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(1.寧波大學食品與藥學學院,浙江寧波 315800;2.浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室,浙江寧波 315800)

迷迭香酸(Rosmarinicacid,簡稱RA)是天然的水溶性酚酸類化合物,首先由兩位意大利化學家從迷迭香(Rosmarinusofficialis)中分離出來[1-2],是咖啡酸和3,4-二羥基苯基乳酸由酯鍵相連形成的二聚體,其廣泛分布于各類藥用植物中,尤其是紫草科和唇形科植物[3]。ε-聚賴氨酸(ε-Polylysine,簡稱ε-PL)是天然的食品防腐劑,由25～30個L-賴氨酸殘基組成,于1977年被Shima和Sakai從土壤中分離出來[4]。ε-聚賴氨酸具有廣譜抗菌作用(AMP),能抑制酵母菌、真菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、噬菌體,可以作為新型抗生素抑制微生物,在日本已經被列入食品添加劑的清單[5]。而金黃色葡萄球菌作為一種常見的食源性腸道致病菌廣泛地存在于自然界中,適宜環(huán)境下可產生腸毒素,人誤食感染金黃色葡萄球菌食物會導致嘔吐、腹痛等癥狀[6]。合理利用抑菌劑可以降低金黃色葡萄球菌帶菌率,減少此類食源性疾病的發(fā)生。

近年來,迷迭香酸由于抗病毒、抗氧化、抗炎癥等諸多生物學活性,使其在功能食品、香料、調味品、日用化工等領域均有廣泛的應用,還可作為食品中潛在的植物化學補充劑和降糖劑[7-8]。ε-聚賴氨酸于2014年被列入我國食品添加劑的行列,可作為焙烤食品、熟肉制品、果蔬汁類的防腐劑[9]。目前研究表明迷迭香酸和ε-聚賴氨酸均有廣譜抗菌作用,能抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌,兩者均對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用,前者對革蘭氏陽性菌抑制效果更明顯[8]。而抗生素濫用會導致耐藥性細菌頻繁出現(xiàn)[10],國內外學者對迷迭香酸和ε-聚賴氨酸的研究多集中于其各自生物學活性和應用上,對兩者聯(lián)合使用抑菌效果尚未報道。

本研究旨在評估迷迭香酸和ε-聚賴氨酸聯(lián)合使用及單獨使用迷迭香酸或ε-聚賴氨酸的抑菌效果,并根據這兩種抑菌成分對金黃色葡萄球菌的協(xié)同作用,得到最低抑菌濃度指數(shù),降低其使用劑量,從而最大程度地減少這些抗菌成分可能存在的潛在毒副作用,進而將這兩種抑菌成分的復合物廣泛地應用于食品領域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens) 寧波大學實驗室保藏菌種;迷迭香酸(≥97%)、ε-聚賴氨酸(MW<5000) 麥克林試劑公司(中國);LB肉湯培養(yǎng)基(配方:胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g,pH7.0±0.2,加水定容至1 L)、LA瓊脂培養(yǎng)基(配方:牛肉膏1.0 g,酵母膏2.0 g,蛋白胨5.0 g,NaCl 5.0 g,瓊脂15.0 g,pH7.4,加水定容至1 L) 青島高科園海博生物技術有限公司;SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、還原糖含量檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;Brandford法蛋白質定量檢測試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司。

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;LDZF-50L-П型立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療機械廠;SW-CJ-2D超凈工作臺 蘇州華科凈化設備有限公司;QHZ-12A組合式恒溫震蕩培養(yǎng)箱 寧波江南儀器制造廠;Eppendorf centrifuge 5418R 德國Eppendorf公司;Infinnite200pro酶標儀 瑞士TECAN公司;梯度PCR儀 寧波歐普儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抑菌劑的配制和菌種的活化純化 參照Liu等[10]和Balakrishnan等[11]實驗方法,用純水將迷迭香酸(RA)和ε-聚賴氨酸(ε-PL)配成質量濃度分別為16和3 mg/mL的母液,用0.22 μm的無菌濾膜過濾除菌,4 ℃冰箱冷藏備用。

