鄧石峰 余雨荷 劉笑萌 艾坤 許明 石磊 張泓

〔摘要〕 目的 通過觀察電針“次髎”“三陰交”“中極”穴對完全性骶髓損傷神經(jīng)源性膀胱（neurogenic bladder， NB）模型大鼠尿流動力學及逼尿肌組織中肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase， MLCK）、肌球蛋白輕鏈（myosin light chain， MLC）和磷酸化肌球蛋白（phosphorylated myosin， p-MLC）表達的影響，探究電針治療完全性骶髓損傷后NB的可能機制。方法 48只健康雌性SD大鼠隨機分為兩組，一組隨機分為空白組和假手術組各12只，剩余大鼠采用改良Hassan Shaker脊髓橫斷法制成骶髓損傷NB大鼠模型，成模后隨機分為模型組和電針組各12只，電針組大鼠術后第20天取雙側“次髎”“三陰交”及“中極”進行電針干預，連續(xù)10 d，1次/d，20 min/次，其余大鼠不做干預處理;干預結束后對比觀察各組大鼠尿流動力學檢測結果，HE染色后光鏡下觀察各組大鼠逼尿肌組織形態(tài)學變化，Western blot法比較逼尿肌組織中MLCK、MLC、p-MLC蛋白表達情況。結果 （1）與空白組、假手術組相比，模型組大鼠漏尿點壓力明顯下降（P<0.01），膀胱最大容量和順應性顯著增大（P<0.01）;與模型組相比，電針組大鼠漏尿點壓力顯著升高（P<0.01），膀胱最大容量和順應性降低（P<0.05或P<0.01）。（2）光鏡下空白組、假手術組逼尿肌形態(tài)結構正常，模型組肌纖維萎縮嚴重、大量的間質結構填充，電針組肌纖維輕度萎縮。（3）與空白組、假手術組相比，模型組逼尿肌中MLCK、MLC、p-MLC的含量顯著降低（P<0.01）;與模型組相比，電針組逼尿肌中MLCK、MLC、p-MLC蛋白含量增高（P<0.05或P<0.01）。結論 電針穴位“次髎”“三陰交”及“中極”能夠減輕完全性骶髓損傷NB模型大鼠逼尿肌萎縮、提高漏尿點壓力、降低膀胱最大容量和順應性從而改善膀胱排尿功能，通過提高逼尿肌組織中MLCK、MLC、p-MLC含量從而增加膀胱逼尿肌的收縮能力可能是電針產(chǎn)生治療效應的機制之一。

