黃鉦凱 梁明坤 吳發(fā)勝 陸飛國 陳廣文 梁健

〔摘要〕 目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討左金丸治療胃癌的作用機(jī)制。方法 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得左金丸所含中藥的化學(xué)成分及對應(yīng)作用靶點(diǎn)基因，檢索GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫獲得疾病胃癌相關(guān)靶點(diǎn)基因，然后取兩者的交集，得到左金丸作用于胃癌的預(yù)測靶基因;利用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建左金丸化合物-作用靶點(diǎn)-疾病三者相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，采用STRING數(shù)據(jù)庫對左金丸作用于胃癌的預(yù)測靶基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，利用Cytoscape3.7.1 軟件的插件cytohubba篩選出關(guān)鍵靶基因，并利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵靶基因在胃癌中的表達(dá)情況;利用在線工具DAVID進(jìn)行GO功能富集分析并利用Cytoscape3.7.1軟件的ClueGO插件進(jìn)行KEGG通路富集分析。結(jié)果 共篩選出左金丸作用于胃癌的預(yù)測靶基因68個，關(guān)鍵靶基因15個，這些關(guān)鍵基因在ONCOMINE數(shù)據(jù)庫的胃癌樣本和正常樣本中的表達(dá)存在顯著性差異。GO功能富集分析顯示，左金丸作用于胃癌的預(yù)測靶基因主要涉及對有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞程序性死亡的負(fù)調(diào)控等生物過程;KEGG通路富集分析主要涉及癌癥通路、p53信號通路、VEGF信號通路等。結(jié)論 本研究初步揭示了左金丸治療胃癌的主要作用靶點(diǎn)及多靶點(diǎn)、多維調(diào)控、協(xié)同作用、整體調(diào)節(jié)的作用機(jī)制，可為后續(xù)進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制提供參考。

〔關(guān)鍵詞〕 左金丸;胃癌;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);信號通路

〔中圖分類號〕R285.5;R96;R735.2 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.014

〔Abstract〕 Objective To study the mechanism of Zuojin Pills in the treatment of gastric cancer based on network pharmacology. Methods Chemical constituents and corresponding action target genes of Chinese materia medica in Zuojin Pills were obtained from TCMSP database， while GeneCards and OMIM database was retrieved for the target genes of gastric cancer. Then the intersection of the 2 groups of genes were taken to get the predicted target gene of Zuojin Pills acting on gastric cancer. Cytohubba， the plug-in of Cytoscape3.7.1 software was used to screen out key target genes. And the ONCOMINE database was used to analyze the expression of key target genes in gastric cancer. Gene ontology （GO） enrichment analysis was conducted by DAVID online tool and kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway analysis was carried out using Cytoscape3.7.1 software. Results A total of 68 target genes and 15 key genes were screened for Zuojin Pills in the treatment of gastric cancer. There were significant differences in the expression of these key genes in gastric cancer samples and normal samples in ONCOMINE database. GO functional enrichment analysis showed that Zuojin Pills acting the predicted target gens of gastric cancer involved in a series of biological process， such as response to organic substance， negative regulation of apoptosis， negative regulation of programmed cell death， etc. KEGG pathway enrichment analysis mainly involved pathways in cancer， p53 signaling pathway， VEGF signaling pathway， etc. Conclusion This study preliminarily revealed the main targets of Zuojin Pills in the treatment of gastric cancer， and the action mechanism of multi-target， multi-dimensional regulation， synergistic effect and overall regulation， which can provide beneficial thinking for further deeper study on its action mechanism in the furture.

〔Keywords〕 ?Zuojin Pills; gastric cancer; network pharmacology; signaling pathway

