GFP標(biāo)記的4種鏈格孢菌對(duì)棗樹(shù)的侵染研究

田紅雨，史曉夢(mèng)，張 敏，王亞聰，張書(shū)蔚，冉隆賢

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)院；b.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

棗Ziziphus jujubaMill.屬于鼠李科棗屬植物，在我國(guó)最早栽培于7 000年前的黃河中下游地區(qū)，是我國(guó)最古老的果樹(shù)之一[1-2]。棗樹(shù)具有抗逆性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益均顯著等特點(diǎn)，在我國(guó)的栽培十分廣泛，我國(guó)的棗樹(shù)栽培面積和棗果產(chǎn)量均占世界的98%以上[3-6]。棗果是一種藥食同源的果品，棗果含有多種氨基酸、維生素及豐富的礦質(zhì)元素，又有養(yǎng)血安神、補(bǔ)中益氣、強(qiáng)身健脾等功效，具有很高的營(yíng)養(yǎng)與藥用保健價(jià)值[4-5,7-8]。

棗縮果病是棗樹(shù)生產(chǎn)中危害極為嚴(yán)重的病害之一，普遍發(fā)生于我國(guó)各主要產(chǎn)棗區(qū)，棗果受害后變色干縮，果肉呈海綿狀壞死，提前脫落，常導(dǎo)致大面積減產(chǎn)甚至絕收[9]。目前生產(chǎn)上對(duì)此病害的防治效果一直不夠理想，因?yàn)閷?duì)其病原菌的侵入時(shí)間和侵入途徑等尚不明確。有關(guān)研究結(jié)果表明，棗縮果病菌在棗樹(shù)中具有長(zhǎng)期潛伏侵染的特性[10]，不同地區(qū)的發(fā)病時(shí)期又存在差異性，侵染時(shí)間最早可發(fā)生于5月下旬，7—8月為發(fā)病初期，8月中下旬至9月上旬為發(fā)病高峰期[11-13]，病原菌主要從水孔、氣孔及果洼通過(guò)風(fēng)雨傳播侵入棗果，也可從花、葉片侵入棗樹(shù)體內(nèi)[11,14]。有關(guān)研究者曾報(bào)道，棗縮果病的病原菌種類(lèi)繁多，目前學(xué)術(shù)界對(duì)此仍存在很大的爭(zhēng)議。吳婷等[15]認(rèn)為，真菌和細(xì)菌共同導(dǎo)致了棗縮果病的發(fā)生。韓黨悅[16]和許陽(yáng)[17]都認(rèn)為，棗縮果病的初侵染病原是互隔鏈格孢菌Alternaria alternata。這一研究結(jié)果解決了長(zhǎng)期以來(lái)由于病原不清而導(dǎo)致的防治困難等問(wèn)題，有助于扭轉(zhuǎn)40 多年來(lái)?xiàng)椏s果病病原混雜不清的局面，為生產(chǎn)中棗縮果病的有效防治提供了技術(shù)支撐。何麗等[18]對(duì)新疆病果的病原菌進(jìn)行常規(guī)分離后，選取了有代表性的菌株進(jìn)行了致病性的檢測(cè)和鑒定，也明確了鏈格孢菌是棗縮果病的病原菌。

