諶 迪 肖朝耿 盛玲冬 盧文靜 唐宏剛 葉 沁 吳衛(wèi)成 葛 嘯

(1浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所,浙江 杭州 310021；2浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學院應用工程系,浙江 杭州 310018；3杭州康力食品有限公司,浙江 杭州 311401)

蜂王漿是傳統(tǒng)抗衰老食品[1],由哺育蜂頭部腺體(主要為咽下腺和上頜腺)分泌,呈乳白色或淡黃色的濃稠漿狀物[2]。作為蜂王的主要食物[3],蜂王漿具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤[4]、調(diào)節(jié)血壓血脂[5-7]、激活神經(jīng)保護因子[8]和類胰島素[9]等多種生物活性。研究表明蜂王漿對緩解小鼠的疲勞癥狀有一定作用[10]。近十多年來,蜂王漿的抗氧化活性得到了諸多國內(nèi)外研究人員的驗證,Jamnik 等[11]通過蛋白二維電泳發(fā)現(xiàn),蜂王漿具有降低釀酒酵母細胞氧化應激的作用；Cihan 等[12]發(fā)現(xiàn)蜂王漿能明顯改善小鼠血液和肝臟中的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物過高,超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性異常等不良癥狀；Teixeira 等[13]發(fā)現(xiàn)蜂王漿具有降低皮質(zhì)酮水平,改善冷脅迫下大鼠大腦抗氧化系統(tǒng)的作用。鑒于此,蜂王漿的抗氧化能力與其抗衰老作用有著較大的關(guān)聯(lián),也是評價蜂王漿品質(zhì)的一項重要指標。

蜂王漿主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)作為蜂王漿的主要活性物質(zhì),約占蜂王漿干物質(zhì)的50%[14],由9 個蛋白家族成員組成,分子量主要介于40～100 kDa之間[15]。有研究認為MRJPs家族中的MRJP1 是決定蜜蜂幼蟲級型分化的關(guān)鍵環(huán)境因素[16],也有研究認為MRJPs 家族中的其他成員同樣重要[17]。MRJPs 可有效保護CCl4誘導的急性肝損傷[18]；可調(diào)節(jié)果蠅體內(nèi)過氧化物酶基因的轉(zhuǎn)錄[19]；對人體肺成纖維細胞表現(xiàn)出抗衰老作用[20]。然而MRJPs 的含量及活性在室溫條件下變化較大,這主要歸因于MRJPs 的熱敏性,在常溫下易降解[21]。不同采集時間下,溫度差異導致泌漿蜂所產(chǎn)生的內(nèi)源性蜂王漿品質(zhì)各不相同,且在蜂王漿采集貯運過程中很難做到全程冷鏈保存[22],因此高品質(zhì)的蜂王漿原料對于蜂王漿產(chǎn)品的品質(zhì)至關(guān)重要。目前關(guān)于不同采收時期對蜂王漿品質(zhì)的影響尚鮮見報道。本研究比較了不同采收時期的蜂王漿中MRJPs 特定標記蛋白的含量,通過分析不同采收時期蜂王漿中總水溶性蛋白和多酚的含量,結(jié)合體外抗氧化活性評價,剖析蜂王漿抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ),旨在為蜂王漿的生產(chǎn)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂王漿,杭州康力食品有限公司,本試驗蜂王漿均取自不同月份的意大利蜜蜂的新鮮王漿,即用鑷子將蜂王幼蟲從王臺中夾出,然后取出蜂王漿迅速置于冰浴中保存。