胃癌（gastric cancer）是起源于胃上皮的腫瘤。胃癌在世界上最常見惡性腫瘤中排名第五，腫瘤相關(guān)死亡中排名第三，5年生存率僅為29%[1-3]。近年來雖然胃癌的總體發(fā)病率正在下降，但其在所有惡性腫瘤中，發(fā)病率仍居第二位，僅次于肺癌[4-5]。胃癌化療和放療效果欠佳[6]，手術(shù)仍是其治療的重要手段，但遺憾的是大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)已是晚期，預(yù)后較差[7]。中醫(yī)藥治療胃癌有自己的特色與優(yōu)勢，中醫(yī)藥在協(xié)同增效、降低西藥毒性、提高患者生存質(zhì)量等方面發(fā)揮重要的作用，越來越受到人們的重視[8-9]。左金丸是經(jīng)典方劑，由黃連和吳茱萸組成，近年來不少研究表明左金丸有較好的抗胃癌作用[10-12]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合了系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)、藥理學(xué)等多個學(xué)科的技術(shù)和知識，可構(gòu)建藥物的“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，從整體水平、分子層面及多靶點(diǎn)、多通路深入探索藥物與疾病的關(guān)系，是研究藥物治療機(jī)制的一種新的有效手段[13-14]，將該技術(shù)與方法引入中醫(yī)藥研究，從中藥研究、復(fù)雜疾病治療等生命科學(xué)的海量數(shù)據(jù)中，挖掘、發(fā)現(xiàn)、闡釋其中所包含生物學(xué)意義[15]，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)研究模式“一病一靶一藥”的不足，有助于從整體水平、分子層面全面深入闡明中藥多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的綜合作用，從而為中醫(yī)藥研究提供新的思路。鑒于此，本研究借鑒系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)與方法，探索分析左金丸治療胃癌的潛在作用靶點(diǎn)和可能的分子機(jī)制，以期為后續(xù)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?左金丸的化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)篩選

將左金丸所含中藥黃連和吳茱萸以完整拼音的形式輸入網(wǎng)絡(luò)在線數(shù)據(jù)庫TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）進(jìn)行檢索，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（druglikeness，DL）≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出左歸丸所含中藥化合物，并通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)與數(shù)據(jù)庫逐一核對驗(yàn)證化合物的結(jié)構(gòu)等基本信息，確?；衔锓肿拥臏?zhǔn)確無誤;然后在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索上述篩選出的左歸丸化合物對應(yīng)的相關(guān)作用靶點(diǎn)，并將其轉(zhuǎn)換為官方基因名。

1.2 ?疾病胃癌靶點(diǎn)篩選

通過檢索 Genecards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/search/advanced/geneMap）篩選疾病胃癌相關(guān)靶點(diǎn)基因，建立胃癌靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 ?網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

將篩選出的左金丸的作用靶點(diǎn)與獲取的胃癌的疾病靶點(diǎn)，利用網(wǎng)絡(luò)在線工具Venny2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖，進(jìn)行Venn分析，得到交集的共同靶點(diǎn)基因，即為左金丸作用于胃癌的預(yù)測靶基因。利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建左金丸化合物-作用靶點(diǎn)-胃癌三者相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。采用在線工具STRING（http：//string-db.org）構(gòu)建左金丸作用于胃癌的靶點(diǎn)蛋白相互作用（protein protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)。將蛋白種類參數(shù)設(shè)置為“人類”，最低相互作用閾值設(shè)為中等（>0.7），其他參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置，獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。并將該蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1的軟件中，利用該軟件的插件cytohubba，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)篩選關(guān)鍵靶基因，并利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵靶基因在胃癌中的表達(dá)情況。

1.4 ?基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析

使用網(wǎng)絡(luò)在線工具DAVID（https：//david.ncifcrf.Gov）的“functional annotation”模塊進(jìn)行GO功能富集分析。將獲得的左金丸作用于胃癌的預(yù)測靶基因?qū)朐诰€的DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇物種參數(shù)為“homo sapiens”，選擇標(biāo)識符參數(shù)為“official gene symbol”，選擇列表類型參數(shù)為“gene list”，其余參數(shù)為默認(rèn)值，然后提交獲取GO功能富集結(jié)果。

1.5 ?京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）通路富集分析

利用Cytoscape 3.7.1軟件的插件ClueGO對左金丸作用于胃癌的預(yù)測靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，設(shè)置參數(shù)為P<0.05，獲得左金丸治療胃癌的顯著富集的信號通路。

