢測自然流產(chǎn)絨毛染色體過程中，仍然體現(xiàn)出高通量測序的優(yōu)勢：在39例標(biāo)本中，細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析有4例因絨毛組織培養(yǎng)失敗而不能進(jìn)行分析，無法得到結(jié)果。說明細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析對標(biāo)本要求較高，需要標(biāo)本新鮮無菌，同時需要專業(yè)人員的技術(shù)水平也較高，在一定程度上限制了其應(yīng)用。高通量測序技術(shù)檢測可行性較佳，其無較高的標(biāo)本要求，在－20℃冷凍保存14個月也能檢測成功，更有利于臨床推廣[13-15]。在本研究中，高通量測序發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析未見明顯異常的14例樣本中，發(fā)現(xiàn)染色體異常3例。傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析的方法只能檢測10 Mb以上片段的重復(fù)和缺失，無法檢測到微小片段的重復(fù)和缺失。而高通量測序可以發(fā)現(xiàn)200 Kb以上片段的重復(fù)和缺失，可以獲得更高的染色體結(jié)構(gòu)異常檢出率。從標(biāo)本檢測時長上看，細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析單個樣本檢測時間約為30 d，而高通量測序檢測時間僅10 d左右，大大縮短了患者的等待時間。

綜上所述，高通量測序檢測技術(shù)是一項有助于明確自然流產(chǎn)遺傳學(xué)因素的高效遺傳學(xué)檢測手段，可作為細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析檢查的有力補充，值得臨床推廣和廣泛應(yīng)用。