〔關鍵詞〕 骶髓損傷;神經(jīng)源性膀胱;電針;尿流動力學;肌球蛋白輕鏈激酶;肌球蛋白輕鏈;磷酸化肌球蛋白

〔中圖分類號〕R245 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.017

〔Abstract〕 Objective To explore the possible mechanisms of electroacupuncture in treating neurogenic bladder after complete sacral cord injury by observing the effects of electroacupuncture at Ciliao （BL32）， Sanyinjiao （SP6）， Zhongji （RN3） acupoints on urodynamics and myosin light chain kinase （MLCK）， myosin light chain （MLC）， phosphorylated myosin （p-MLC） in detrusor tissue of the rats with neurogenic bladder （NB） after complete sacral cord injury. Methods A total of 48 healthy Sprague-Dawley female rats were randomly divided into 2 groups. One group was randomly divided a blank group and a sham operation group， with 12 rats in each group. The remaining rats were made into NB model of complete sacral spinal cord injury by modified Hassan Shaker spinal cord transection method， and they were randomly divided into a model group and an electroacupuncture group after molding， with 12 rats in each group. On the 20th day after operation， only the rats in the electroacupuncture group were given electroacupuncture at Ciliao （BL32）， Sanyinjiao （SP6）， Zhongji （RN3） for 10 days， once a day， 20 min per time. The other rats were not intervened. After the intervention， the urodynamic test results of each group of rats were compared. After HE staining， the morphological changes of the detrusor muscle tissue of each group were observed under light microscope. Western blot was used to compare the expression of MLCK， MLC， p-MLC proteins in the detrusor muscle tissue. Results （1） Compared with the blank group and the sham operation group， the pressure of the leakage point in the model group decreased significantly （P<0.01）， and the maximum capacity and compliance of the bladder increased significantly （P<0.01）; Compared with the model group， the pressure of leakage point in the electroacupuncture was significantly increased （P<0.01）， and the maximum bladder volume and compliance were decreased （P<0.05 or P<0.01）; （2） Under the light microscope， the shape and structure of detrusor in the blank group and the sham operation group were normal. The muscle fibers were seriously atrophic and filled with interstitial structure in the model group and it was slightly atrophic in the electroacupuncture group. （3） Compared with the blank group and the sham operation group， the contents of MLCK， MLC and P-MLC in detrusor muscle of the model group were significantly reduced （P<0.01）; and compared with the model group， the contents were increased in the electroacupuncture group （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Electroacupuncture at Ciliao （BL32）， Sanyinjiao （SP6）， Zhongji （RN3） acupoint can reduce the detrusor atrophy， increase the pressure of leakage point， reduce the maximum capacity and compliance of bladder， and finally improve the function of bladder micturition of the rats with NB ?after complete sacral cord injury. To increase the contents of MLCK， MLC and P-MLC in detrusor tissue and thus increase the contractility of detrusor may be one of the mechanisms of the therapeutic effect of electroacupuncture.

〔Keywords〕 sacral cord injury; neurogenic bladder; electroacupuncture; urodynamics; myosin light chain kinase; myosin light chain; phosphorylated myosin

神經(jīng)源性膀胱（neurogenic bladder， NB）是一類由于神經(jīng)系統(tǒng)病變導致膀胱和尿道功能障礙進而產(chǎn)生一系列下尿路癥狀的疾病總稱，脊髓損傷后所致的NB嚴重降低患者的生存質量，是截癱患者晚期的主要病死原因[1]。其中，骶段脊髓損傷后因低級排尿中樞的破壞常并發(fā)逼尿肌低反射甚至無反射，出現(xiàn)膀胱收縮力低下、膀胱內壓降低、膀胱容量增大，以膀胱排尿困難為臨床特點，表現(xiàn)為尿潴留[2]。肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase， MLCK）是調節(jié)平滑肌收縮的關鍵蛋白，其通過誘導肌球蛋白輕鏈（myosin light chain， MLC）的磷酸化從而誘導平滑肌收縮，是膀胱逼尿肌產(chǎn)生收縮的重要機制[3]。針灸治療脊髓損傷后NB的療效已被大量臨床實踐和實驗研究所證實，但其具體的作用機制還有待進一步深入研究[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)電針對骶髓損傷后尿潴留大鼠有較好的治療作用[5-6]，因此，本實驗以完全性骶髓損傷模型大鼠為實驗對象，采用電針作為干預手段，通過對尿流動力學相關參數(shù)及大鼠逼尿肌內MLCK、MLC、磷酸化肌球蛋白（phosphorylated myosin， p-MLC）含量的觀察，以期進一步探討電針對骶髓損傷后NB治療的可能機制。

1 材料與方法

1.1 ?動物與分組

健康SD雌性大鼠48只，SPF級，體質量250～280 g[動物許可證號SCXK（湘）2016-0002]，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供[實驗設施實驗許可證號：SYXK（湘）2013-0005]，于溫度24～26 ℃的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)3周。使用隨機數(shù)字表法從48只大鼠中抽取24只，隨機分為空白組和假手術組，每組12只;采用改良Hassan Shaker脊髓橫斷法將剩余24只大鼠制作成骶髓損傷神經(jīng)源性膀胱模型，成模后隨機分為模型組和電針組，每組12只。

