馬曉琨，朱建勇，宋雅楠，張春燕，葉 穎，夏 偉

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院，上海200137

消癭散結(jié)合劑由丹參、柴胡、制香附、青皮、陳皮、制半夏、莪術(shù)、夏枯草、貓爪草共9 味中藥組成，為上海市名老中醫(yī)葉景華教授的經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用已有五年以上，主治“活血化瘀、化痰散結(jié)、疏肝理氣”，對甲狀腺結(jié)節(jié)具有顯著改善效果。本研究擬將上海市第七人民醫(yī)院內(nèi)分泌科運(yùn)用于臨床的消癭散結(jié)湯研制成院內(nèi)制劑——消癭散結(jié)合劑，使之規(guī)范化應(yīng)用于臨床，保證藥物的安全性、穩(wěn)定性、有效性和可控性。本研究采用正交試驗設(shè)計，以丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸及出膏率為考察指標(biāo)[1-3]，對料液比、提取時間、提取次數(shù)等因素進(jìn)行考察，優(yōu)選消癭散結(jié)合劑的最佳提取工藝，提高消癭散結(jié)合劑的提取效率。

1 材 料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260），美國安捷倫公司；電子天平（CPA225D），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 藥物與試劑

對照品：丹酚酸B（批號：111562-201716）、橙皮苷（批號：110721-201818）、迷迭香酸（批號：111871-201706），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純；水為超純水。

丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，產(chǎn)地山東；柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根，產(chǎn)地陜西；香附Cyperus rotundus L.的干燥根莖，產(chǎn)地海南；青皮Citrus reticulata Blanco 及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮，產(chǎn)地浙江；陳皮Citrus reticulata Blanco 及其栽培變種的干燥成熟果皮，產(chǎn)地湖北；半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，產(chǎn)地甘肅；莪術(shù)Curcuma Kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang 的干燥根莖，產(chǎn)地廣西；夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，產(chǎn)地河南；貓爪草Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根，產(chǎn)地河南。以上藥材均購自上海萬仕誠國藥制品有限公司，經(jīng)驗證符合2015 版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫ZORBAX Elipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以0.1%磷酸水為流動相A，以甲醇為流動相B，洗脫程序見表1；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：28 ℃；檢測波長：286 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸對照品適量，加甲醇溶解，分別配制成濃度為2048 μg·mL-1、712 μg·mL-1、108 μg·mL-1混合對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取一日處方量藥材共111 g，加8 倍量水，煎煮2 次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮至50 mL，精密吸取1 mL 濃縮液，加50%甲醇溶液定容至5 mL，搖勻，離心，取上清液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性溶液的制備 稱取除丹參、青皮、陳皮、夏枯草之外的各藥材，按照“2.1.3”項下方法，制備陰性溶液。

2.2 專屬性試驗

分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10 μL，按“2.1.1”項色譜條件進(jìn)行測定，3 種指標(biāo)性成分與其相鄰的色譜峰分離系數(shù)均大于1.5，并且各組分互不干擾，理論塔板數(shù)符合要求，專屬性良好。見圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.1、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mL 置1 mL 量瓶中，前5 位溶液量加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取10μL 注入液相色譜儀，按照“2.1.1”項色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各組分線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍，分別為Y丹酚酸B=253.41X-1.547 4，r=0.999 9，2.048～20.48 μg；Y橙皮苷=461.92X-0.842 4，r=1.000 0，0.712～7.12 μg；Y迷迭香酸=648.16X＋1.571 4，r=1.000 0，0.108～1.08 μg。在相應(yīng)進(jìn)樣范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液5 μL，按“2.1.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的RSD 值分別為0.37%、0.33%、0.49%。表明儀器的精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 按“2.1.3”項下的方法分別制備6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的峰面積，計算丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值分別為2.60%、2.97%、2.54%。表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下制備的供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、4、8、10、24、32 h。按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計算丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的RSD 值分別為0.80%、1.74%、0.85%。表明供試品溶液在32h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗 取已知指標(biāo)成分含量的供試品溶液適量，在線性范圍內(nèi)分別加入一定量的丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸對照品溶液；共6 份。按“2.1.1”項下色譜條件測定含量，結(jié)果丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸平均回收率分別為104.6%、99.94%、95.10%；RSD 分別為1.41%、1.03%、2.24%。說明本方法的回收率良好。

2.4 單因素試驗

2.4.1 料液比對提取率的影響 稱取一日處方量藥材約111 g，共6 份，補(bǔ)足吸水量，料液比分別按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 煎煮1 次，每次0.5 h，煎液濃縮至50 mL。按“2.1.3”項下方法分別制備供試品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的含量測定，結(jié)果見表2。

表2 料液比對提取率的影響結(jié)果

實驗顯示，1∶4、1∶6 提取兩種主成分含量偏低；1∶12 和1∶14 提取效果相當(dāng)；選擇1∶8、1∶10、1∶12 作進(jìn)一步正交試驗考察。

