連躍斌，許 凱，王文磊，徐 燕，紀德華，陳昌生，謝潮添

(集美大學水產學院，福建 廈門 361021)

0 引言

全球紫菜的年總產值約為20億美元，而我國的紫菜產量位居世界第一，2017年全國的紫菜產量達17.3×104t[1]，其中，壇紫菜(Pyropiahaitanensis)的產量約占全國紫菜產量的75%，產業(yè)規(guī)模巨大，經濟效應可觀[1]。然而，近年來隨著壇紫菜養(yǎng)殖面積不斷擴大，廣大養(yǎng)殖戶仍以傳統(tǒng)方式進行生產，以未經選育的野生種為主要栽培品種，造成壇紫菜種質嚴重退化、產量降低、質量下降等問題[2]。因此，優(yōu)良品種的選育勢在必行。

壇紫菜葉片是四分子嵌合體，一株葉狀體上最多可以有四種顏色。經過嵌合再純化的色素突變體可作為體色標記性狀，并廣泛用于純系選育。壇紫菜色素突變體在基礎研究和生產實踐中的應用價值日益體現。嚴興洪和王素娟[3]使用秋水仙堿對壇紫菜的體細胞進行誘變處理，得到了形狀細長、顏色深、生長較快的紅色突變體。嚴興洪[4]利用紫外線輻射，對條斑紫菜(Porphyrayezoensis)和壇紫菜的原生質體進行誘變處理，經照射后，產生的后代原生質體顏色呈紅色，并出現一些生長速度更快、長寬比更小的純紅色突變體后代。有賀祐勝等[5]在條斑紫菜紅色突變體的研究中表明，紅色突變體與野生型比較，藻紅蛋白含量高，藻藍蛋白含量低，葉綠素a差異不大，所以藻體呈現紅色。徐燕[6]通過60Co-γ射線輻射壇紫菜自由絲狀體，從誘變絲狀體子代中選育性狀優(yōu)良的色素突變體，將誘變品系和野生選育品系進行雜交，之后利用體細胞克隆技術將單一色塊酶解，誘導產生絲狀體進而發(fā)育為完整的紫菜葉狀體，經過四代選育，最終獲得了一個優(yōu)良紫菜純系新品種(閩豐1號)，該品種藻體日均增重快、耐高溫、藻體寬而薄且不易老化。梁艷[7]在對壇紫菜(閩豐1號)的研究中證明，葉狀體的藻膽蛋白含量均極顯著地高于對照組，藻膽蛋白含量是對照組的2.14倍，其中藻紅蛋白含量占比較大，葉綠素a含量同樣顯著高于對照組。在生產中，紫菜藻體的色澤是衡量紫菜菜餅干制品品質高低的重要指標，而已有的研究結果表明紫菜的色澤主要是由其藻體中光合色素的含量和比例決定的[8]。由此可見，探究紫菜色素突變體的形成原因就顯得尤為重要。

影響高等植物顏色形成的色素主要是花青素、類胡蘿卜素、甜菜紅素和葉綠素。然而，在藻類中影響顏色形成的色素主要是藻膽蛋白和葉綠素。光合色素(Chla、PE、PC&APC)的含量和相互之間的比例決定了紫菜的質量和藻體的顏色[9-10]。谷氨酰-tRNA還原酶(Glutamyl-tRNA reductase，hemA)是卟啉合成途徑的第一個關鍵限速酶，能夠催化谷氨酸合成5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid，ALA)[11]。ALA可以調節(jié)Chla的合成[12-14]，提高Chla和捕光系統(tǒng)II的穩(wěn)定性[15]。例如，添加ALA可以促進小球藻(Chlorellavulgaris)和雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)的色素合成與藻體生長[16]。姚嘉龍等[17]對擬南芥(Arabidopsis)的研究表明，hemA基因在Chla生物合成過程中表達量顯著下降，說明相關酶合成減少，導致Chla合成減少。在番茄色素合成中，過剩的血紅素影響細胞內色素的含量和比例，會引起色素突變[18]。在Synechococcussp.PCC7002藻藍蛋白操縱子閱讀框cpcF和cpcE中任意位點插入突變，都會產生相同表現型的突變株，相對于野生型來說這種突變株產生極少的藻藍蛋白，而且所產生的藻藍蛋白缺少α-84位上的藻藍膽素[19]。小球藻的研究發(fā)現，由于突變體在葉綠素Mg2+鰲合酶基因表達缺陷，造成突變體Chla合成缺陷，最終造成小球藻Chla含量減少和藻體顏色黃化[20]。