將實驗室保藏的菌種接種至100 mL的LB肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃ 150 r/min震蕩培養(yǎng)10 h,再于固體瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線,劃線后的平板在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)挑取單個菌落接種至無菌肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃ 150 r/min震蕩培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)6～8 h,菌液離心并用生理鹽水沖洗2～3次,保存于30%甘油中,-40 ℃冰箱凍存。每次使用時取200 μL接種至100 mL的滅菌LB肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)6～8 h后,通過稀釋調節(jié)濃度至105～106CFU/mL。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用肉湯稀釋法[11],將迷迭香酸和ε-聚賴氨酸用無菌LB肉湯分別二倍稀釋成一定濃度梯度(8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL和1.5、0.75、0.375、0.1875、0.09375 mg/mL)。每個濃度抑菌液中接種2%(V/V)活化后的菌液105CFU/mL,置于37 ℃ 150 r/min的恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)24 h,以不加抑菌液為空白對照。用肉眼觀察是否有沉淀物,600 nm吸光度檢測,得到兩種抑菌成分的MIC值,重復測定三次[12]。

1.2.3 棋盤法檢測RA和ε-pL的聯(lián)合抑菌效果 棋盤法:參照周亞濱[13]的方法,依賴于各抑菌成分單獨使用時的最小抑菌濃度(MIC)為基礎,在96孔細胞板上將抑菌劑按不同方向二倍稀釋,進行交叉配合。1～10列每孔依次加入二倍梯度稀釋的迷迭香酸溶液50 μL,A～F行每孔加入二倍梯度稀釋的ε-聚賴氨酸溶液50 μL,第11列每孔中ε-聚賴氨酸梯度濃度溶液作為對照,第G行每孔中加入迷迭香酸梯度濃度溶液作為對照,每孔中加入菌液(105CFU/mL)100 μL,混合均勻,于37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)18 h,觀察是否有肉眼可見菌,實驗重復測定三次。FICI(Fractional inhibitory concentration index),即抑菌濃度指數(shù)[14]。

結果評價[15]:FICI≤0.5,協(xié)同作用(synergy);FICI≥4,拮抗作用(antagonism);其他情況均為無相互作用(no interaction)。

1.2.4 抑菌動力學曲線 參照Liu等[10]的實驗方法,采用液體培養(yǎng)法來測定。于96孔板上每孔加入100 μL菌懸液(105CFU/mL)和100 μL的抑菌劑,混合均勻后置于37 ℃、150 r/min的恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng),每隔2 h測定620 nm處吸光度,連續(xù)測定24 h。以不加抑菌劑的菌液作為對照,實驗做三組平行。抑菌動力學的公式為:

式中：A0為對照組的吸光度,A為實驗組的吸光度。

1.2.5 迷迭香酸和ε-聚賴氨酸的抑菌圈直徑 通過牛津杯法來測定抑菌圈,參照Wang等[16]研究方法加以修改。培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液經過稀釋,使其菌落數(shù)約為105CFU/mL,吸取100 μL該稀釋的菌液涂布于瓊脂平板上,并將牛津杯放置于瓊脂平板表面,分別加入200 μL的MICRA、2MICRA、MICε-PL、2MICε-PL、1/4MICRA+1/4MICε-PL、1/2MICRA+1/2MICε-PL,對照組加入等量的無菌蒸餾水。在4 ℃條件下靜置擴散6 h后,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,再測定抑菌圈直徑,每組實驗平行做三次。

1.2.6 迷迭香酸和ε-聚賴氨酸對細菌還原性糖和可溶性蛋白的影響 還原糖含量的測定參照崔凱宇[17]方法:取活化后的菌液1 mL接種到100 mL滅菌LB肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃ 150 r/min震蕩培養(yǎng)4 h后菌液離心,重懸于無菌肉湯培養(yǎng)基中,調節(jié)菌液濃度約為108CFU/mL,用此菌懸液稀釋RA的濃度為MICRA,ε-PL的濃度為MICε-PL,以及RA和ε-PL協(xié)同抑菌濃度,以不加抑菌劑的菌懸液做空白對照。實驗參照還原糖含量檢測試劑盒說明書,分別提取2、4、6 h的上述培養(yǎng)液1 mL,3000 r/min離心10 min后去上清,菌沉淀參照還原糖試劑盒測定540 nm處的吸光度。根據標準還原糖溶液繪制標準曲線,并根據標準曲線計算還原糖含量,實驗重復三次。