1.2 ?主要材料、試劑與儀器

1.2.1 ?主要材料、試劑 ?水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司），青霉素鈉、乳酸鹽林格溶液（哈藥集團制藥總廠），中性樹膠、石蠟（美國Sigma），蘇木素、伊紅、顯影液、定影液（中國Well Biology），BCA蛋白定量試劑盒（中國Well Biology）。

1.2.2 ?主要儀器 ?F3導尿管（上?？跌潱?，電動玻璃勻漿器（日本新芝，DY89-1）;臺式冷凍離心機（中國深圳黑馬，TGL-18R），電泳儀（美國Bio-rad164-5050）;轉膜儀（中國北京六一，DYCZ-40A），微量注射泵（浙江史密斯醫(yī)學儀器有限公司，WZ-50C6），16通道生理記錄儀（美國BIOPAC公司，MP150-WSW），華佗牌針灸針、華佗牌電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，SDZ-V）。

1.3 ?模型制備及術后護理

1.3.1 ?手術方法 ?大鼠術前24 h禁食不禁水，并于術前2 h注射20 U單位抗生素預防感染。腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）充分麻醉后俯臥位捆綁固定、備皮。采用改良Hassan Shaker脊髓全斷法[7]進行造模。脊髓橫斷部位為S2-3節(jié)段，對應椎體L2-3節(jié)段為損傷節(jié)段[8]。大鼠備皮消毒后于L2-3椎間隙處用11號手術刀切開大鼠背部皮膚，做約3 cm的切口，鈍性逐層分離筋膜及椎旁肌直暴露L2-4椎體棘突和椎板，采用顯微咬骨鉗咬除L3棘突和椎弓根充分暴露脊髓。利用5號牙科鉤平口探頭端輕輕穿過脊髓腹部，小幅度完全挑起脊髓，以10號手術刀沿牙科鉤平口切斷脊髓，并反復勾刮。當牙科鉤脫離脊髓斷端，無神經(jīng)纖維殘留，則表明骶髓完全橫斷。手術過程中嚴格無菌操作、充分止血、由內到外逐層縫合。假手術組僅切開皮膚、筋膜，但不橫斷脊髓;空白組不做處理。

1.3.2 ?成模及剔除標準 ?根據(jù)前期研究基礎[5-6，9]及預實驗驗證結果，術后20 d大鼠后肢運動功能障礙且表現(xiàn)為尿潴留（日常觀察大鼠尿道口和墊料干燥，恥骨聯(lián)合上方觸診膀胱充盈脹大、提尾懸空不能自主排尿，需以手法輔助排尿）即判斷成模;死亡、自噬或術后20 d內存在自主排尿、尿失禁的大鼠予以剔除。

1.3.3 ?術后護理 ?（1）術后大鼠單籠飼養(yǎng)，保證通風及墊料干燥。（2）術后前3 d每只大鼠腹腔注射20 U單位青霉素酸鈉抗感染，2次/d，第4～7天改為1次/d;同時予以20 mL/kg的乳酸鹽林格溶液皮下注射，預防電解質失衡，2次/d;傷口及周圍碘酒消毒，3次/d。（3）噴灑苦味酸預防大鼠對下肢的自噬，對已出現(xiàn)自噬的大鼠及時進行傷口處消毒包扎處理，并注射青霉素鈉防止感染。（4）造模當天僅予葡萄糖喂養(yǎng)，以減輕腸道負擔;術后2～7 d，在葡萄糖喂養(yǎng)基礎上適當輔以少量飼料喂養(yǎng)，每只10 g/d;7 d后恢復常規(guī)飼料喂養(yǎng)。（5）所有大鼠術后予以crede手法排尿3次/d（每8小時排尿1次），排尿后給水，控制日總飲水量（<30 mL），防止因膀胱長期大量尿液潴留導致腎功能及膀胱壁損傷，密切觀察大鼠的生命體征，及時記錄。