然而，目前關于紫菜色素合成通路以及色素突變體產生的分子機理尚不清楚[21]。因此，本實驗從色素合成通路出發(fā)，結合相關色素含量測定和色素合成關鍵基因轉錄水平分析，探究壇紫菜顏色形成的分子機制，為進一步理解紫菜等大型海藻的顏色形成機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

正常培養(yǎng)條件：溫度(21±0.5)℃，光照強度50～60 μmol/(m2·s)，光照周期12L∶12D，在新鮮海水中培育，每3天更換1次海水。每個樣品均設置3個生物學重復。

1.2 色度值測量

從每個突變體中隨機選取3株作為實驗材料。藻體平攤于白色濕潤瓷盤上，用CM-700d分光測色計(柯尼卡美能達，Konica Minolta 控股公司，日本)垂直于藻體，測量藻體的中部，取色度值a值和b值。a值越大表示藻體顏色越偏紅色，a值越小表示藻體顏色越偏綠色；b值越大表示藻體顏色越偏黃色，b值越小表示藻體顏色越偏藍色。

1.3 葉綠素和藻膽蛋白的測定

1.3.1 葉狀體藻膽蛋白含量的測定

藻膽蛋白含量測定，參照文獻[22]：1)分別取6份在生長旺期冰凍保存的葉狀體藻體，將其中3份藻體稱取鮮重(WF)后置于105 ℃烘箱中干燥2 h，再稱取干重(WD)，測定藻體的含水率(WC)；2)取另3份藻體在避光環(huán)境中，在倒有液氮的研缽中充分研磨至粉末狀，將粉末倒入50 mL凍存管中，分別加入適量的0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH=6.8)浸泡數分鐘后，用磷酸鈉緩沖液沖洗研缽3次以上，將凍存管中液體總體積控制在25 mL左右，用鋁箔包裹避光；3)將凍存管放入-20 ℃冰箱中冷凍，待完全冰凍后，取出凍存管于室溫下避光解凍，反復凍融6次以上，放入4 ℃冰箱中過夜，徹底提取藻膽蛋白；4)用300目篩絹網將研磨液過濾至50 mL離心管中，用磷酸鈉緩沖液沖洗凍存管，于4 ℃、10 000 r/min離心20 min。取上清液，在錫箔紙包裹的容量瓶中定容至50 mL(V)，搖勻后靜置至室溫；5)用分光光度計測定其在565 nm、615 nm、650 nm和730 nm波長下的OD值(A)。利用公式分別計算1 g藻體中藻紅蛋白(PE)、藻藍蛋白(PC)和別藻藍蛋白(APC)的含量w(mg/g):

w(PE)=[0.123(A565-A730)-0.068(A615-A730)+0.015(A650-A730)]×V/[WF(1-WC)]，

w(PC)=[0.162(A615-A730)-0.001(A565-A730)-0.098(A650-A730)]×V/[WF(1-WC)]，

w(APC)=[0.171(A650-A730)-0.006(A565-A730)-0.004(A615-A730)]×V/[WF(1-WC)]。

1.3.2 葉狀體Chla含量的測定

Chla含量測定，參照文獻[23]：1)分別取6份在生長旺期冰凍保存的葉狀體藻體， 將其中3份藻體稱取鮮重(WF)置于105℃烘箱中干燥2 h后再稱取干重(WD)，測定藻體的含水率(WC)；2)另取3份藻體在避光環(huán)境中，在倒有液氮的研缽中充分研磨至粉末狀，將粉末倒入40 mL錫箔紙包裹的凍存管中，加入適量90%的丙酮溶液浸泡3分鐘，用90%的丙酮溶液沖洗研缽3次以上，蓋上瓶蓋；3)在室溫下，置于避光處24 h，徹底提取Chla，用300目篩絹網將研磨液過濾至50 mL離心管中，于4℃、10 000 r/min離心20 min；4)取上清液，在錫箔紙包裹的容量瓶中定容至50 mL(V)，搖勻；5)用分光光度計測定其在666 nm、730 nm波長下的OD值(A)，計算每克藻體中Chla的含量(mg/g),ω(Chla)=(A666-A730) ×10V/(890(WF(1-WC))。

