高克立 王永昌 夏小軍 雷旭東 李娟 段赟

1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院/甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州730050

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或 膜 莢 黃芪Astragalus membraneceus（Fisch.）Bge.的干燥根［1］。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功效，被廣泛應(yīng)用于臨床［2］。黃芪中的主要活性成分為黃芪黃酮（astragalus isoflavones）、黃芪皂苷（astragalus saponins）和黃芪多糖（astragalus polysaccharides）［2-4］。藥理學(xué)研究表明，黃芪具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、強(qiáng)心、降血糖、抗衰老、抗疲勞、抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、利尿等作用。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了甘肅永登產(chǎn)黃芪和隴西產(chǎn)黃芪水提取物中總黃酮、總皂苷和總多糖含量，對(duì)比分析兩產(chǎn)地黃芪主要活性成分含量差異，報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 UV-240 型紫外分光光度計(jì)（島津）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DHG-9030 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；METTLER AE260 型電子分析天平（瑞士）；CP2250 型電子分析天平（德國(guó)）；KQ-250 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-20B 型低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）等。

1.2 材料 永登產(chǎn)黃芪由甘肅潤(rùn)楓源農(nóng)牧生態(tài)科技有限公司提供；隴西產(chǎn)黃芪購(gòu)自隴西文峰藥材交易城，經(jīng)石長(zhǎng)栓副研究員鑒定均為豆科植物為蒙古黃芪或膜莢黃芪的根。黃芪甲苷（批號(hào)：MUST-11092002，成都曼思特生物科技有限公司提供）；蘆?。ㄅ?hào)：MUST-16111111，成都曼思特生物科技有限公司提供）；D（+）-葡萄糖及其他試劑均為市售分析純；水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪的處理 取適量黃芪于40℃～80℃條件下烘干，粉碎成粗粉（過(guò)1 號(hào)篩），待用。

2.2 黃芪供試品的制備 分別稱取永登產(chǎn)黃芪和隴西產(chǎn)黃芪粗粉3 份，每份100.0g，加10 倍量的水，浸泡半小時(shí)，水煎煮提取3 次，每次同倍溶劑提取1 小時(shí)，壓榨過(guò)濾，濾液水浴濃縮至稠浸膏，稠浸膏于60℃～80℃烘干，粉碎稱量，計(jì)算平均值，即為黃芪水煎膏得率。結(jié)果永登產(chǎn)黃芪與隴西產(chǎn)黃芪的水煎膏得率分別為30.78%和29.78%。干浸膏粉置干燥器中備用。

2.3 亞硝酸鈉-硝酸鋁法測(cè)定總黃酮［5］

2.3.1 蘆丁對(duì)照品溶液的制備。精密稱定蘆丁對(duì)照品10.03mg，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)入50mL 容量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，即得每mL 中含蘆丁0.2006mg 的對(duì)照品溶液。

2.3.2 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0mL 分別置于10mL 比色管中，加水至3mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.5mL，混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液0.5mL，混勻，放置6min，再加4%氫氧化鈉5mL，加水至刻度，搖勻放置15min，以未加對(duì)照品試劑為空白，在200～700nm 進(jìn)行掃描，在506nm 處有最大吸收，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)（y1），濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x1），繪制總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表1，總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

表1 蘆丁不同濃度下顯色后溶液的吸光度結(jié)果

圖1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)圖表，得回歸方程y1=0.011x1+0.001，R12=1.0，濃度在10.03～60.18μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)。精密吸取0.5mL 蘆丁對(duì)照品溶液，按照2.3.2 項(xiàng)下方法顯色，在506nm 處連續(xù)測(cè)定6 次吸光度，記錄結(jié)果，計(jì)算RSD 為0.30%。表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。精密吸取供試品溶液6 份，每份1.0mL。按照2.3.2 項(xiàng)下方法顯色，在506nm 處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果，計(jì)算RSD 為1.51%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。精密吸取供試品液1.0mL，按照2.3.2 項(xiàng)下方法顯色，每隔5min 測(cè)定一次吸光度，持續(xù)100min，RSD 為1.40%，說(shuō)明供試品溶液顯色后在60min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)。精密吸取已知含量的供試品液6 份，每份2.0mL，每2 管精密加入蘆丁對(duì)照品溶液0.8mL、1.0mL 和1.2mL，按照2.3.2 項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算濃度，得回收率。結(jié)果果見(jiàn)表2。

2.4 香草醛-高氯酸法測(cè)定總皂苷［1］

2.4.1 黃芪甲苷對(duì)照品溶液的制備。精密稱定黃芪甲苷對(duì)照品0.0104g，加甲醇定容至10mL 容量瓶中，搖勻，即得含黃芪甲苷1.04mg/mL 的對(duì)照品溶液。

表2 總黃酮加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.2 總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［6-7］。精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液0.10mL、0.15mL、0.20mL、0.25mL、0.30mL、0.35mL、和0.40mL 分別置于10mL 比色管中，水浴蒸干，放置室溫，分別加入5%香草醛乙酸溶液0.2mL，再加入0.8mL 高氯酸，混勻，于70℃水浴中放置15min，取出放置室溫，加冰醋酸至刻度，搖勻，以未加對(duì)照品試劑為空白，在585nm 處有測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)（y2），濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x2），繪制總皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