2.4.2 提取時間對提取率的影響 稱取一日處方量藥材約111 g，共5 份，補(bǔ)足吸水量，加8 倍水，煎煮1 次，分別煎煮0.5、1、1.5、2、2.5 h，煎液濃縮至50 mL。按“2.1.3”項下方法分別制備供試品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸含量測定，結(jié)果見表3。

實驗顯示，煎煮0.5 h 的與1 h 提取效果較佳；煎煮1.5 h 的提取效果與2 h 相當(dāng)；且合劑君藥的主成分丹酚酸B 隨著煎煮時間的延長顯著下降，2.5 h時較低。故選擇0.5、1、1.5 h 提取時間作進(jìn)一步正交試驗考察。

表3 提取時間對提取率的影響結(jié)果

2.5 正交試驗

2.5.1 正交試驗設(shè)計 以消癭散結(jié)合劑處方藥材濃縮提取液中丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的含量及浸膏得率為指標(biāo)，采用L9（34）正交實驗考察料液比、提取時間、提取次數(shù)等因素，優(yōu)選最佳的提取工藝，因素水平表見表4。

表4 正交試驗因素水平表

2.5.2 正交試驗方案 稱取一日處方量藥材約111g，按正交設(shè)計各組的方案進(jìn)行提取，合并濾液，減壓濃縮至100 mL，精密吸取1 mL 濃縮提取液，加50%甲醇溶液定容至5 mL，搖勻，離心，取上清液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，獲得各組供試品溶液；按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，計算各供試品溶液中丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的含量，結(jié)果見表5。

表5 消癭散結(jié)合劑提取工藝的L9（34）正交試驗設(shè)計與結(jié)果

2.5.3 干膏收率的測定 精密量取各組濃縮提取液25 mL，分別置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于100 ℃的烘箱中干燥至恒重，取出，放干燥器中冷卻后，迅速稱定重量，計算出膏率，其結(jié)果見表5。

2.5.4 正交試驗結(jié)果分析 根據(jù)各因素對提取工藝影響大小來分配權(quán)重系數(shù)，即丹酚酸B 含量（W1）的權(quán)重系數(shù)為0.3，橙皮苷含量（W2）的權(quán)重系數(shù)為0.2，迷迭香酸含量（W3）的權(quán)重系數(shù)為0.2，干浸膏收率（W4）的權(quán)重系數(shù)為0.3，按此進(jìn)行加權(quán)求和，綜合評分：W（%）=0.3W1/Wmax1＋0.2W2/Wmax2＋0.2W3/Wmax3＋0.3W4/Wmax4。綜合加權(quán)評價結(jié)果見表5 和表6。

表6 方差分析表

由表6 分析可知，各因素對綜合評分的影響依次為C>A>B，最優(yōu)提取工藝為C2A2B2，即1∶10，1 h，2次。故確定最佳提取工藝為：加10 倍水，煎煮1 h，提取2 次。

2.6 驗證實驗

稱取一日處方量藥材約111 g，共3 份，按照確定的最佳提取工藝C2A2B2進(jìn)行驗證實驗，即加入10倍量的水，提取2 次，每次1 h。提取液合并濃縮至100 mL，按照“2.5.2”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件測定丹酚酸B、橙皮苷、迷迭香酸的含量，實驗結(jié)果見表7。綜合評分為96.74%～99.99%，顯示該工藝準(zhǔn)確可靠，可行性好。

表7 驗證實驗結(jié)果

3 討論

本文選擇消癭散結(jié)合劑君藥丹參中的丹酚酸B，臣藥青皮、陳皮中的橙皮苷，佐藥夏枯草中的迷迭香酸作為含量檢測指標(biāo)，其含量測定方法主要參考《中國藥典》2015 年版（一部）相關(guān)藥材項下“含量測定方法”[4]。3 種指標(biāo)性成分的檢測波長在藥典中分別為330 nm、283 nm 和286 nm，但通過實驗發(fā)現(xiàn)，采用波長286 nm，能很好地檢測到4 味藥材中主成分的含量，故采用此波長來檢測消癭散結(jié)合劑樣品，同時借鑒相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]作了優(yōu)化處理。

甲狀腺結(jié)節(jié)屬于中醫(yī)癭病，其主要病機(jī)為血瘀、氣郁、痰凝。前期臨床研究結(jié)果表明，消癭散結(jié)合劑對甲狀腺結(jié)節(jié)有顯著改善效果，安全性良好，具有良好的臨床意義。本次采用多指標(biāo)綜合加權(quán)評分法，優(yōu)化消癭散結(jié)合劑提取工藝，確定最佳提取方法，為消癭散結(jié)合劑的開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供了前期實驗基礎(chǔ)。