鏈格孢屬Alternaria真菌廣泛分布于世界各地，該屬真菌種類(lèi)繁多，寄主范圍廣，適應(yīng)性強(qiáng)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的大約有500 種，可引起包括玉米、小麥、馬鈴薯、番茄和蘋(píng)果、梨等幾十種栽培植物的病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失[19-20]。相關(guān)研究結(jié)果表明，蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病、梨黑斑病、馬鈴薯早疫病和番茄黑斑病的病原菌都是鏈格孢屬真菌[21-27]，蘋(píng)果、梨等果樹(shù)和馬鈴薯、番茄等農(nóng)作物經(jīng)常栽培于棗園附近，但侵染這些植物的鏈格孢菌是否還可侵染棗樹(shù)，引起棗樹(shù)果實(shí)病害的發(fā)生，對(duì)此問(wèn)題的研究尚未見(jiàn)諸報(bào)道。為此，本研究以蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌A.mali、梨黑斑病菌A.kikuchiana、馬鈴薯早疫病菌A.solani和番茄黑斑病菌A.alternata為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）標(biāo)記，并對(duì)成功標(biāo)記的菌株在棗果上進(jìn)行致病性檢測(cè)，以進(jìn)一步探明棗縮果病初侵染鏈格孢菌的來(lái)源，并通過(guò)在棗樹(shù)花期噴霧接種GFP標(biāo)記的4種鏈格孢菌，進(jìn)一步探究其在棗樹(shù)上的侵染途徑，從而為更有效地防治棗縮果病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌株：蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌和馬鈴薯早疫病菌（分別編號(hào)為ZN01、ZN02 與ZN03）均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院曹克強(qiáng)教授和朱杰華教授提供；GFP 標(biāo)記的互隔鏈格孢菌（編號(hào)為CN193）和番茄黑斑病菌（編號(hào)為ZNXR）、根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens gfp基因表達(dá)載體質(zhì)粒，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病理研究室提供。

試劑和培養(yǎng)基：潮霉素B、卡那霉素、利福平、氨芐青霉素、鏈霉素的濃度分別為10、50、20、100、100 mg·mL-1，乙酰丁香酮（AS） 0.2 mg·mL-1；以IM 為培養(yǎng)基[28]，以LB 為液體培養(yǎng)基[29]。

供試植物：棗樹(shù)，栽培于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃。

1.2 方 法

1.2.1 4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 的敏感性的測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定供試的4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 的敏感性。分別將ZN01、ZN02、ZN03 和ZN-XR 這4 種鏈格孢菌置于PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，然后用直徑為 7 mm 的打孔器在所培養(yǎng)菌株的菌落邊緣打取菌碟，分別置于含有濃度依次為5、10、20、50 和100 μg·mL-1的潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上，以不加潮霉素B 培養(yǎng)的菌落作為對(duì)照，每個(gè)處理各設(shè)3 次重復(fù)。當(dāng)對(duì)照菌落的直徑至少長(zhǎng)到30 mm 時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算不同濃度潮霉素B 處理下4 種鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率[30]。將抑菌率（%）轉(zhuǎn)化為幾率值（y），將藥劑濃度轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)（x），求出毒力回歸方程y=a+bx，根據(jù)此方程計(jì)算有效抑制濃度EC50值（μg·mL-1）及相關(guān)系數(shù)（r），并根據(jù)EC50值分析4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 的敏感性。

菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(處理菌落直徑)]×100%。

1.2.2 4 種鏈格孢菌的GFP 標(biāo)記

取農(nóng)桿菌10 μg 加入到20 mL 的LB 液體培養(yǎng)基（含 有20 μg·mL-1的利福平、50 μg·mL-1的卡那霉素和100 μg·mL-1的鏈霉素）中，在28 ℃、220 r·min-1的搖床中培養(yǎng)24 h 后取出，吸取1 mL轉(zhuǎn)移至1.5 mL 的離心管內(nèi)，以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心2 min，棄上清液，加入1 mL 的IM，吹打使其沉淀懸浮，再次以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心 2 min，棄上清液后加入1 mL 的IM，再次吹打使其沉淀懸浮，然后轉(zhuǎn)移至9 mL 的IM 中，分別加入10 μL 的卡那霉素、鏈霉素、AS，置于搖床上，于28 ℃的溫度條件下以80 r·min-1的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)4 h后取出，加入無(wú)菌生理鹽水將光密度值（OD600）調(diào)節(jié)至0.2 ～0.3。將4 種鏈格孢菌的分生孢子懸浮液（1×106個(gè)·mL-1）置于4 ℃冰箱內(nèi)低溫處理 6 h，以提高轉(zhuǎn)化率，然后分別加入等體積的上述農(nóng)桿菌菌液混合，各取200 μL 均勻涂抹于劃線的無(wú)菌濾紙條上，再置于IM 固體培養(yǎng)基上，于 25 ℃的黑暗中培養(yǎng)36 h 后將濾紙條取出并翻轉(zhuǎn)置于含有5 μg·mL-1的潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 GFP 標(biāo)記菌株的穩(wěn)定性檢測(cè)

