淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中的殘?zhí)强刂?/h1>
2020-06-28 06:05:50顧永華姜建友唐曉玲
河南化工 2020年5期
顧永華，崔 洋，姜建友，唐曉玲
(1.河南金丹乳酸科技股份有限公司，河南 鄲城 477150 ； 2.天津大學(xué)，天津 300072)
乳酸(lactic acid)又名2-羥基丙酸(α-羥基丙酸，丙醇酸)。其分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此具有光學(xué)異構(gòu)現(xiàn)象，具有L-型和D-乳酸兩種[1]。L-乳酸生產(chǎn)主要是以淀粉質(zhì)為原料經(jīng)微生物發(fā)酵精制而成，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、新材料、飼料等領(lǐng)域。以乳酸為單體合成的聚乳酸(PLA)可替代石油原料制成的塑料制品，被認(rèn)為是當(dāng)前最有前途的生物可降解高分子材料。
實(shí)驗(yàn)室研究中，L-乳酸生產(chǎn)主要采用結(jié)晶葡萄糖為原料，發(fā)酵結(jié)束后的殘?zhí)禽^少。但受生產(chǎn)成本限制，工業(yè)化生產(chǎn)中，L-乳酸多以淀粉質(zhì)為原料，經(jīng)液化、糖化、發(fā)酵進(jìn)行制備。發(fā)酵結(jié)束后不可避免地會(huì)殘留一部分乳酸菌種無法利用的糖類，這部分糖被稱為發(fā)酵殘?zhí)牵纸邪l(fā)酵殘總糖，其中的還原性糖類，被稱為發(fā)酵殘還原糖。殘?zhí)橇渴怯绊慙-乳酸經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)品質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，殘?zhí)橇扛?，則發(fā)酵產(chǎn)酸相應(yīng)較低，同時(shí)會(huì)增加L-乳酸的提取難度，降低L-乳酸提取收率，也影響成品的色度和殘?zhí)呛?。雖然L-乳酸發(fā)酵工藝已經(jīng)較為成熟，但發(fā)酵殘?zhí)堑目刂迫允钱?dāng)前L-乳酸工業(yè)生產(chǎn)企業(yè)面臨的主要難題。本研究通過優(yōu)化L-乳酸發(fā)酵工藝，平穩(wěn)控制L-乳酸的菌體生長速率及產(chǎn)物合成速率，達(dá)到降低發(fā)酵殘?zhí)堑哪康?，為L-乳酸生產(chǎn)企業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量和效益提供借鑒。
1 材料和方法
1.1 菌種
凝結(jié)芽孢桿菌JD-24625，河南省乳酸工程技術(shù)研究中心分離和保藏。
1.2 培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基：乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基MRS。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉糖水160 g/L，適量營養(yǎng)鹽，pH值自然。
1.3 培養(yǎng)方法
種子培養(yǎng)：115 ℃高壓滅菌15 min，接入乳酸菌種，溫度45 ℃±1 ℃，100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。發(fā)酵培養(yǎng)：裝入發(fā)酵罐容積60%的發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1 MPa蒸汽滅菌30 min。接入適量菌種，溫度50 ℃±1 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速75 r/min發(fā)酵培養(yǎng)。
1.4 分析方法
發(fā)酵殘總糖和殘還原糖，費(fèi)林試劑熱滴定法；發(fā)酵液中葡萄糖，生物傳感分析儀；光學(xué)純度和發(fā)酵液中L-乳酸，高壓液相色譜法；OD值(光密度)，發(fā)酵液分光光度計(jì)600 nm波長處的吸光值；pH值，酸度計(jì)。
2 結(jié)果和討論
2.1 接種量對(duì)L-乳酸光學(xué)純度和發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊?/h3>