2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH),美國Sigma 公司；2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]總抗氧化活性試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白,國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為分析純,杭州澤衡生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BS124S 型電子天平,德國賽多利斯天平有限公司；5424R 型冷凍離心機,德國艾本德公司；Spectra Max 190 型酶標儀,美國MD 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 MRJPs 含量測定 蜂王漿采集后于-20℃保存。采用SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)蛋白電泳分析蜂王漿中MRJPs 的組成,用蒸餾水將蜂王漿充分溶解,制備成20 mg·mL-1蜂王漿溶液后與loading buffer 等體積混合,100℃熱變性3 min 后上樣,開始電泳。電泳電壓設(shè)置：待樣品成近似一條直線后將電泳電壓從66 V 調(diào)至110 V。利用Image J 軟件中的灰度測定方法測定MRJP1 及MRJP3 的相對含量[23]。

1.3.2 ABTS 總抗氧化活性測定 將不同采收時期的蜂王漿樣品依次稀釋為800、400 和200 mg·mL-1,根據(jù)試劑盒說明書測定ABTS 總抗氧化活性。

1.3.3 DPPH 自由基清除能力測定 參考于麗娜等[24]的方法并作適當修改。將蜂王漿用蒸餾水稀釋至100 mg·mL-1,取190 μL 0.1 mmol·L-1DPPH 乙醇溶液于96 孔板中,然后依次加入10 μL 100 mg·mL-1不同采收期的蜂王漿樣品,混合均勻,30℃保溫20 min后用酶標儀于517 nm 波長處測定其吸光度值；對照組以等體積的蒸餾水代替蜂王漿樣品。按照公式計算DPPH 自由基清除率：

1.3.4 水溶性蛋白質(zhì)含量測定 參考Lowry 等[25]的方法并作適當修改。測定系列濃度牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶液在595 nm 波長處的吸光度值,并制作BSA 標準曲線。然后測定樣品溶液在595 nm 波長處的吸光度值,帶入標準曲線換算出樣品的蛋白濃度。

1.3.5 總酚含量測定 參考Hinneburg 等[26]和田玉肖等[27]的方法并作適當修改。準確吸取1 mL 超聲溶解后的10 mg·mL-1蜂王漿水溶液,加入1 mL Folin-Ciocalteu 顯色劑,混勻后加入5 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液,用蒸餾水定容至10 mL,漩禍混勻,在室溫下避光靜置1 h 后測定760 nm 波長處的吸光度值。標準曲線用系列濃度的原兒茶酸(3,4-dihydroxybenzoic acid,PCA)溶液吸光度值繪制,樣品總酚含量結(jié)果表示為mg PCA·g-1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)通過SPSS 18.0 進行顯著性分析,P＜0.05 表示差異顯著。采用Microsoft Excel 2010 繪制圖表,描述性統(tǒng)計值使用平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收時期蜂王漿中MRJPs 含量

由圖1可知,不同采收時期蜂王漿的MRJPs 以MRJP1 為主,且不同采收時期的MRJPs 含量差異明顯。由圖2可知,4月份采收的蜂王漿中,MRJPs MRJP1 含量顯著高于其他采收時期的樣品(P＜0.05),工蜂在此時期分泌的內(nèi)源性蜂王漿可能受環(huán)境等多種因素的影響,因此該采收時期蜂王漿所含有的MRJP1 較其他收集時期高。9月份采收的的蜂王漿中MRJP1 含量僅次于4月份采收的樣品(P＜0.05),但高于其他采收時期的樣品。7、8月份采收的蜂王漿中MRJP1 含量略低于9月份,但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05),而5月份采收的蜂王漿中MRJP1 含量顯著低于9月份(P＜0.05)。6月份采收的蜂王漿MRJP1 含量最低。

由于具有熱不穩(wěn)定的特性,不同采收時期蜂王漿中MRJP3 含量受溫度影響,也呈現(xiàn)出明顯的差異,但整體上與MRJP1 類似,5、7 和8月份采收的蜂王漿中MRJP3 含量無顯著差異(P＞0.05),但上述3 個月份采收樣品的MRJP3 含量均顯著低于4月份和9月份(P＜0.05)；6月份采收的蜂王漿中MRJP3 含量顯著低于其他月份(P＜0.05)。結(jié)果表明,溫度等環(huán)境因素的差異導致不同采收時期的蜂王漿中MRJPs 含量差異非常明顯,且含量較少的幾種主蛋白在6月份采收的蜂王漿中均未檢出。

