王芳 趙玉紅 張海云 何萍 吳紅霞 吳鳴蕾 胡濟安

糖尿病是與遺傳和自身免疫相關(guān)的全身性慢性代謝性疾病，炎癥在2型糖尿病發(fā)病機制中的作用備受關(guān)注。牙周炎使牙周組織處于炎癥環(huán)境，炎癥引起胰島細胞結(jié)構(gòu)和功能障礙，可導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生[1]。2型糖尿病與牙周炎相互作用又相互促進[2]。自噬是細胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生、發(fā)展、老化、死亡過程中存在的一個自我消化和再循環(huán)系統(tǒng)[3]。細胞通過自噬降解蛋白質(zhì)和受損的細胞器。自噬在基礎(chǔ)狀態(tài)和應(yīng)激情況下對胰島細胞數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)揮了重要的作用，在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。自噬相關(guān)蛋白ATG5/ATG1可以與干擾素（IFN）中的IFN-β結(jié)合而阻斷IFN的信號通路[4]。自噬發(fā)生過程中有兩個類泛素化修飾過程，分別發(fā)生在ATG5-ATG12系統(tǒng)和微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated proteins light chain 3，LC3）系統(tǒng)中，對于自噬泡的延伸與自噬體的成熟有重要意義。自噬關(guān)鍵調(diào)控蛋白復(fù)合物Beclin1是ATG6的同系，通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成和降解以及細胞器的更新來維持細胞穩(wěn)態(tài)，Beclin1與多種急、慢性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[5]。自噬受體蛋白（Sequestosome-1，P62）為髓細胞病毒基因C的表達產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因參與細胞周期的調(diào)控、增殖、凋亡及永生化等過程，在諸多自噬和炎癥的發(fā)生中起著重要作用[6]。LC3是自噬的生物標(biāo)志物[7]，自噬形成時，其與磷脂酰乙醇胺共價結(jié)合，結(jié)合在自噬體膜上的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可評估自噬水平的高低。基于此，本研究通過組織學(xué)和細胞學(xué)研究檢測并比較 ATG1、ATG12、LC3、P62、Beclin1 在正常牙齦黏膜組織、口腔慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中的表達差異，探討自噬對2型糖尿病牙周組織的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 組織標(biāo)本選取自2015年1月至2019年6月在杭州市余杭區(qū)第五人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)檢查確認的5例口腔慢性牙周炎患者（其中男3例，女2例；年齡46～65歲）和5例2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期患者（其中男2例，女3例；年齡48～63歲）的翻瓣黏膜組織。另擇在杭州市余杭區(qū)第五人民醫(yī)院種植牙的5例患者（其中男3例，女2例；年齡47～59歲）的正常牙齦黏膜組織（種植牙修建的邊緣牙齦黏膜組織）作為對照。本研究經(jīng)杭州市余杭區(qū)第五人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑 ATG1、ATG12、P62鼠源單克?。绹?Invitrogen公司），LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ，Beclin1兔源多克隆抗體（美國Sigma公司），波形蛋白Vimentin（北京中杉金橋公司）；廣譜細胞角蛋白Ck（pan）（北京中杉金橋公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibico公司）；胰蛋白酶（美國Gibico公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH（美國Thermo公司），免疫組化SP試劑盒（北京中杉金橋公司）；兔抗鼠FITC-IgG、羊抗兔FITC-IgG等（北京中山生物技術(shù)有限公司）。DAB顯色劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），MTT試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 主要儀器 倒置相差顯微鏡ckx41（日本Olympus公司）；CO2培養(yǎng)箱水套式 s-a305714-7787（美國Thermo公司）；紫外分光光度計UV1206（日本Shimodzu公司）；凝膠掃描系統(tǒng)DF23B（英國UVP公司）；電泳系統(tǒng)Mini Protean（美國Bio-Rad公司）；低溫離心機5424R（美國Eppendorf公司）；倒置熒光顯微鏡Eclipse80i（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 組織塊培養(yǎng)與細胞原代培養(yǎng) 無菌條件下刮取正常牙齦黏膜、口腔慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期翻瓣黏膜組織行體外培養(yǎng)，參照文獻[8]進行組織塊法原代培養(yǎng)。蓋玻片+組織塊培養(yǎng)原代細胞，并作常規(guī)傳代培養(yǎng)，取2代細胞經(jīng)免疫細胞化學(xué)檢測呈Vimentin陽性、Ck（pan）陰性，則證實細胞來源于中胚層。牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞經(jīng)腫瘤壞死因子α（TNF-α）陽性證實炎癥存在，進行后續(xù)實驗。

1.2.2 正常牙齦黏膜組織、慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 表達情況檢測 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法。將 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 一抗分別加入3種組織切片，再加入用生物素標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，使用SP放大系統(tǒng)產(chǎn)生低背景、高放大效果來測定組織細胞中的抗原?？乖迯?fù)采用高溫高壓法，抗原修復(fù)用EDTA抗原修復(fù)液，一抗反應(yīng)為37℃、2h，免疫組化以抗 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 抗體染色細胞的細胞核或細胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀著色為陽性表達。