根據(jù)表3 數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2，得回歸方程y2=0.016x2-0.005，R22=0.998，濃度在10.4～41.6μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn)。精密吸取0.10mL 黃芪甲苷對(duì)照品溶液，按照2.4.2 方法在585nm 處，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄結(jié)果，計(jì)算RSD 為0.10%。表明儀器精密度良好。2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。精密吸取供試品溶液6 份，每份0.5mL。按照2.4.2 項(xiàng)下方法顯色，在585nm 處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果，計(jì)算RSD 為0.42%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

表3 黃芪甲苷不同濃度下溶液的吸光度結(jié)果（n=7）

2.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。精密量取供試品液0.5mL，按照

2.4.2 項(xiàng)下方法顯色，每隔5min 測(cè)定一次吸光度，持續(xù)100min，RSD 為0.22%，說(shuō)明供試品溶液顯色后在60min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)。精密吸取已知含量的供試品液6 份，每份0.1mL，每2 管精密加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液0.12mL、0.15mL 和0.18mL，按照2.4.2 項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5 苯酚-硫酸法測(cè)定總多糖的含量［8］

2.5.1 葡糖糖對(duì)照品溶液的制備。精密稱取105℃烘至恒重的D（+）-葡糖糖0.01015g，用水溶解定容至50mL容量瓶中，搖勻，即得每1mL 中含葡萄糖0.2030mg 的對(duì)照品溶液。

2.5.2 總多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0，0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL 和0.7mL，用水定容至10mL 比色管中，分別精密吸取1.0mL，加入10mL 比色管中，加5%苯酚溶液2.0mL 搖勻，迅速加入濃H2SO4 溶液7.0mL，搖勻放置5min，置沸水浴中加熱15min 后，取出冷卻至室溫，于490 nm 處以試劑空白為參比測(cè)定吸光度［8，9］。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)（y3），濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x3），繪制多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表5。

圖2 黃芪總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 總皂苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表5 葡萄糖不同濃度下溶液的吸光度結(jié)果

圖3 總多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)所得數(shù)據(jù)制作散點(diǎn)圖，繪制總多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3，得回歸方程為y3=0.062x3-0.036，R32=0.997，在2.03μg/mL～12.18μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度實(shí)驗(yàn)。精密吸取0.10mL 葡萄糖對(duì)照品溶液，按照2.5.2 方法在490nm 處，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄結(jié)果，計(jì)算RSD 為0.12%。表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。精密吸取供試品溶液6 份每份1.0mL，按照2.5.2 項(xiàng)下方法顯色，在490nm 處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果，計(jì)算RSD 為1.37%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。精密量取供試品液1.0mL，按照2.5.2 項(xiàng)下方法顯色，每隔5min 測(cè)定一次吸光度，持續(xù)100min，RSD 為2.21%，說(shuō)明供試品溶液顯色后在60min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)。精密吸取已知含量的供試品液6 份，每份1.0mL，每2 份精密加入20.3μg/mL 葡萄糖對(duì)照品溶液1.2mL、1.4mL、1.6 mL，按照2.5.2 項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.6 供試品含量測(cè)定。精密稱取永登產(chǎn)黃芪干浸膏和隴西產(chǎn)黃芪干浸膏各1.0g，用適量水溶解，加甲醇定容至50mL，放置數(shù)分鐘，各吸取上清液3 份，每份1.0mL，加入10mL 比色管中，分別按總黃酮、總皂苷和總多糖含量測(cè)定方法要求測(cè)定，計(jì)算平均值。按公式計(jì)算供試品中總黃酮、總皂苷和總多糖的百分含量。

表6 黃芪多糖加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

其中a%：黃芪水煎供試品中的活性成分的百分含量；供試品溶液各測(cè)定項(xiàng)下實(shí)際測(cè)定的吸光度A 值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出的濃度；黃芪供試品的配制濃度。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 不同產(chǎn)地黃芪中總黃酮、總皂苷和總多糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果（g/g，n＝3）

3 討論

黃芪為甘肅的地道藥材之一，多地均有栽培，甘肅隴西產(chǎn)黃芪質(zhì)優(yōu)量大，被譽(yù)為“中國(guó)黃芪之鄉(xiāng)”。不同產(chǎn)地黃芪由于受品種、生態(tài)地理環(huán)境、土壤因子、生長(zhǎng)年限以及栽培加工技術(shù)等多種因素影響，使得不同地域生長(zhǎng)的黃芪生物活性成分含量差異很大［10-11］。

黃芪中總黃酮、總皂苷和總多糖的含量測(cè)定已有大量報(bào)道［7，9，12］，總黃酮、總皂苷和多糖含量用紫外分光光度法測(cè)定簡(jiǎn)單易行，多被采用。由于黃芪多以復(fù)方隨證入藥，臨床又以水煎劑使用為多，故本實(shí)驗(yàn)以兩產(chǎn)地黃芪水煎提液的干浸膏得率和干浸膏中主要活性成分的含量為指標(biāo)進(jìn)行比較，初步發(fā)現(xiàn)甘肅永登產(chǎn)黃芪與隴西產(chǎn)黃芪中中總黃酮、總皂苷和總多糖含量存在差異，永登產(chǎn)黃芪水煎膏得率比隴西產(chǎn)黃芪高出1 個(gè)百分點(diǎn)，水煎膏中總皂苷、總多糖的含量永登產(chǎn)黃芪高于隴西產(chǎn)黃芪，總黃酮的含量永登產(chǎn)黃芪低于隴西產(chǎn)黃芪。