為了測(cè)定轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性，每種菌各隨機(jī)挑選8 個(gè)轉(zhuǎn)化子，將其接種到不加潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基中，于25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)7 d 后，挑取新長(zhǎng)出的菌絲將其轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。按上述方法繼代培養(yǎng)5 代，挑取4 種菌的初代和第5 代轉(zhuǎn)化子的菌絲，將其置于熒光顯微鏡下觀察并照相。為了測(cè)定其生長(zhǎng)的穩(wěn)定性，將 4 種菌的第5 代轉(zhuǎn)化子和野生型菌株分別置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上在25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況并測(cè)量其直徑。

1.2.4 GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌侵染棗果的測(cè)定

將GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌、棗縮果病互隔鏈格孢菌（編號(hào)為CN193::gfp）和空白的PDA培養(yǎng)基分別制備成4 mm×4 mm 的菌碟，采用刺傷接種的方法分別將其接種在健康的棗果上，每組各設(shè)8 個(gè)點(diǎn)，每個(gè)處理各設(shè)6 組，分別以接種CN193::gfp和空白PDA 作為對(duì)照。將接種后的棗果用保鮮膜包裹好，3 d 后取下保鮮膜，7 d 后觀察其發(fā)病情況并計(jì)算發(fā)病率，然后將發(fā)病棗果帶回實(shí)驗(yàn)室，用70%的酒精消毒30 s，用無(wú)菌水沖洗3～ 4 次后取其病健交界處的組織，將其置于含有 10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)，待其有菌絲長(zhǎng)出后挑取各處理的菌絲，放在熒光顯微鏡下觀察其是否有熒光。

1.2.5 GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌侵染棗花的測(cè)定

在棗樹(shù)花期于試驗(yàn)地選擇未發(fā)生棗縮果病的棗樹(shù)，將GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌和CN193::gfp分別置于PDA 培養(yǎng)基上于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d 后，用無(wú)菌水分別配制成濃度為105個(gè)·mL-1的分生孢子懸浮液以備用。以接種經(jīng)GFP 標(biāo)記的 4 種鏈格孢菌為試驗(yàn)組，以接種CN193::gfp為對(duì)照組，每組各選取3 株棗樹(shù)，每株棗樹(shù)各選2 個(gè)枝條，在無(wú)風(fēng)雨的天氣且日照較弱的下午對(duì)棗花噴霧接種分生孢子懸浮液，每隔5 d 噴1 次，共噴3 次。待棗果長(zhǎng)出并發(fā)病后采回，用70%的酒精消毒30 s， 用無(wú)菌水沖洗3 ～4 次后取病健交界處的組織，將其置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃的黑暗條件下培養(yǎng)，待其有菌落長(zhǎng)出后挑取菌絲，在熒光顯微鏡下觀察其是否有熒光。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0 軟件用單因素方差分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，并用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 的敏感性

潮霉素B 的毒力回歸方程和有效中濃度EC50值見(jiàn)表1。蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌對(duì)潮霉素B 的敏感程度有差別，但潮霉素B 的處理濃度與抑制效果間呈正相關(guān)，各處理的相關(guān)系數(shù)均在0.91 以上，說(shuō)明這4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 均敏感，因此可使用以潮霉素B 標(biāo)記的gfp基因?qū)@4 種鏈格孢菌進(jìn)行標(biāo)記。

2.2 GFP 標(biāo)記菌株的穩(wěn)定性

分別挑取4 種鏈格孢菌的初代和第5 代轉(zhuǎn)化子的菌絲置于熒光顯微鏡400 倍下觀察，均可觀察到明顯的熒光，觀察結(jié)果如圖1 ～4 所示。從圖1 ～4中可以看出，第5 代與初代轉(zhuǎn)化子的熒光強(qiáng)度均無(wú)差異。培養(yǎng)5 d 后發(fā)現(xiàn)，4 種鏈格孢菌的第5 代轉(zhuǎn)化子在含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上均可正常生長(zhǎng)，且其菌落直徑的大小與野生型菌株間均無(wú)差異。以上結(jié)果表明，經(jīng)GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌其遺傳轉(zhuǎn)化后的特征明顯且穩(wěn)定。