圖1 不同采收時期MRJPs 的SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of MRJPs at different collection times

圖2 不同采收時期的蜂王漿中MRJPs 含量Fig.2 Content of MRJPs in royal jelly at different collection times

2.2 蜂王漿DPPH 自由基清除能力

由圖3可知,4月份采收的蜂王漿DPPH 自由基清除能力與7、8、9月份采收的樣品無顯著差異；5月份與6月份采收的蜂王漿DPPH 自由基清除能力無顯著差異,但二者均顯著低于其他采收時期(P＜0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果表明,除8月份外,其他采收時期的蜂王漿DPPH 自由基清除能力和MRJP1 和MRJP3 含量的相關(guān)系數(shù)達0.828 和0.847。表明,蜂王漿DPPH自由基清除能力與其MRJPs 含量存在較明顯的正相關(guān)性。

圖3 不同采收時期的蜂王漿DPPH 清除能力Fig.3 DPPH scavenging ability of royal jelly at different collection times

2.3 蜂王漿總抗氧化活性

由圖4可知,5月份和9月份采收的蜂王漿總抗氧化能力最強,顯著高于其他采收時期的樣品(P＜0.05),其次為7月份和8月份采收時期的的蜂王漿。與DPPH 自由基清除能力結(jié)果類似,6月份采收的蜂王漿總抗氧化能力顯著低于其他采收時期的樣品(P＜0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果表明,5-9月份采收的蜂王漿的總抗氧化能力與MRJP1 與MRJP3 含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.680 和0.743。表明MRJPs 與蜂王漿總抗氧化活性存在一定的相關(guān)性。

圖4 不同采收時期的蜂王漿總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capacity of royal jelly at different collection times

2.4 蜂王漿水溶性蛋白及總酚含量

由圖5可知,不同采收時期蜂王漿中總水溶性蛋白含量無顯著差異(P＞0.05),但MRJPs 含量在不同采收時期的樣品中存在顯著差異,這可能是由于MRJPs 在蜂農(nóng)采收儲運過程中部分發(fā)生降解,產(chǎn)生其他多肽類成分所致。

由圖6可知,6月份采收的蜂王漿總酚含量最高,且顯著高于其他采收時期的樣品(P＜0.05),其次為4月份采收的蜂王漿；5月份和8月份采收的蜂王漿總酚含量無顯著性差異(P＞0.05)；7月份和9月份采收的蜂王漿采收的蜂王漿總酚含量最低,且無顯著差異(P＞0.05),9月份采收的蜂王漿總酚含量較低,可能與工蜂在該時期分泌的內(nèi)源性蜂王漿有關(guān),而7月份采收的蜂王漿總酚含量較低可能與該月溫度較高有一定關(guān)系。

圖5 不同采收時期的蜂王漿水溶性蛋白含量Fig.5 Content of water soluble protein in royal jelly at different collection time

圖6 不同采收時期的蜂王漿總酚含量Fig.6 Total phenol content of royal jelly at different collection time