1.2.3 正常牙齦、慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-II、LC3-I表達情況檢測分別將1×106個/ml對數(shù)生長期的正常牙齦、慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞懸液接種于底部鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24h，加入ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ一抗，以加入PBS作為陰性對照；24h后，取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定后，按免疫細胞化學(xué)試劑盒說明書進行操作檢測表達情況。

1.2.4 正常牙齦、慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞 ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達水平檢測 采用Western blot法。將正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞接種于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每1～2d換液1次。取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)4℃胞漿蛋白提取液裂解，提取物在冰上孵育2h，然后12 000g、4℃離心10min；沉淀后加入4℃預(yù)冷核蛋白提取液，震蕩混勻，冰浴1h，再12 000g 4℃離心30min；取上清液為核蛋白，其蛋白濃度經(jīng)考馬斯亮藍法定量，GAPDH為內(nèi)參。核蛋白中加入等體積上樣緩沖液煮沸5min，進行凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后用5g/L牛血清白蛋白室溫下封閉 2 h，分別用 ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ抗體4℃孵育過夜，用PBS充分洗滌，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠（1∶5 000）或羊抗兔IgG（1∶5 000）。結(jié)果使用Motic圖像分析系統(tǒng)測量平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常牙齦黏膜組織、慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織 ATG1、ATG12、Beclin1、P62 表達情況 正常牙齦黏膜組織、慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中 ATG1、ATG12、Beclin1、P62免疫組化染色結(jié)果顯示ATG1、ATG12表達相似，在正常牙齦黏膜組織中呈強陽性表達，在慢性牙周炎組織中呈弱陽性表達，在2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中呈陽性表達。Beclin1在正常牙齦黏膜組織中呈強陽性表達，在慢性牙周炎組織中呈弱陽性表達，在2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中呈陽性表達。P62在正常牙齦黏膜組織中呈弱陽性表達，在慢性牙周炎組織中呈弱陽性表達，在2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中呈陽性表達，見圖 1-12（插頁）。

2.2 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞 ATG1、ATG12、P62、Beclin1表達情況 ATG1、ATG12在正常牙齦成纖維細胞中強陽性表達，在慢性牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達，在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達。P62在正常牙齦成纖維細胞弱陽性表達，在慢性牙周炎成纖維細胞中表達增高，在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中表達更高。Beclin1在正常牙齦成纖維細胞中強陽性表達，在慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達，見圖13（插頁）。

圖1 ATG1在正常牙齦黏膜中強陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖2 ATG1在慢性牙周炎組織中弱陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖3 ATG1在2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖4 ATG12在正常牙齦黏膜中強陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖5 ATG12在慢性牙周炎組織中弱陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖6 ATG12在2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖7 Beclin1在正常牙齦黏膜組織中強陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖8 Beclin1在慢性牙周炎組織中弱陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖9 Beclin1在2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖10 P62在正常牙齦黏膜中弱表達（免疫組化染色，×200）

圖11 P62在慢性牙周炎組織中陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖12 P62在2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖13 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達情況（注：a：ATG1在正常牙齦成纖維細胞中強陽性表達；b：ATG1在慢性牙周炎成纖維細胞中弱表達；c：ATG1在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱表達；d：ATG12在正常牙齦成纖維細胞中強陽性表達；e：ATG12在慢性牙周炎成纖維細胞中弱表達；f：ATG12在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱表達；g：P62在正常牙齦成纖維細胞弱陽性表達；h：P62在慢性牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達；i：P62在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達；j：Beclin1在正常牙齦成纖維細胞中強陽性表達；k：Beclin1在慢性牙周炎成纖維細胞中弱陽性表達；l：Beclin1在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中弱表達；免疫熒光染色，×200）

2.3 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達水平比較 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。2型糖尿病牙周炎成纖維細胞LC3-Ⅱ表達水平＞慢性牙周炎成纖維細胞＞正常牙齦成纖維細胞（均P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值＜慢性牙周炎成纖維細胞＜正常牙齦成纖維細胞牙周炎成纖維細胞（均P＜0.05），見圖14、表1。

圖14 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達電泳圖

表1 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達水平比較

2.4 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表達水平比較 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表達水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）。ATG1、ATG12、P62在 2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中表達水平最低（均P＜0.05），Beclin1在2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中表達水平最低高（均P＜0.05），見圖 15、表 2。

圖15 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表達電泳圖

表2 正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞ATG1、ATG12、Beclin1、P62表達水平比較

