姚書帆，堯雨斯，鄭武斌，葉晨喆，應(yīng) 杰，呂光磊，李春霞

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

1 引 言

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是介導(dǎo)多種生物過程的重要信號(hào)分子[1-3]。次氯酸(HOCl)/次氯酸鹽(-OCl)是一種由過氧化氫和氯離子在髓過氧化物酶(MPO)催化作用下產(chǎn)生的ROS[4]。HOCl在機(jī)體抵抗病原體的免疫防御中起著至關(guān)重要的作用[5]。人們發(fā)現(xiàn)，HOCl不僅可以清除先天免疫系統(tǒng)中的病原體和微生物，而且在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡中起著重要作用，并參與多種信號(hào)傳導(dǎo)過程[4]。盡管如此，越來越多的證據(jù)表明過量的HOCl會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和器官的氧化應(yīng)激，從而引發(fā)很多疾病，例如帕金森病[6]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[7]、肝損傷[8]和癌癥等[9]。因此，開發(fā)一種可靠、精準(zhǔn)以及能夠在生理水平條件下檢測HOCl的分析方法至關(guān)重要。

內(nèi)源性HOCl具有很高的活性，能與其他生物分子和抗氧化劑迅速反應(yīng)，給跟蹤和分析其在生物體內(nèi)的生理功能帶來了巨大挑戰(zhàn)[2,10]。在過去的幾十年里，科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)了一些檢測HOCl的方法，如電分析法、色譜法、化學(xué)發(fā)光法和熒光分析法[11-14]。其中熒光探針以其簡單、快速、高選擇性、高靈敏度和實(shí)時(shí)檢測等突出優(yōu)點(diǎn)，被證明是最有效的非侵入性和原位識(shí)別HOCl的方法[15-22]。

近年來已經(jīng)有一些有機(jī)小分子熒光探針被廣泛應(yīng)用于HOCl檢測，按發(fā)光母核的不同大致可以分為：BODIPY[23-26]、萘酰亞胺[27-28]、羅丹明[20,29]、香豆素[30]等。許多熒光探針能夠在體外或在細(xì)胞中檢測HOCl，但由于發(fā)射波長較短，使其在活體中的檢測受到了限制[31-36]。與可見光熒光探針相比，近紅外(NIR)熒光探針具有一些顯著的優(yōu)勢，如較高的組織穿透深度和較低背景熒光等[37-41]。因此，迫切需要開發(fā)出具有檢測生物體中HOCl的近紅外熒光探針，而構(gòu)建“turn-on”熒光探針是檢測HOCl的一種重要策略，其具有高的靈敏度和信噪比。

本文以亞甲基藍(lán)(Methylene blue，MB)[42]為熒光母核，利用其還原形式(RMB)和氧化形式(LMB)之間的熒光變化，設(shè)計(jì)合成了一種近紅外熒光探針MB-1用于HOCl的檢測。該探針可在體外特異性檢測HOCl，伴隨著顯著的近紅外熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)和顏色從無色到藍(lán)色明顯的變化，在HOCl的分析檢測方面具有良好的應(yīng)用潛力。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)過程中使用的所有試劑和溶劑均來自商業(yè)供應(yīng)商(表1)，未經(jīng)進(jìn)一步純化。

表1 藥品和溶劑

在乙腈或乙醇(HPLC級(jí))中制備探針MB-1的儲(chǔ)備溶液(1 mmol/L)，并進(jìn)一步用PBS(磷酸鈉緩沖液，pH=7.4)稀釋至最終濃度(10 μmol/L)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法合成活性物種[43]。所用材料包括叔丁基過氧化氫(TBHP)、5%NaOCl溶液、30%H2O2溶液、硝基鐵氰化鈉(Ⅲ)二水合物(SNP)、2,2′-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽、超氧化鉀(KO2)、3-嗎啉代嘧啶鹽酸鹽和亞鐵硫酸鹽，在超純水或二甲基亞砜(DMSO)中制備ROS或活性氮物質(zhì)(RNS)。自由基(·OH和TBO·)由芬頓反應(yīng)生成：在H2O2(1 eq)存在下加入FeSO4(5 eq)制備·OH，在TBHP(1 eq)存在下加入FeSO4(5 eq)制備TBO·。最后在PBS緩沖溶液中稀釋到設(shè)定的濃度進(jìn)行測試。

在F-4600熒光分光光度計(jì)上測量了探針在HOCl存在時(shí)熒光強(qiáng)度的變化，激發(fā)波長λex=620 nm。探針的吸收光譜在UH 5300紫外-可見分光光度計(jì)上進(jìn)行測量。1H NMR(400 MHz)和13C NMR(100 MHz)在Bruker AV-400或AV-600 NMR光譜儀上進(jìn)行測量。使用TOF MS儀器進(jìn)行高分辨率質(zhì)譜(HRMS)分析。