1.4 RNA提取與轉錄組測序

1.4.1 RNA提取

利用E.Z.N.Z植物提取試劑盒(OMEGA，德國)提取不同顏色突變體樣品RNA。

1.4.2 轉錄組測序

提取樣品總RNA后，將完整性均好，無雜質污染的RNA樣品，由深圳華大基因股份有限公司利用BGISEQ-500高通量測序平臺檢測，然后本研究完成后續(xù)的數據拼接組裝與分析。

1.4.3 RNA-Seq測序數據的處理

測序得到的reads，通過如下步驟處理獲得clean reads：1)去除含有測序接頭的reads；2)去除比例大于10%的reads；3)去除低質量的reads(質量Q≤5的堿基數占整個reads的50%以上)；4)獲得clean reads。

1.4.4 Clean reads

使用無參轉錄組組裝軟件Trinity對clean reads進行無參考組裝，得到壇紫菜Unigene。對組裝出的Unigene進行長度分布、平均長度、N50、組裝大小等測序指標的統(tǒng)計。

1.4.5 Unigene功能注釋

將組裝所獲得的Unigene序列通過序列比對軟件Blast+在7大數據庫(Nr、Swissport、KEGG、GO、COG、KOG、Pfam)中進行序列比對，進而得到該Unigene的功能注釋信息。

1.4.6 基因表達量的計算

根據組裝結果，使用 Bowtie2 軟件把每個樣本的clean reads比對到Unigene，之后使用RSEM (reads per kb per million reads)計算每個樣品的基因表達水平。

1.4.7 差異表達基因的篩選

對經過RSEM軟件比對得到的gene read count數據，用差異表達分析軟件edgeR進行分析。顯著差異表達基因的篩選標準為FDR(false discovery rate)<0.05&log2|FC|>=1，F為基因表達量，C為唯一比對到基因的片段數。

1.4.8 GO和Pathway顯著富集分析

首先把所有的差異基因向KEGG數據庫(http:www.kegg.jp/)的各個Pathway映射，計算每個Pathway的基因數目，然后應用超幾何檢驗，找出與整合基因組差異表達基因顯著富集的Pathway。FDR≤0.05的Pathway定義為差異基因中顯著富集的Pathway。

1.5 聚類分析和熱圖分析

本研究中，在進行表達量計算時，采用計算FPKM值(fragments per kb per million reads)表示基因的相對表達量，FPKM值的計算方法是：FPKM=106C/(NL103)，N為唯一比對到參考基因的總片段數，L為基因長度。

根據基因的注釋信息，選取色素合成通路上的關鍵基因，利用R語言gplots包(http:cran.r-project.org/web/packages/gplots/index.html)中的heatmap.2模塊對這些基因的表達水平進行聚類分析。對不同顏色的6組樣品在關鍵基因的不同表達水平作熱圖分析，并通過樣品之間兩兩對照比較各基因的表達水平。

1.6 數據分析

采用SPSS軟件比較數據均值，并進行單因素方差分析(ANOVA)，以P>0.05為差異不顯著，以P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 實驗樣品RNA的提取及質量檢測

用于送測的RNA樣品濃度介于500～1000 ng/μL之間，總量大于50 μg，A260/A280值在1.9～2.1之間，A260/A230值大于1.8。電泳結果(見圖1)顯示，所有樣品條帶完整、清晰、無拖尾，都具有2條 28 S，3條18 S，以及1條5 S條帶。

2.2 壇紫菜不同色素突變體的色度值測定

不同色素突變體的表觀顏色差異顯著，從色度值可以明顯看出來，不同顏色的品系的色度值區(qū)分明顯。橘色品系的a值平均值最大(21.95±0.29)，翠綠色品系的a值平均值最小(-6.90±0.24)。橘色品系與紅色品系的a值差異不明顯(P>0.05)，但橘色品系明顯高于紫色品系和野生品系(P<0.05)；棕綠色品系明顯比翠綠色品系的a值高(P<0.05)。因此，本研究將色度值相近的幾個品系歸為一類，分別為紅黃組和綠組，紅黃組包括橘色品系、紅色品系、紫色品系和野生品系，綠組包括翠綠色品系和棕綠色品系(見圖2A)。紅黃組的a值平均為(18.66±3.50)，綠組的a值平均為(-3.1±3.72)，兩組樣的差異明顯(見表1)(P<0.05)。而在b值平均值上，兩組樣品無明顯差異(P>0.05)。