L-乳酸發(fā)酵過程中，接種量的大小直接影響發(fā)酵料L-乳酸的光學(xué)純度和發(fā)酵殘?zhí)恰］^大的接種量可以縮短發(fā)酵周期，但會(huì)引起菌體初期生長加快，發(fā)酵培養(yǎng)基糖分和營養(yǎng)物質(zhì)消耗速率過快，菌體易進(jìn)入早衰期，后期發(fā)酵耗糖和產(chǎn)酸能力降低[2]。較少的接種量，則會(huì)延長發(fā)酵周期，易造成發(fā)酵不徹底，并且增加發(fā)酵培養(yǎng)基染雜菌的幾率，從而會(huì)降低發(fā)酵料L-乳酸純度。因此，淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中，適宜的接種量對(duì)控制發(fā)酵殘?zhí)呛蚅-乳酸光學(xué)純度十分必要。試驗(yàn)不同接種量對(duì)L-乳酸光學(xué)純度和發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊懀Y(jié)果見圖1。
由圖1可知，當(dāng)接種量≤10%時(shí)，發(fā)酵殘?zhí)禽^低且變化不大，為(0.52～0.53)g/(100 mL)，但L-乳酸光學(xué)純度降低明顯。當(dāng)接種量≥12%時(shí)，L-乳酸光學(xué)純度達(dá)到最高，隨著接種量增大光學(xué)純度一定程度下降，同時(shí)發(fā)酵殘?zhí)茄杆僭黾印?shí)際生產(chǎn)中，選擇L-乳酸光學(xué)純度盡可能大，發(fā)酵殘?zhí)潜M可能低為最佳指標(biāo)范圍。最佳的接種量10%～12%。
圖1 接種量對(duì)發(fā)酵料L-乳酸光學(xué)純度和發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊?/p>
2.2 不同中和劑濃度對(duì)L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)呛桶l(fā)酵周期的影響
目前L-乳酸發(fā)酵過程中，pH值調(diào)控采用的中和劑被報(bào)道較多的氨水和NaOH，但因L-乳酸后提取困難，在現(xiàn)有L-乳酸生產(chǎn)中較少被使用[3]。鈣中和劑仍是L-乳酸工業(yè)化生產(chǎn)的主流，我們采用Ca(OH)2為中和劑，在5 t容積的發(fā)酵罐中，試驗(yàn)不同濃度的中和劑對(duì)L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)呛桶l(fā)酵周期的影響，結(jié)果見圖2。
圖2 不同中和劑濃度對(duì)L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)呛桶l(fā)酵周期的影響
由圖2可知，中和劑氫氧化鈣的濃度對(duì)L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)呛桶l(fā)酵周期有較大的影響。當(dāng)中和劑濃度>14%時(shí)，發(fā)酵周期變化不大，發(fā)酵殘?zhí)请S著濃度增大迅速增加，這是由于過高的中和劑濃度，在流加進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)基過程中，會(huì)在發(fā)酵罐局部造成堿性過高，從而抑制了菌體的生長和性能。當(dāng)中和劑濃度<12%時(shí)，發(fā)酵殘?zhí)亲兓淮螅l(fā)酵周期過長，這是由于過低的中和劑濃度，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH值速度過慢，并且使培養(yǎng)基體積增加，L-乳酸和菌體濃度被稀釋，降低了發(fā)酵效率。因此，L-乳酸工業(yè)化生產(chǎn)過程中，必須穩(wěn)控中和劑濃度，以確保發(fā)酵調(diào)控加堿的穩(wěn)定性。中和劑濃度在12%～14%時(shí)，發(fā)酵殘?zhí)窍鄬?duì)較少，發(fā)酵周期短，選擇最佳中和劑氫氧化鈣的濃度范圍為12%～14%。
2.3 pH值分段控制對(duì)發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊?/h3>
L-乳酸發(fā)酵過程中，由于菌種生長需要經(jīng)歷遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，只有控制條件使菌體在各生長階段處于較佳的環(huán)境中，才能最大限度地合成產(chǎn)物，但單一因素滿足菌種生長各階段的最佳值是不一樣的，這就必須對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行分階段控制[3-5]。pH值對(duì)于處于生長期的兼性厭氧菌來說是必須的，若在菌體生長期通過控制pH值進(jìn)行控制菌體生長快慢，從而為菌體生長與代謝提供適當(dāng)?shù)奈h(huán)境，控制菌體生長快慢的同時(shí)，進(jìn)而可控制平穩(wěn)的降糖速率。L-乳酸發(fā)酵前期，菌種增長較快，通過一定程度降低發(fā)酵pH值，可以降低菌種增速，避免菌種進(jìn)入早衰期。發(fā)酵pH值在穩(wěn)定期維持一段時(shí)間之后回升，可保持菌種活性，增加產(chǎn)酸。L-乳酸菌種進(jìn)入衰亡期，適當(dāng)降低pH值，有利于L-乳酸光學(xué)純度的提升和降低殘?zhí)?。試?yàn)L-乳酸發(fā)酵過程中pH值分段控制對(duì)菌體生長的影響，見圖3，pH值一直維持6.0發(fā)酵對(duì)菌體生長的影響見圖4，pH值分段控制與單一pH值發(fā)酵結(jié)果對(duì)比見表1。