1.4 ?電針干預方法

選擇“中極”、雙“次髎”及“三陰交”進行干預，穴位參照《實驗針灸學》大鼠標準穴位圖譜[10]并結合人體穴位骨度分寸定位。電針組于造模手術20 d后予以電針干預：次髎直刺10 mm，三陰交直刺5 mm，中極斜刺5 mm;電針連接以雙側次髎穴為一組，三陰交與中極為一組（左右兩側三陰交隔日交替與中極對接）;1 次/d，20 min/次，連續(xù)10 d，參數(shù)設置為疏密波（10/50 Hz）、電流0.1 mA，以大鼠下肢出現(xiàn)輕微顫動則為宜。其余各組大鼠不予干預。

1.5 ?觀察指標

1.5.1 ?尿流動力學檢測 ?術后第31天所有大鼠采用膀胱造瘺法[11]行尿流動力學檢測：大鼠以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射充分麻醉后，仰臥位固定，手法排出膀胱內殘余尿液后消毒備皮。于大鼠下腹部做一長約2 cm的縱行切口，逐層切開皮下組織，暴露膀胱，于膀胱頂處造瘺，插入F3導尿管，以3-0外科縫合線荷包縫合固定導尿管。逐層縫合腹部肌肉、筋膜和皮膚，恢復腹部密封環(huán)境。取三通管分別連接16通道生理記錄儀、WZ-50C6 微量注射泵，確保整個管道系統(tǒng)密閉相通，無氣泡影響檢測。導尿管插入膀胱后的初始壓力即為膀胱的基礎內壓，而后打開微量注射泵，灌注溫生理鹽水（水溫25～35 ℃，速度6 mL/h）[9]。觀察并記錄膀胱壓力曲線的變化和漏尿情況：大鼠首次出現(xiàn)漏尿時刻的壓力即為漏尿點壓力（leak pointtpressure， LPP），此時灌入膀胱的液體容積即為最大膀胱容量（maximum cystometric capacity， MCC），膀胱壓力變化/容積變化的比值即為膀胱順應性（bladder compliance， BC）。

1.5.2 ?逼尿肌組織形態(tài)學觀察及胞內MLCK、MLC、p-MLC檢測 ?尿流動力學測試結束后采用脫頸法快速處死大鼠，剪取膀胱以冰生理鹽水洗凈，于冰塊上剪取兩塊約6 mm×8 mm的膀胱組織：一塊以固定液固定，以備HE染色后行鏡下逼尿肌組織形態(tài)學觀察;一塊置于超低溫冰箱中凍存，采用蛋白質印跡法嚴格按照BCA蛋白定量試劑盒說明檢側大鼠膀胱逼尿肌內的MLCK、MLC、p-MLC表達。

1.6 ?統(tǒng)計學方法

使用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)結果以“x±s”表示。多組計量資料符合正態(tài)性和方差齊性，組間兩兩比較則采用單因素方差分析-LSD法;若不滿足方差齊性則用Dunnetts T2或T3多重比較，否則采用秩和檢驗。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

模型組大鼠分別因術后失血過多和膀胱破裂各死亡1只，電針組2只大鼠出現(xiàn)嚴重自噬，1只空白組大鼠在檢測尿流動力學過程中創(chuàng)傷過大死亡，予以剔除后共計43只大鼠納入統(tǒng)計分析。

2.1 ?各組大鼠尿流動力學參數(shù)比較

與空白組相比，假手術組LPP、MCC和BC無顯著變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與空白組和假手術組相比，模型組大鼠的LPP降低，MCC和BC增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組相比，電針組大鼠LPP顯升高，MCC和BC降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。見表1。

2.2 ?各組大鼠逼尿肌組織HE染色比較

400倍光鏡下：空白組及假手術組大鼠膀胱逼尿肌肌束明顯，肌纖維飽滿、排列整齊，肌組織內間質結構少;模型組肌細胞肌纖維萎縮、排列紊亂，肌組織內為大量的間質結構填充，肌束不明顯;電針組大鼠肌細胞肌纖維一定程度萎縮、排列欠整齊，肌組織內間質結構增多，肌束欠明顯。結果見圖1。