2 結(jié)果

2.1 ?左金丸化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)篩選

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，初步獲得左金丸所含中藥黃連的化合物14個，作用靶點(diǎn)223個;吳茱萸的化合物30個，作用靶點(diǎn)449個;匯總并去重后，最終獲得左金丸的化合物共29個，其中黃連獨(dú)有的化合物8個，吳茱萸獨(dú)有的化合物19個，黃連與吳茱萸共同含有的化合物2個，見表1。去除重復(fù)項(xiàng)和非人種屬靶點(diǎn)，最終獲得左金丸的作用靶點(diǎn)共96個，其中黃連32個，吳茱萸64個，黃連與吳茱萸的共同作用靶點(diǎn)25個;然后運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫將上述篩選的作用靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換校正為官方基因名。

2.2 ?疾病胃癌靶點(diǎn)的篩選

檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫，并以relevance score≥5的標(biāo)準(zhǔn)篩選出胃癌的靶點(diǎn)基因共2 110個;檢索OMIM數(shù)據(jù)庫得到胃癌的靶點(diǎn)基因共240個。將兩個數(shù)據(jù)庫的胃癌的靶點(diǎn)基因合并去重后，最終獲得胃癌靶點(diǎn)基因共2 260個。

2.3 ?網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

將左金丸靶點(diǎn)基因與胃癌靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入在線軟件Venny 2.1.0繪制韋恩圖。通過韋恩圖（見圖1）分析發(fā)現(xiàn)，左金丸靶點(diǎn)與胃癌靶點(diǎn)交集靶點(diǎn)基因共68個，左金丸作用于胃癌靶基因映射率為3%，提示左金丸存在確切防治胃癌的作用靶點(diǎn)，對胃癌具有一定特異性的防治作用。利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建左金丸的化合物-作用靶點(diǎn)-疾?。ㄎ赴┤呦嗷リP(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)圖生動明了地展示了左金丸的各成分、各靶點(diǎn)之間的相互聯(lián)系及多成分、多靶點(diǎn)相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，充分體現(xiàn)了左金丸治療胃癌多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶標(biāo)、協(xié)同作用、整體調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)。

2.4 ?靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)）構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

本研究使用在線工具STRING構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)），見圖3。在此基礎(chǔ)上，利用Cytoscape 3.7.1的軟件的cytohubba插件，通過Degree、EPC、BottleNeck等12種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和節(jié)點(diǎn)間加權(quán)重聯(lián)系的計(jì)算分析算法，根據(jù)得分篩選出15個關(guān)鍵靶基因：MYC、CASP9、CASP3、EGFR、CCND1、VEGFA、CASP8、ESR1、FOS、ERBB2、AR、IL6、CCNB1、RB1、PGR，見圖4。提示這些基因在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可能是左金丸治療胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。同時，利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫獲得上述關(guān)鍵靶基因在正常樣本和胃癌樣本中的表達(dá)情況（見圖5）。從圖5中可看出，15個關(guān)鍵靶基因在正常樣本和胃癌樣本中的表達(dá)存在顯著性差異（P<0.05），表明這些關(guān)鍵靶基因與胃癌的發(fā)生發(fā)展存在一定聯(lián)系。

2.5 ?GO功能富集分析

GO功能富集分析涵蓋生物學(xué)3個方面的內(nèi)容：細(xì)胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物過程（biological process）。本研究采用網(wǎng)絡(luò)在線工具DAVID對獲得的左金丸作用于胃癌的預(yù)測靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果共獲得679個功能富集，其中生物過程575個，細(xì)胞組分46個，分子功能58個，然后再依據(jù)P<0.05的基準(zhǔn)，選取GO富集的前15位，進(jìn)行可視化展示。GO功能富集分析提示，左金丸作用于胃癌的靶基因的生物過程主要涉及對有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)（response to organic substance）、細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptosis）、細(xì)胞程序性死亡的負(fù)調(diào)控（negative regulation of programmed cell death）等;細(xì)胞組分主要涉及微粒體（microsome）、細(xì)胞溶質(zhì)（cytosol）、細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)（endomembrane system）等;分子功能主要涉及配體依賴的核受體活性（ligand-dependent nuclear receptor activity）、類固醇結(jié)合（steroid binding）、轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity）等，見圖6-8。

2.6 ?KEGG通路富集分析

采用Cytoscape 3.7.1軟件的ClueGO插件對左歸丸作用于胃癌的預(yù)測靶基因進(jìn)行KEGG通路富集并進(jìn)行可視化處理，設(shè)置參數(shù)P<0.05，共獲得61個通路富集，按照P值排序，排除明顯無關(guān)通路后，排名靠前的主要涉及癌癥通路（pathways in cancer）、p53信號通路（p53 signaling pathway）、VEGF信號通路（VEGF signaling pathway）等，表明左金丸治療胃癌的作用可能與上述通路有關(guān)。見圖9-10。