表1 潮霉素B 的毒力回歸方程和有效中濃度Table 1 Virulence regression equations and median effective concentrations of hygromycin B

圖1 ZN01::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.1 Fluorescence comparison of hyphae from ZN01::gfp in primary culture and the fifth subculture

圖2 ZN02::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.2 Fluorescence comparison of hyphae from ZN02::gfp in primary culture and the fifth subculture

圖3 ZN03::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.3 Fluorescence comparison of hyphae from ZN03::gfp in primary culture and the fifth subculture

圖4 ZN-XR::gfp 繼代培養(yǎng)5 代后與初代培養(yǎng)的菌絲熒光比較Fig.4 Fluorescence comparison of hyphae from ZN-XR::gfp in primary culture and the fifth subculture

2.3 GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌對(duì)棗果的侵染

分別以GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌、棗縮果病互隔鏈格孢菌（CN193::gfp）和空白的PDA 培養(yǎng)基對(duì)棗果進(jìn)行刺傷接種后發(fā)現(xiàn)，接種CN193::gfp和4 種鏈格孢菌的棗果其后期均發(fā)病，接種CN193::gfp和ZN01、ZN02、ZN03、ZN-XR 的棗果其發(fā)病率分別為93.8%與75.0%、87.5%、81.3%、83.3%，且各處理間無(wú)顯著差異（P＞0.05），而空白對(duì)照的未發(fā)?。▓D5）。接種4 種鏈格孢菌的棗果均發(fā)病且均有病斑出現(xiàn)，其病斑均呈褐色凹陷狀，果肉呈土黃色、海綿狀壞死，提前脫落 （圖6 A—D），此癥狀與接種CN193::gfp的棗果的發(fā)病癥狀（圖6 E）相同。

圖5 以不同鏈格孢菌刺傷接種后棗果的發(fā)病率Fig.5 Disease incidences of jujube fruits inoculated with different Alternaria species through stabbing

圖6 以不同鏈格孢菌刺傷接種后棗果的發(fā)病癥狀Fig.6 Symptoms of diseased jujube fruits inoculated with different Alternaria species through stabbing

對(duì)刺傷接種CN193::gfp和4 種菌株后的發(fā)病棗果進(jìn)行病組織分離，所有病組織在含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上均有菌落長(zhǎng)出。分別挑取菌絲放在熒光顯微鏡（400 倍）下觀察，均可觀察到熒光，觀察結(jié)果如圖7 所示。這一觀察結(jié)果進(jìn)一步表明，以蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌刺傷接種均可使棗果發(fā)病，供試菌株對(duì)棗樹(shù)均有致病性。

2.4 GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌對(duì)棗花的侵染

將采回的花期噴霧處理枝條上的發(fā)病棗果置于含有10 μg·mL-1潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)后，以4 種鏈格孢菌和CN193::gfp接種處理的病果上均有菌落長(zhǎng)出，分別挑取各處理的菌絲放在熒光顯微鏡（400 倍）下觀察，均可觀察到熒光，觀察結(jié)果如圖8 所示。圖8 表明，蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌均能通過(guò)棗花侵入棗樹(shù)。

圖7 以不同鏈格孢菌刺傷接種后從棗果病組織中分離出的菌絲Fig.7 Hyphae isolated from diseased tissues in jujube fruit inoculated with different Alternaria species through stabbing

圖8 從花期噴霧接種后的發(fā)病棗果中分離出的菌絲Fig.8 Hyphae isolated from diseased jujube fruits inoculated through spraying at florescence