2.2 探針的合成步驟

MB-1的合成(圖1)：向MB(1.00 g，3.13 mmol，1.0 eq)的10 mL水溶液中加入二氯甲烷(DCM，5 mL)和Na2CO3(1.33 g，12.52 mmol，4.0 eq)。在氮?dú)鈿夥障?，將上述混合溶液?0 ℃持續(xù)攪拌。接著，使用注射器將溶于水中的連二亞硫酸鈉(10.89 g，12.52 mmol，4.0 eq)直接注入混合溶液中。然后，在氮?dú)鈿夥障拢瑢⒎磻?yīng)溶液于40 ℃持續(xù)攪拌1 h，直到溶液變?yōu)辄S色。用冰水浴對(duì)溶液進(jìn)行冷卻，然后向里面滴加溶于5 mL二氯甲烷中的雙(三氯甲基)碳酸酯(0.56 g，1.88 mmol，0.6 eq)。添加完畢后，在氮?dú)鈿夥障?，將混合物于室溫下攪? h。最后，將反應(yīng)溶液倒入100 mL冰水中，并用DCM進(jìn)行萃取。通過合并有機(jī)相，萃取物用無水硫酸鈉干燥后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)除去溶劑，然后通過柱色譜法純化得到化合物MB-Cl(白色固體，產(chǎn)率為48.2%；乙酸乙酯/正己烷=1/10)。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ=7.42(s，2H)，6.72(s，2H)，6.65(d，J=8.0 Hz，2H)，2.98(s，12H)。

向100 mL的schlenk管中加入化合物MB-Cl(50.0 mg，0.144 mmol)、Na2CO3(61.4 mg，0.576 mmol)、N,N-二甲基苯胺(78.6 mg，0.576 mmol)，加入溶劑二氯甲烷(5.0 mL)。在40 ℃條件下，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行薄層色譜跟蹤直至反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液冷卻到室溫，減壓濃縮，柱層析分離提純得到化合物MB-1(黑色固體，產(chǎn)率為58.3%；乙酸乙酯/石油醚=1/1)。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ=7.43(d，J=8.2 Hz，2H)，7.23(d，J=7.5 Hz，2H)，6.75(s，1H)，6.71(s，2H)，6.65(s，4H)，2.92(s，12H)，2.86(s，6H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ=153.7，149.0，147.5，134.3，128.7，128.2，127.2，121.6，113.4，111.3，111.0，41.2，40.7。HR-MS(ESI，m/z): calcd for C25H29N5OS [M+H]+，448.214 3，found 448.212 6。

圖1 MB-1的合成路線

2.3 檢出限的測定

根據(jù)常用的熒光滴定法確定檢測限(LOD)。通過收集11次探針(10 μmol/L)在PBS緩沖液中的發(fā)射光譜以確認(rèn)其標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)。然后，根據(jù)HOCl在0.0～4.0 μmol/L范圍內(nèi)686 nm處的熒光滴定數(shù)值擬合線性回歸曲線，并獲得曲線的斜率(k)。最后，使用以下公式計(jì)算檢出限：D=3σ/k。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針對(duì)HOCl的響應(yīng)性

如圖2，探針MB-1本身基本無熒光，但在HOCl存在條件下，缺電子的酰胺羰基處很容易受到攻擊從而斷裂生成熒光團(tuán)MB?；诖?，我們認(rèn)為MB-1具有實(shí)時(shí)檢測HOCl的潛在能力。為進(jìn)一步研究探針對(duì)HOCl的響應(yīng)特性，我們?cè)谑覝叵碌腜BS溶液中記錄了相應(yīng)的光譜信號(hào)。如圖3(b)所示，添加HOCl后，探針在686 nm處顯示出顯著的熒光發(fā)射增強(qiáng)，并且當(dāng)添加10 μmol/L的HOCl時(shí)，探針MB-1的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)倍數(shù)達(dá)到最大，為198倍。接著，使用熒光滴定法測試了探針的檢出限(HOC1濃度范圍為0.0～4.0 μmol/L)，MB-1的檢測限低至8.2 nmol/L(圖3(c)、(d))。除此之外，我們還通過吸收滴定方法測得其檢測限為62 nmol/L(圖3(e)、(f))，遠(yuǎn)大于8.2 nmol/L，進(jìn)一步說明熒光檢測法比吸收光譜的靈敏度高。此外，與熒光強(qiáng)度變化同步發(fā)生的是溶液顏色變化，加入HOCl后，溶液由無色變?yōu)轱@著的藍(lán)色(圖2)。因此，該探針可以作為HOCl的“裸眼”指示劑。上述結(jié)果表明，MB-1探針對(duì)溶液中的HOCl具有較高的敏感性。