3 討論

左金丸出自著名醫(yī)家朱丹溪之《丹溪心法·火方》，方中黃連六兩、吳茱萸一兩，常用于胃部疾病[16]?，F(xiàn)代研究顯示左金丸可抑制胃癌細(xì)胞增殖，且抑制作用呈濃度-時間依賴關(guān)系[17-18]。左金丸的主要活性成分吳茱萸堿和鹽酸小檗堿等可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[19-21]，吳茱萸堿和小檗堿可以通過阻滯胃癌細(xì)胞周期、抑制血管形成等發(fā)揮抗胃癌效應(yīng)[22-24]。以上相關(guān)研究均表明，左金丸具有較好的抗胃癌作用，但與其相關(guān)的分子機(jī)制仍待研究。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討左金丸治療胃癌的分子機(jī)制，結(jié)果顯示：左金丸所含化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)基因有96個，檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫獲得胃癌靶點(diǎn)基因共2 260個，左金丸靶點(diǎn)與胃癌靶點(diǎn)交集靶點(diǎn)基因共68個。同時，我們發(fā)現(xiàn)，左金丸每味中藥存在多個化學(xué)活性成分，每個中藥化學(xué)成分可作用于多個靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)可參與不同的信號通路及生物學(xué)過程，各個化學(xué)成分之間存在著密切的網(wǎng)絡(luò)藥理聯(lián)系，各靶標(biāo)之間也存在相互作用關(guān)系。充分體現(xiàn)了左金丸多靶點(diǎn)、多途徑、多效應(yīng)、協(xié)同作用、整體調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)。通過對68個交集靶基因進(jìn)一步篩選，獲得了關(guān)鍵靶基因共15個：MYC、CASP9、CASP3、EGFR、CCND1、VEGFA、CASP8、ESR1、FOS、ERBB2、AR、IL6、CCNB1、RB1、PGR。其中MYC基因是較早發(fā)現(xiàn)的一組癌基因，包括C-myc，N-myc，L-myc。研究表明C-myc在胃癌的生長、遷移、凋亡方面發(fā)揮著重要的作用[25-27]。C-myc基因與DDX6基因有協(xié)同作用，在胃癌細(xì)胞中起癌基因的作用，促進(jìn)胃癌的發(fā)展[28]。C-myc啟動子與ISL1結(jié)合可激活胃癌細(xì)胞中C-myc的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[29]。有多項(xiàng)研究表明Caspase-9與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[30-32]。此外，研究證實(shí)Caspase-3、Caspase-9的異常表達(dá)參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，兩者起正協(xié)同作用[33]。Caspase-9是細(xì)胞線粒體依賴的凋亡途徑中重要起始因子，Caspase-9的表達(dá)降低，使該凋亡途徑受到抑制，細(xì)胞凋亡異常，從而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生[34]。

此外，本研究的KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，左金丸作用于胃癌的靶點(diǎn)主要涉及癌癥通路、p53信號通路、VEGF信號通路等。p53是公認(rèn)的腫瘤抑制基因，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞分化和凋亡中發(fā)揮重要作用[35]。有研究表明miR-18a可通過靶向結(jié)合IRF2抑制p53信號通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[36];此外，另一項(xiàng)研究提示miR-30可能作為一種致癌miRNA通過調(diào)節(jié)p53途徑調(diào)控線粒體凋亡[37];可見p53信號通路在胃癌中扮演重要角色，這與本研究通路富集結(jié)果提示左金丸主要通過干預(yù)p53信號通路等發(fā)揮抗癌作用是一致的，同時上述這些既往研究也在一定程度上證明了本研究結(jié)果的可靠性。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度，初步揭示左金丸治療胃癌的主要作用靶點(diǎn)及多靶點(diǎn)、多維調(diào)控、協(xié)同作用的分子機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。但是，本研究主要基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫資料，因而存在一定的局限性，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以進(jìn)一步闡釋左金丸抗胃癌的作用機(jī)制。

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