圖3 發(fā)酵過程中pH值分段調(diào)控對(duì)菌體平穩(wěn)生長的影響
圖4 pH值6.0發(fā)酵菌體生長情況
表1 分段控制pH值與單一pH值發(fā)酵結(jié)果對(duì)比
由圖3、圖4和表1可知，L-乳酸發(fā)酵過程pH值分段控制，較單一pH值發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)酸、糖酸轉(zhuǎn)化率和L-乳酸光學(xué)純度均提高明顯，發(fā)酵殘?zhí)墙档托Ч@著。這是由于單一pH值發(fā)酵，菌種對(duì)數(shù)期生長較快，營養(yǎng)物質(zhì)過快地被消耗，后期菌種易進(jìn)入早衰，產(chǎn)酸、耗糖等能力下降。同時(shí)說明通過pH值分段控制，穩(wěn)控菌體生長速率及產(chǎn)酸合成速率，是影響L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)堑闹饕蛩?。因此，發(fā)酵過程中實(shí)施pH值分段控制，能對(duì)L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)較好地進(jìn)行穩(wěn)控。
3 結(jié)論
在L-乳酸發(fā)酵過程中，發(fā)酵殘?zhí)鞘前l(fā)酵質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，平穩(wěn)控制乳酸的菌體生長速率及乳酸合成速率，是控制發(fā)酵殘?zhí)堑闹饕蛩亍１驹囼?yàn)研究了接種量、中和劑濃度和pH值對(duì)L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊懀贸鼋臃N量范圍10%～12%，中和劑氫氧化鈣的濃度范圍12%～14%，發(fā)酵過程采用pH值分段控制的方式，發(fā)酵殘?zhí)禽^低，可為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)中穩(wěn)控發(fā)酵殘?zhí)翘峁┫嚓P(guān)參考。
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顧永華，崔 洋，姜建友，唐曉玲
(1.河南金丹乳酸科技股份有限公司，河南 鄲城 477150 ； 2.天津大學(xué)，天津 300072)
乳酸(lactic acid)又名2-羥基丙酸(α-羥基丙酸，丙醇酸)。其分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此具有光學(xué)異構(gòu)現(xiàn)象，具有L-型和D-乳酸兩種[1]。L-乳酸生產(chǎn)主要是以淀粉質(zhì)為原料經(jīng)微生物發(fā)酵精制而成，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、新材料、飼料等領(lǐng)域。以乳酸為單體合成的聚乳酸(PLA)可替代石油原料制成的塑料制品，被認(rèn)為是當(dāng)前最有前途的生物可降解高分子材料。
實(shí)驗(yàn)室研究中，L-乳酸生產(chǎn)主要采用結(jié)晶葡萄糖為原料，發(fā)酵結(jié)束后的殘?zhí)禽^少。但受生產(chǎn)成本限制，工業(yè)化生產(chǎn)中，L-乳酸多以淀粉質(zhì)為原料，經(jīng)液化、糖化、發(fā)酵進(jìn)行制備。發(fā)酵結(jié)束后不可避免地會(huì)殘留一部分乳酸菌種無法利用的糖類，這部分糖被稱為發(fā)酵殘?zhí)牵纸邪l(fā)酵殘總糖，其中的還原性糖類，被稱為發(fā)酵殘還原糖。殘?zhí)橇渴怯绊慙-乳酸經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)品質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，殘?zhí)橇扛?，則發(fā)酵產(chǎn)酸相應(yīng)較低，同時(shí)會(huì)增加L-乳酸的提取難度，降低L-乳酸提取收率，也影響成品的色度和殘?zhí)呛?。雖然L-乳酸發(fā)酵工藝已經(jīng)較為成熟，但發(fā)酵殘?zhí)堑目刂迫允钱?dāng)前L-乳酸工業(yè)生產(chǎn)企業(yè)面臨的主要難題。本研究通過優(yōu)化L-乳酸發(fā)酵工藝，平穩(wěn)控制L-乳酸的菌體生長速率及產(chǎn)物合成速率，達(dá)到降低發(fā)酵殘?zhí)堑哪康?，為L-乳酸生產(chǎn)企業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量和效益提供借鑒。