3 討論

MRJPs 是蜂王漿的主要活性物質(zhì)。研究表明,MRJPs 的熱不穩(wěn)定性,使其較蜂王漿酸等其他成分更適合作為蜂王漿新鮮度的標記物,而蜂王漿中超氧化物歧化酶的抗氧化性是評價其新鮮度的重要參數(shù)[28]。本研究通過分析不同采收時期蜂王漿DPPH 自由基清除能力和總抗氧化能力發(fā)現(xiàn),6月份采收的蜂王漿活性均低于其他采收時期樣品,進一步分析其組成發(fā)現(xiàn),該月份采收的蜂王漿不僅MRJP1 和MRJP3 含量低于其他采收時期,且從電泳圖可知其他MRJPs 家族成員也明顯低于其他采收時期,究其原因,一方面可能是由于6月份環(huán)境溫度高,導致MRJPs 部分降解；另一方面取漿的時間、泌漿蜂的日齡以及環(huán)境因素也會影響工蜂所分泌內(nèi)源蜂王漿的抗氧化生物活性,特別是環(huán)境溫度對蜂王漿中超氧化物歧化酶的影響較大[29]。本研究對不同采收時期蜂王漿的MRJPs 含量與總抗氧化活性進行了相關(guān)性分析,結(jié)果表明,蜂王漿總抗氧化活性與其MRJPs 存在正相關(guān)性,這與高慧等[30]報道的MRJPs 含量與DPPH 自由基清除活性具有正相關(guān)性的結(jié)論一致。

Nagai 等[31]用胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶處理蜂王漿后發(fā)現(xiàn),MRJPs 經(jīng)酶解后清除超氧陰離子自由基和羥自由基的能力顯著提高。本研究發(fā)現(xiàn)不同采收時期的蜂王漿總水溶性蛋白含量無顯著性差異,但是不同采時期的MRJPs 含量存在差異,這可能是由于MRJPs 經(jīng)內(nèi)源或外源酶作用后產(chǎn)生了多肽等其他形式的水溶性蛋白,因此導致不同采收時期蜂王漿中總水溶性蛋白含量并無顯著差異。Guo 等[32]發(fā)現(xiàn)MRJPs 酶解所產(chǎn)生的多肽類成分具有較強的抗氧化活性,蜂王漿在天然狀態(tài)下,部分具有抗氧化活性的MRJPs 被分解,產(chǎn)生抗氧化活性更強的多肽類成分,這種變化也一定程度上解釋了5月份和8月份樣品中MRJPs 含量雖然較低但總抗氧化能力反而較強的現(xiàn)象。多酚是典型的抗氧化成分,但不同的多酚成分其抗氧化活性不相同,通過分析不同采收時期蜂王漿總多酚含量發(fā)現(xiàn),雖然6月份采收的蜂王漿DPPH 自由基清除能力和總抗氧化能力低于其他采收時期的樣品,但其總多酚含量高于其他采收時期的樣品,推測6月份采收的蜂王漿多酚的抗氧化活性較其他采收時期弱,因此,后續(xù)研究可針對6月份采收的蜂王漿中多酚的活性及結(jié)構(gòu)表征,闡明多酚結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律,明確其抗氧化活性降低的分子機理。綜上所述,影響蜂王漿抗氧化活性的因素非常復雜,包括MRJPs 及其酶解產(chǎn)生的抗氧化活性肽、多酚含量及種類,還包括影響上述成分的取漿時間及季節(jié)等環(huán)境因素。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,不同采收時期的蜂王漿樣品中,蜂王漿主蛋白(MRJPs)含量差異顯著,特別是MRJP1和MRJP3 等含量較豐富的蛋白,由于普通蛋白電泳靈敏度不夠,少數(shù)豐度較低的蛋白未能檢出,后續(xù)可采用蛋白組學的方法進行痕量MRJPs 的比較分析。蜂王漿的抗氧化活性與MRJPs 存在一定的正相關(guān)性。但不同采收時期的蜂王漿中,MRJPs 含量的降低并不一定導致其抗氧化活性也降低,因為MRJPs 降解后可能產(chǎn)生抗氧化活性更強的多肽,此外多酚結(jié)構(gòu)的變化也會導致抗氧化活性的改變。綜上,蜂王漿的抗氧化活性由MRJPs、抗氧化肽及多酚等多種抗氧化物質(zhì)共同體現(xiàn),但MRJPs 如何轉(zhuǎn)化成抗氧化肽,以及MRJPs 轉(zhuǎn)化成抗氧化肽后,對蜂王漿其他生物活性有何影響,還有待深入的研究。