表1 紅黃組和綠組的色度值統(tǒng)計分析

說明:上標字母不相同表示顯著差異。

Note:Superscripts represent significant difference among treatments．

2.3 葉狀體藻膽蛋白和Chl a的含量

在PE含量方面，紅色品系含量最高，約為75 mg/g；紫色品系約為70 mg/g；橘色品系約為65 mg/g；野生品系約為50 mg/g；棕綠色品系和翠綠色品系的含量最少，分別為20 mg/g 和15 mg/g。在PC含量方面，紫色品系最多，約為27 mg/g；野生品系約為17 mg/g；棕綠色品系、翠綠色品系和紅色品約為10 mg/g；橘色品系約為2 mg/g。而對于APC而言，紫色品系和野生品系的含量最高，之后依次是棕綠色品系、翠綠色品系、橘色品系和紅色品系，其含量均不超過10 mg/g(見圖2a)。Chla含量測定結果顯示，翠綠色品系的Chla含量約為8 mg/g，顯著高于其他品系(P<0.05)，其中，棕綠色品系、橘色品系和野生品系約為6 mg/g，而紅色品系和紫色品系含量約為4 mg/g(見圖2b)。

通過各品系色素蛋白含量的比值可以發(fā)現：紫色和紅色品系的w(PE)/w(Chla)約為16，橘色品系的w(PE)/w(Chla)約為12，野生品系的w(PE)/w(Chla)約為9，翠綠色品系和棕綠色品系的w(PE)/w(Chla)均小于5。紫色品系的w(PC)/w(Chla)最高，約為6；橘色品系的w(PC)/w(Chla)最低，約為0.3。橘色品系的w(PE)/w(PC)最高，約為30；紅色品系w(PE)/w(PC)約為8.5；紫色品系、野生品系、棕綠色品系和翠綠色品系沒有顯著差異，w(PE)/w(PC)都不高于5(見圖2c)。

2.4 Chl a和藻膽蛋白合成關鍵酶的表達分析

通過相關基因表達水平的聚類分析發(fā)現，在橘色品系、紫色品系和棕綠色品系中hemA基因的表達水平較高(見圖3)。在Chla和藻膽蛋白的合成通路中，谷氨酰-tRNA經由hemA等催化反應生成5-氨基酮戊酸(ALA)(見圖4)，之后，5-氨基酮戊酸經過催化合成原卟啉Ⅸ，再經過Mg-鰲合酶(CHLI、CHLD 和CHLH)催化生成鎂原卟啉Ⅸ。在本實驗中，Mg-鰲合酶在橘色品系、紫色品系和野生品系中的表達水平較高。此外，葉綠素合成酶(CHLG)是合成Chla的關鍵酶，鎂原卟啉Ⅸ經過CHLG等一系列反應生成Chla。本研究發(fā)現，CHLG在橘色品系、紅色品系、野生品系和翠綠色品系中顯著上調表達。

在藻膽蛋白的合成通路中，血紅素氧化酶(HMOX1)是催化血紅素合成膽綠素的關鍵酶，原卟啉Ⅸ經過一系列反應合成血紅素，血紅素再經過HMOX1催化合成膽綠素。在本實驗中，HMOX1在橘色品系、紫色品系、野生品系和棕綠色品系的表達水平高于其他品系。膽綠素再經過鐵氧還蛋白氧化還原酶(HY2)等一系列反應催化，最終合成藻膽蛋白。而HY2在橘色品系、紅色品系、野生品系和翠綠色品系中的表達水平較高。

3 討論

本研究中，紅黃組品系的平均PE含量比綠組高3.5倍，而PC和APC含量卻沒有顯著差異。同時，紅黃組的平均Chla含量顯著低于綠組(P<0.05)，進而造成兩組藻體在顏色上的差異。張倩[24]對皺紫菜(Pyropiacrispata)色素突變體的研究數據表明，紅色品系皺紫菜(PC-ZH)的PE含量明顯高于其他綠顏色的皺紫菜。黃慧珍[1]也發(fā)現，壇紫菜野生品系的PE含量是翠綠色品系的十多倍。本研究中，橘色、紫色、紅色和野生品系的w(PE)/w(Chla)高，其中橘色、紫色和紅色藻體的w(PE)/w(Chla)大于10，翠綠色和棕色品系的w(PE)/w(Chla)小于5。在色澤的差異上，橘色、紫色、紅色和野生品系a值顯著大于翠綠色和棕色品系，所以橘色、紫色、紅色和野生品系呈現紅色，而翠綠色和棕色品系呈現綠色。