圖2 MB-1與HOCl反應(yīng)示意圖，插圖為探針與HOCl反應(yīng)前后溶液顏色變化。

圖3 (a)在HOCl(10 μmol/L)存在下，MB-1(10 μmol/L)在PBS中的紫外-可見吸收光譜；(b)在不同濃度的HOCl(0, 2.5,5.0,7.5,10 μmol/L)存在下，MB-1(10 μmol/L)在PBS中的熒光光譜；(c)在PBS緩沖液中用HOCl(0.0～4.0 μmol/L)進(jìn)行連續(xù)滴定，探針MB-1(10 μmol/L)的發(fā)射光譜；(d)根據(jù)HOCl從0.0～4.0 μmol/L范圍內(nèi)MB-1在686 nm處的熒光強(qiáng)度進(jìn)行線性回歸曲線擬合；(e)在PBS緩沖液中用HOCl(0～10 μmol/L)進(jìn)行連續(xù)滴定，探針MB-1(10 μmol/L)的吸收光譜；(f)根據(jù)HOCl從0～10 μmol/L范圍內(nèi)MB-1在665 nm處的吸收值進(jìn)行線性擬合。PBS(pH=7.4)，λex=620 nm，λem=686 nm。

3.2 探針對(duì)HOCl的選擇性

圖4 在PBS溶液(pH=7.4)中存在各種分析物(100 μmol/L)下探針MB-1(10 μmol/L)在686 nm處的熒光響應(yīng)。(a)添加不同的ROS/RNS(從A到和H：HOCl；(b)添加各種陰離子(從A到和I：HOCl；(c)添加各種陽離子(從A到和J：HOCl；(d)添加各種氨基酸(從A到O：Pro、Ser、Ala、Gln、Val、Thr、lle、Gly、Tyr、Met、Trp、Phe、Cys、Glu、Lys)和P：HOCl。激發(fā)和發(fā)射波長(λex/λem)分別為620/686 nm。

3.3 探針的抗干擾能力

生物體內(nèi)不只含有HOCl，為驗(yàn)證該探針具有應(yīng)用于生物體的潛力，我們研究了加入其他還原劑(包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷胱甘肽(GSH)、葡萄糖和醛)的情況下探針的抗干擾能力。如圖5，高濃度的葡萄糖和醛(0.5 mmol/L)不會(huì)干擾探針對(duì)HOCl的檢測，而由于NAC和GSH能在一定程度上消耗HOCl，隨著它們濃度的逐漸增加，探針的熒光發(fā)射強(qiáng)度有所降低，但即使在分別存在20 μmol/L NAC和GSH情況下，探針的熒光強(qiáng)度仍比僅存在探針本身時(shí)增加了13倍和6倍。此外，不同pH值對(duì)探針檢測HOCl的影響也是我們要考慮的情況之一。如圖6，我們檢測了探針MB-1在pH=2～12的PBS溶液中與HOCl(10 μmol/L)反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，在10 μmol/L的HOCl存在下，探針的熒光發(fā)射強(qiáng)度在5～11的pH范圍內(nèi)均顯示出顯著的熒光發(fā)射增強(qiáng)。綜上所述，探針MB-1在復(fù)雜的溶液環(huán)境中具有出色的抗干擾能力，表明它具有能夠在生理水平上進(jìn)行HOCl檢測的可能。

圖5 幾種細(xì)胞還原劑對(duì)MB-1(10 μmol/L)響應(yīng)HOCl的干擾。(a)NAC；(b)GSH；(c)HCHO；(d)葡萄糖。激發(fā)和發(fā)射波長(λex/λem)分別為620/686 nm。

圖6 在不存在和存在HOCl(10 μmol/L)情況下，pH對(duì)MB-1(10 μmol/L)在686 nm處熒光強(qiáng)度的影響。激發(fā)和發(fā)射波長(λex/λem)分別為620/686 nm。

4 結(jié) 論

本文基于亞甲基藍(lán)的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成了探針分子MB-1用于HOCl的檢測。MB-1對(duì)HOCl具有良好的特異性、較低的檢測限和較好的抗干擾能力，可以實(shí)現(xiàn)微量HOCl的特異性檢測。另一方面，本文還提供了一種設(shè)計(jì)思路：通過調(diào)整苯胺對(duì)位官能團(tuán)的取代基可以設(shè)計(jì)合成一系列對(duì)HOCl響應(yīng)的探針分子。該類探針可為檢測病變組織部位的HOCl提供可能。該探針也存在一些不足，如只能在HOCl濃度范圍比較窄的區(qū)間內(nèi)進(jìn)行定量測定以及探針對(duì)HOCl的響應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長等。這些都是我們今后需要改進(jìn)和完善的問題。