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的綠色熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)在許多重要的病原真菌侵染寄主過(guò)程中都得到了成功的應(yīng)用[31-37]。本研究采用張敏對(duì)棗縮果病菌（CN193）的GFP 標(biāo)記方法[38]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌對(duì)潮霉素B 均敏感，因此，應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，成功地將潮霉素B 標(biāo)記的gfp基因轉(zhuǎn)入到了這4 種鏈格孢菌中，且轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性良好，可以有效避免田間分離回收病原菌時(shí)雜菌的干擾，并且與篩選抗藥性突變體的方法相比，在對(duì)病原菌的研究過(guò)程中具有更簡(jiǎn)便、直觀、穩(wěn)定的特點(diǎn)，今后可利用此方法進(jìn)一步研究棗縮果病菌的侵染規(guī)律和侵染動(dòng)態(tài)。

本研究采用棗果刺傷接種的方法，檢測(cè)GFP標(biāo)記的4 種鏈格孢菌對(duì)棗樹(shù)的致病性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們均可使棗果產(chǎn)生與接種棗縮果互隔鏈格孢菌CN193::gfp相同的發(fā)病癥狀，從接種了4 種鏈格孢菌菌株的發(fā)病棗果中分離培養(yǎng)長(zhǎng)出的菌絲，在熒光顯微鏡下均可觀察到熒光，說(shuō)明蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌均可使棗果發(fā)病，對(duì)棗樹(shù)均有致病性，這一研究結(jié)果與張敏等[39]對(duì)棗縮果病互隔鏈格孢菌潛在寄主的研究結(jié)果一致。因此，在棗園附近應(yīng)避免種植馬鈴薯、番茄、蘋(píng)果、梨及其它易被鏈格孢菌侵染的植物，應(yīng)做好周?chē)胁≈参锏牟『芾砗蛨@區(qū)的綜合防治工作。今后還需進(jìn)一步對(duì)其它鏈格孢屬真菌的致病性進(jìn)行研究，分析其與棗縮果病互隔鏈格孢菌的同源性，從而為進(jìn)一步明確棗縮果病的初侵染病原提供更加可靠的依據(jù)。

棗縮果病菌最初侵入棗樹(shù)的時(shí)期尚不明確，因此，本研究進(jìn)一步探究了供試GFP 標(biāo)記的4 種鏈格孢菌對(duì)棗樹(shù)的侵染途徑，將其在棗樹(shù)花期噴霧接種，待處理枝條上的棗果長(zhǎng)出并發(fā)病后帶回實(shí)驗(yàn)室分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其病組織分離培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌絲在熒光顯微鏡下均能觀察到熒光，說(shuō)明這4 種鏈格孢菌均能在棗樹(shù)花期通過(guò)棗花侵入棗樹(shù)，許陽(yáng)[17]、趙樂(lè)等[40]、張敏[38]也都研究證明了棗縮果病互隔鏈格孢菌在花期即能侵入棗樹(shù)，且王森等[41]在觀察不同地區(qū)不同類(lèi)型棗吊的開(kāi)花期后發(fā)現(xiàn)，棗樹(shù)盛花期較長(zhǎng)，為1 ～2 個(gè)月，所以必須重視在棗樹(shù)花期對(duì)棗縮果病的防治工作，從而更加有效地避免這類(lèi)病原菌對(duì)棗樹(shù)的危害。

3.2 結(jié) 論

本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法獲得了GFP 標(biāo)記的蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、馬鈴薯早疫病菌和番茄黑斑病菌，在棗縮果病的研究中為開(kāi)展病原菌對(duì)寄主的侵染研究提供了更加簡(jiǎn)便有效的方法，同時(shí)證實(shí)了這4 種非棗屬植物寄主上的鏈格孢屬真菌對(duì)棗樹(shù)均有致病性，且在花期和幼果期均可以侵入棗樹(shù)，由此推測(cè)，這 4 種鏈格孢菌也都有可能成為棗縮果病的潛在病原菌，這一研究擴(kuò)大了棗縮果病初侵染病原的研究范圍，并對(duì)棗園規(guī)劃和管理具有一定的指導(dǎo)意義。