1 材料和方法
1.1 菌種
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1.2 培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基：乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基MRS。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉糖水160 g/L，適量營養(yǎng)鹽，pH值自然。
1.3 培養(yǎng)方法
種子培養(yǎng)：115 ℃高壓滅菌15 min，接入乳酸菌種，溫度45 ℃±1 ℃，100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。發(fā)酵培養(yǎng)：裝入發(fā)酵罐容積60%的發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1 MPa蒸汽滅菌30 min。接入適量菌種，溫度50 ℃±1 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速75 r/min發(fā)酵培養(yǎng)。
1.4 分析方法
發(fā)酵殘總糖和殘還原糖，費(fèi)林試劑熱滴定法；發(fā)酵液中葡萄糖，生物傳感分析儀；光學(xué)純度和發(fā)酵液中L-乳酸，高壓液相色譜法；OD值(光密度)，發(fā)酵液分光光度計(jì)600 nm波長處的吸光值；pH值，酸度計(jì)。
2 結(jié)果和討論
2.1 接種量對(duì)L-乳酸光學(xué)純度和發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊?/h3>
L-乳酸發(fā)酵過程中，接種量的大小直接影響發(fā)酵料L-乳酸的光學(xué)純度和發(fā)酵殘?zhí)恰］^大的接種量可以縮短發(fā)酵周期，但會(huì)引起菌體初期生長加快，發(fā)酵培養(yǎng)基糖分和營養(yǎng)物質(zhì)消耗速率過快，菌體易進(jìn)入早衰期，后期發(fā)酵耗糖和產(chǎn)酸能力降低[2]。較少的接種量，則會(huì)延長發(fā)酵周期，易造成發(fā)酵不徹底，并且增加發(fā)酵培養(yǎng)基染雜菌的幾率，從而會(huì)降低發(fā)酵料L-乳酸純度。因此，淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中，適宜的接種量對(duì)控制發(fā)酵殘?zhí)呛蚅-乳酸光學(xué)純度十分必要。試驗(yàn)不同接種量對(duì)L-乳酸光學(xué)純度和發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊懀Y(jié)果見圖1。
由圖1可知，當(dāng)接種量≤10%時(shí)，發(fā)酵殘?zhí)禽^低且變化不大，為(0.52～0.53)g/(100 mL)，但L-乳酸光學(xué)純度降低明顯。當(dāng)接種量≥12%時(shí)，L-乳酸光學(xué)純度達(dá)到最高，隨著接種量增大光學(xué)純度一定程度下降，同時(shí)發(fā)酵殘?zhí)茄杆僭黾印?shí)際生產(chǎn)中，選擇L-乳酸光學(xué)純度盡可能大，發(fā)酵殘?zhí)潜M可能低為最佳指標(biāo)范圍。最佳的接種量10%～12%。
圖1 接種量對(duì)發(fā)酵料L-乳酸光學(xué)純度和發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊?/p>
2.2 不同中和劑濃度對(duì)L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)呛桶l(fā)酵周期的影響
目前L-乳酸發(fā)酵過程中，pH值調(diào)控采用的中和劑被報(bào)道較多的氨水和NaOH，但因L-乳酸后提取困難，在現(xiàn)有L-乳酸生產(chǎn)中較少被使用[3]。鈣中和劑仍是L-乳酸工業(yè)化生產(chǎn)的主流，我們采用Ca(OH)2為中和劑，在5 t容積的發(fā)酵罐中，試驗(yàn)不同濃度的中和劑對(duì)L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)呛桶l(fā)酵周期的影響，結(jié)果見圖2。
圖2 不同中和劑濃度對(duì)L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)呛桶l(fā)酵周期的影響