2.3 ?各組大鼠逼尿肌中MLCK、MLC、p-MLC表達量比較

與空白組相比，假手術組大鼠逼尿肌組織中MLCK、MLC、p-MLC含量無顯著變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與空白組和假手術組相比，模型組大鼠逼尿肌組織中MLCK、MLC、p-MLC的表達顯著降低，差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組相比，電針組大鼠逼尿肌組織中MLCK、MLC、p-MLC含量一定程度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。見表2、圖2。

3 討論

骶髓損傷后NB主要表現(xiàn)為膀胱排尿困難，屬于中醫(yī)學“癃閉”等病的范疇。其中，“督脈受損、經(jīng)氣不利、氣滯血瘀”為其主要病機，“疏通督脈、活血化瘀”為其主要治法[12]。對于脊髓損傷后的NB治療，針灸療效確切[13]，采用電針治療既有針灸刺激穴位治療的效應，又有電刺激的治療效應，是臨床常用的方法[14]。

正常排尿過程是一個復雜的生理過程，有賴各級中樞和外周神經(jīng)功能的完整性，同時需要逼尿肌、尿道括約肌等肌肉功能的協(xié)調。排尿的低級中樞位于脊髓的骶段，當骶髓受損，排尿反射被破壞，逼尿肌收縮無力，膀胱內的尿液不能經(jīng)尿道完全/充分排除，即表現(xiàn)出尿潴留。因此，逼尿肌收縮無力是骶髓損傷后NB尿潴留的重要病理改變[15]。尿流動力學可動態(tài)客觀反應膀胱儲尿-排尿功能，作為膀胱功能檢查的“金標準”廣泛應用于NB的診斷中[16-17]。本實驗中，與空白組、假手術組相比，模型組大鼠HE染色鏡下可見逼尿肌肌纖維出現(xiàn)顯著的萎縮，尿流動力學檢測結果提示模型組大鼠漏尿點壓力下降，膀胱容量增大，膀胱順應性增加，近期相關研究觀察到類似結果[11]，提示失神經(jīng)支配后，在結構上逼尿肌出現(xiàn)病理性萎縮改變，在功能上導致膀胱收縮無力，從而影響排尿功能，導致尿潴留發(fā)生。電針組鏡下可見逼尿肌肌纖維萎縮程度較模型組輕，其漏尿點壓力增加，膀胱容量減小，膀胱順應性降低，提示電針干預后，逼尿肌病理性改變降低，收縮能力增強，排尿功能一定程度改善。

膀胱逼尿肌屬于平滑肌，MLCK在調節(jié)平滑肌收縮的過程中起關鍵作用。Ca2+-CaM-MLCK信號通路是誘導平滑肌收縮的經(jīng)典通路，當平滑肌細胞內Ca2+濃度升高后，通過結合鈣調蛋白（calmodulin， CaM）激活MLCK，活化的MLCK進一步將MLC磷酸化形成p-MLC，p-MLC程度越高，平滑肌收縮活動也就越強[18-19]。本研究中觀察到模型組大鼠逼尿肌組織內MLCK、MLC和p-MLC表達顯著降低（P<0.01），提示逼尿肌收縮能力下降;電針干預后大鼠逼尿肌組織內MLCK、MLC和p-MLC表達增高（P<0.01或P<0.05），提示平滑肌收縮能力增強。其結果與鏡下觀察及尿流動力學檢測結果一致，表明通過提高逼尿肌組織中MLCK、MLC、p-MLC含量從而增加膀胱逼尿肌的收縮能力可能是電針對骶髓損傷后NB模型大鼠產(chǎn)生治療效應的胞內機制之一。

本實驗緊扣排尿過程中逼尿肌收縮這一關鍵生理過程進行了探討，當然，完整的逼尿肌的收縮過程還涉及到復雜的上下游調節(jié)機制，相關內容有待更進一步的實驗研究，以期更深入更完整地說明針灸對該病的治療機制，為臨床治療提供更加明確的指導。

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