在葉綠素和藻膽蛋白合成基因的表達中(見圖4)，橘色品系、紫色品系和棕綠色品系的hemA相關基因的表達水平較高，說明壇紫菜藻體可能大量合成ALA，為Chla和藻膽蛋白的合成提供更多前體，有利于藻體的色素合成。李爽[25]將hemA基因克隆到pET28a載體上，并在大腸桿菌中誘導表達，通過分離純化得到谷氨酰tRNA還原酶。重組菌發(fā)酵液上清中ALA含量達40.2 mg /L，通過過篩試驗和紫外分光光度檢測驗證顯色物質為卟啉類。

在合成通路后續(xù)反應中，鎂離子鰲合酶催化合成鎂原卟啉Ⅸ，鎂離子鰲合酶是原卟啉Ⅸ合成鎂原卟啉Ⅸ的關鍵酶。在色素合成通路中，鎂離子鰲合酶催化鎂原卟啉Ⅸ的合成，決定了通路色素合成的走向(見圖4)。本研究在壇紫菜轉錄組中發(fā)現的CHLI、CHLD 和CHLH是鎂離子鰲合酶的亞基，參與組成鎂離子鰲合酶，進而參與Chla的合成。小球藻突變體的研究中CHLI、CHLD和CHLH表達水平的降低，引起突變體Chla合成缺陷，導致小球藻突變體光合作用降低，最終造成突變體藻體顏色比野生型淺[1]。在本研究中，橘色品系和野生品系的CHLI、CHLD和CHLH基因表達水平高于其他品系(見圖3)。此外，通過紅黃組間比較，發(fā)現橘色品系和野生品系的Chla含量較高(見圖2b)，說明藻體可能大量催化原卟啉Ⅸ(Protoporphyrin Ⅸ)合成鎂原卟啉Ⅸ(Mg Protoporphyrin Ⅸ)，進而合成Chla。在Chla合成通路中，CHLG是催化鎂原卟啉合成Chla的關鍵酶。在鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)[26]和茶樹[27]的研究中均發(fā)現，CHLG表達水平的降低，會造成植株的黃化，生長緩慢。在本研究中，野生品系和翠綠色品系CHLG基因表達水平較高，并且野生品系和翠綠色品系的Chla含量也高(見圖2b)。此外，研究發(fā)現，油菜(BrassicanapusL.)中HMOX1的表達水平高，會抑制Chla的合成，轉向合成膽綠素，造成油菜失綠的現象[28]。牟鈺[29]對白菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinensis)的研究發(fā)現，血紅素加氧酶在血紅素代謝過程中限制了血紅素的降解，使血紅素含量積累，血紅素積累后抑制ALA的合成，ALA合成受阻致使葉綠素合成減少，最終導致葉色變異。

而紅藻在血紅素氧化酶(HMOX1)和鐵氧還蛋白氧化還原酶(HY2)等一系列生化反應下，催化血紅素合成藻膽蛋白。Emborg等[30]發(fā)現擬南芥中血紅素加氧酶發(fā)生突變，使血紅素合成的光敏生色團合成受阻。同樣，本研究發(fā)現紅黃組藻體的HMOX1和HY2上調表達，而橘色品系、紅色品系、紫色品系和野生品系的PE含量明顯高于其他品系。

因此，本研究推測，HMOX1和HY2的高表達水平，可能會抑制Chla的合成，并大量合成膽綠素，最終導致藻體顏色上表現出失綠[28]。而在綠組中，棕綠色品系HMOX1的表達水平高于翠綠色品系，然而棕綠色品系在CHLG的表達水平卻低于翠綠色品系，最終導致棕綠色品系的PE含量顯著高于翠綠色品系(P<0.05)，而Chla含量低于翠綠色品系，進而導致棕綠色品系比翠綠色品系的顏色更深。

4 結論

綜上所述，紅黃組品系藻體PE含量高導致w(PE)/w(Chla)高，綠組品系藻體Chla含量高導致w(PE)/w(Chla)低，從而導致紅黃組品系藻體呈現紅色，綠組品系藻體呈現綠色。進一步通過轉錄組分析發(fā)現，綠組品系藻體中，Mg-鰲合酶和葉綠素合成酶表達水平上調，合成更多Chla，使得藻體呈綠色；紅黃組品系藻體中，血紅素合成時血紅素氧化酶和鐵氧還蛋白氧化還原酶上調，催化血紅素合成膽綠素，最終合成藻膽蛋白，促使藻體顏色變深，呈紅黃色。本研究有助于進一步理解壇紫菜色素合成通路中關鍵酶的作用，為探究壇紫菜色素突變體的形成機制提供了理論依據。