由圖2可知，中和劑氫氧化鈣的濃度對(duì)L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)呛桶l(fā)酵周期有較大的影響。當(dāng)中和劑濃度>14%時(shí)，發(fā)酵周期變化不大，發(fā)酵殘?zhí)请S著濃度增大迅速增加，這是由于過高的中和劑濃度，在流加進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)基過程中，會(huì)在發(fā)酵罐局部造成堿性過高，從而抑制了菌體的生長和性能。當(dāng)中和劑濃度<12%時(shí)，發(fā)酵殘?zhí)亲兓淮螅l(fā)酵周期過長，這是由于過低的中和劑濃度，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH值速度過慢，并且使培養(yǎng)基體積增加，L-乳酸和菌體濃度被稀釋，降低了發(fā)酵效率。因此，L-乳酸工業(yè)化生產(chǎn)過程中，必須穩(wěn)控中和劑濃度，以確保發(fā)酵調(diào)控加堿的穩(wěn)定性。中和劑濃度在12%～14%時(shí)，發(fā)酵殘?zhí)窍鄬?duì)較少，發(fā)酵周期短，選擇最佳中和劑氫氧化鈣的濃度范圍為12%～14%。
2.3 pH值分段控制對(duì)發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊?/h3>
L-乳酸發(fā)酵過程中，由于菌種生長需要經(jīng)歷遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，只有控制條件使菌體在各生長階段處于較佳的環(huán)境中，才能最大限度地合成產(chǎn)物，但單一因素滿足菌種生長各階段的最佳值是不一樣的，這就必須對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行分階段控制[3-5]。pH值對(duì)于處于生長期的兼性厭氧菌來說是必須的，若在菌體生長期通過控制pH值進(jìn)行控制菌體生長快慢，從而為菌體生長與代謝提供適當(dāng)?shù)奈h(huán)境，控制菌體生長快慢的同時(shí)，進(jìn)而可控制平穩(wěn)的降糖速率。L-乳酸發(fā)酵前期，菌種增長較快，通過一定程度降低發(fā)酵pH值，可以降低菌種增速，避免菌種進(jìn)入早衰期。發(fā)酵pH值在穩(wěn)定期維持一段時(shí)間之后回升，可保持菌種活性，增加產(chǎn)酸。L-乳酸菌種進(jìn)入衰亡期，適當(dāng)降低pH值，有利于L-乳酸光學(xué)純度的提升和降低殘?zhí)?。試?yàn)L-乳酸發(fā)酵過程中pH值分段控制對(duì)菌體生長的影響，見圖3，pH值一直維持6.0發(fā)酵對(duì)菌體生長的影響見圖4，pH值分段控制與單一pH值發(fā)酵結(jié)果對(duì)比見表1。
圖3 發(fā)酵過程中pH值分段調(diào)控對(duì)菌體平穩(wěn)生長的影響
圖4 pH值6.0發(fā)酵菌體生長情況
表1 分段控制pH值與單一pH值發(fā)酵結(jié)果對(duì)比
由圖3、圖4和表1可知，L-乳酸發(fā)酵過程pH值分段控制，較單一pH值發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)酸、糖酸轉(zhuǎn)化率和L-乳酸光學(xué)純度均提高明顯，發(fā)酵殘?zhí)墙档托Ч@著。這是由于單一pH值發(fā)酵，菌種對(duì)數(shù)期生長較快，營養(yǎng)物質(zhì)過快地被消耗，后期菌種易進(jìn)入早衰，產(chǎn)酸、耗糖等能力下降。同時(shí)說明通過pH值分段控制，穩(wěn)控菌體生長速率及產(chǎn)酸合成速率，是影響L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)堑闹饕蛩?。因此，發(fā)酵過程中實(shí)施pH值分段控制，能對(duì)L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)較好地進(jìn)行穩(wěn)控。
3 結(jié)論
在L-乳酸發(fā)酵過程中，發(fā)酵殘?zhí)鞘前l(fā)酵質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，平穩(wěn)控制乳酸的菌體生長速率及乳酸合成速率，是控制發(fā)酵殘?zhí)堑闹饕蛩亍１驹囼?yàn)研究了接種量、中和劑濃度和pH值對(duì)L-乳酸發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊懀贸鼋臃N量范圍10%～12%，中和劑氫氧化鈣的濃度范圍12%～14%，發(fā)酵過程采用pH值分段控制的方式，發(fā)酵殘?zhí)禽^低，可為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)中穩(wěn)控發(fā)酵殘?zhí)翘峁┫嚓P(guān)參考。
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