3 討論

2016年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎授予發(fā)現(xiàn)了細胞自噬機制的Yoshinori Ohsumi，自噬是細胞降解和回收其成分物的過程[9]。自噬過程往往與機體多種代謝性疾病的發(fā)生直接相關(guān)，如2型糖尿病和糖尿病合并癥等。研究者認為，自噬是細胞進行質(zhì)量控制的一種特殊方式，如果無法進行有效的自噬過程，細胞就無法自我更新，從另一方面來講，如果自噬過多，也會破壞細胞自身組分的平衡，進而誘發(fā)細胞死亡，因此適度調(diào)節(jié)的自噬過程對于維持機體健康至關(guān)重要[10]。盡管自噬作用的錯誤調(diào)節(jié)可能與多種疾病有關(guān)，其中包括它在胰腺β細胞和葡萄糖代謝過程中的作用并未有一致性的結(jié)論[11]。有學(xué)者利用特異性去除Atg7基因胰腺β細胞的小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)Atg7變異的小鼠表現(xiàn)出葡萄糖耐量減低以及血清胰島素濃度的降低。由于細胞凋亡的增加以及β細胞分裂增生程度的降低，導(dǎo)致β細胞數(shù)量和胰腺中胰島素的減少[12]。

慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中，常規(guī)顯微鏡下可以觀察到炎癥的浸潤方式和血管擴張的形態(tài)稍有不同，單純細菌引起的慢性牙周炎，炎癥細胞聚集于結(jié)合上皮和溝內(nèi)上皮下方，下方固有層內(nèi)血管擴張，而2型糖尿病伴發(fā)的牙周炎中炎癥細胞沿著固有層擴張的血管內(nèi)壁和上皮釘突的下方。有研究證實自噬在牙周膜細胞的分化中起作用[13]。本研究首先通過免疫組化檢測正常牙齦黏膜組織、慢性牙周炎組織和2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中 ATG1、ATG12、Beclin1、P62的表達，染色結(jié)果顯示ATG1、ATG12、Beclin1表達模式相似，在正常牙齦黏膜組織中呈強陽性表達，在慢性牙周炎組織中呈弱陽性表達，在2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期組織中的表達接近慢性牙周炎組織，陽性表達介于正常牙齦黏膜組織和慢性牙周炎組織之間。P62的表達和ATG1、ATG12、Beclin1表達相反。接著本研究選取組織的原代細胞，對照組織學(xué)進行了細胞學(xué)研究。結(jié)果表明ATG1、ATG12、Beclin1、P62在正常牙齦成纖維細胞、慢性牙周炎成纖維細胞和2型糖尿病牙周炎成纖維細胞中的表達方式與其在組織中的表達相似，提示口腔慢性牙周炎穩(wěn)定期和2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期患者牙齦黏膜細胞自噬減弱。

LC3是檢測自噬水平的標(biāo)志性蛋白，有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，當(dāng)細胞內(nèi)自噬水平升高時，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化增加，進而使LC3-Ⅱ的含量增多[14]。因此通過檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值的變化可反映自噬體數(shù)目或自噬水平的變化。生理學(xué)分析顯示，在小鼠中存在血糖激發(fā)的胰島素分泌的降低，并且自噬作用缺陷的β細胞中血糖誘導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣離子瞬變過程也被破壞。而形態(tài)學(xué)分析則表明存在泛素蛋白的聚集，這種現(xiàn)象與P62共存，并伴隨著線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹以及β細胞液泡的變化。以上研究結(jié)果表明自噬作用對于維持胰腺β細胞的結(jié)構(gòu)、數(shù)量以及功能都是非常重要的，自噬作用的破壞將導(dǎo)致胰島素的缺乏以及高糖血癥的發(fā)生[15]。

本研究應(yīng)用Western blot定量分析各組細胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值變化，同時檢測自噬相關(guān)蛋白ATG1、ATG12、Beclin1、P62蛋白表達，提示2型糖尿病牙周炎成纖維細胞比正常牙齦的成纖維細胞自噬降低，與非糖尿病牙周炎相比也有所下降，表明自噬參與牙周炎過程，并且與2型糖尿病自噬可能有協(xié)同作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了糖尿病小鼠以及高脂飲食小鼠的胰腺β細胞中存在自噬作用的升調(diào)節(jié)，能導(dǎo)致糖尿病相關(guān)的外周胰島素抵抗的游離脂肪酸誘導(dǎo)胰腺β細胞自噬作用發(fā)生。對于atg7基因的消除將導(dǎo)致胰島退化、胰島素分泌以及葡萄糖耐量降低。與此同時研究人員還觀察到，盡管在對照組小鼠中高脂肪含量的飲食能激發(fā)胰腺β細胞自噬，但是對于自噬不足變異小鼠而言，這將形成葡萄糖耐量的惡化，以上現(xiàn)象發(fā)生的部分原因在于缺乏胰腺β細胞數(shù)量的補償性增加[16]。另有研究表明，當(dāng)存在高脂肪飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗時，自噬作用是一種胰腺β細胞的獨特適應(yīng)性反應(yīng)。因此，基礎(chǔ)自噬作用對于維持正常的胰島結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要[17]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)自噬與2型糖尿病牙周炎的發(fā)生存在復(fù)雜關(guān)系，在口腔慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎穩(wěn)定期自噬呈現(xiàn)下降。細胞自噬在2型糖尿病這一代謝性疾病中扮演了重要角色。如能找到引發(fā)2型糖尿病牙周炎異常自噬過程的靶點，以此來研發(fā)新型治療方法，或能助于疾病的早期診斷并預(yù)防多種代謝性疾病的發(fā)生。