可溶性蛋白含量的測定[18]:取上述實驗培養(yǎng)2、4、6 h的菌液各1 mL,5000 r/min離心10 min后取上清液[19],按照Brandford法[20]于595 nm處測吸光度,用標準蛋白溶液繪制標準曲線,可溶性蛋白含量根據標準曲線測定蛋白含量,實驗重復測三次。

1.2.7 迷迭香酸和ε-聚賴氨酸對菌表層蛋白的影響 參照Hamza等[14]實驗方法,表層蛋白:將1.2.6中添加了抑菌劑的菌懸液于37 ℃ 150 r/min混合培養(yǎng)6 h后,離心(5000 r/min,10 min)后棄上清。菌沉淀重懸于1 mol/L LiCl中,重懸液體積占1/10,在42 ℃ 180 r/min搖床中震蕩處理2 h,取部分上清液進行SDS-PAGE電泳分析[21]。

電泳:將上述樣品與等體積蛋白上樣緩沖液[22]混合后,沸水浴5 min,趁熱上樣,每孔10 μL。凝膠制備:15%分離膠(distilled water 2.4 mL,30% Acr-Bis(29∶1)5.0 mL,Gel buffer A 2.5 mL,10% APS 0.1 mL,TEMED 0.006 mL),5%濃縮膠(distilled water 1.0 mL,30% Acr-Bis(29∶1)0.5 mL,Gel buffer B 1.5 mL,10% APS 0.03 mL,TEMED 0.003 mL)。電泳跑膠電壓先80 V,后120 V,2 h。電泳完畢,將凝膠與考馬斯亮藍R250染色液微波爐加熱染色6～8 min后脫色1 h,觀察結果并拍膠。

1.3 數(shù)據處理

每個處理重復三次,實驗數(shù)據采用IBM SPSS Statistics 21軟件進行數(shù)據ANOVA分析,通過OriginLab OriginPro 8.5軟件(美國Origin Lab公司)進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 迷迭香酸與ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑制作用

根據孫峋等[23]研究發(fā)現(xiàn),迷迭香酸對金黃色葡萄球菌的抑菌作用明顯大于大腸桿菌,而本試驗如表1所示,迷迭香酸對金黃色葡萄球菌的抑菌效果也明顯高于其他試驗菌。又因ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都表現(xiàn)出較強的抑制作用,所以采用棋盤法將兩種抑菌劑進行聯(lián)合作用實驗,實驗結果證明迷迭香酸和ε-聚賴氨酸在對金黃色葡萄球菌的相互作用的試驗中表現(xiàn)出協(xié)同作用,協(xié)同指數(shù)為0.5。為迷迭香酸和ε-聚賴氨酸聯(lián)合抑菌實驗確定了抑制濃度,即1 mg/mL RA+0.0469 mg/mL ε-PL。李永波等[24]研究發(fā)現(xiàn),迷迭香酸超過一定濃度時對金黃色葡萄球菌、腸桿菌屬、沙門氏菌均有顯著的抑菌效力,且對常見革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有廣譜抑菌作用。這與本試驗迷迭香酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用相符,且驗證了迷迭香酸對金黃色葡萄球菌較大腸桿菌抑制作用更強這一特性。

表1 迷迭香酸與ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑制作用Table 1 Synergistic inhibitory effect of rosmarinic acid and ε-polylysine on Staphylococcus aureus

2.2 迷迭香酸和ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌抑菌直徑的影響

如表2所示,迷迭香酸和ε-聚賴氨酸無論是單獨還是聯(lián)合使用,隨著濃度的增大對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑都會增大,但是1/4MICRA+1/4MICε-PL對金黃色葡萄球菌的抑菌效果相當于2MICε-PL,可見迷迭香酸和ε-聚賴氨酸的協(xié)同效果明顯。

表2 迷迭香酸與ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌抑菌直徑的影響Table 2 Effects of rosmarinic acid and ε-polylysine on inhibition zone of Staphylococcus aureus

2.3 抑菌動力學曲線

由圖1可知,迷迭香酸和ε-聚賴氨酸在20 h內隨著時間延長對金黃色葡萄球菌的抑制作用逐漸增強,兩者最小抑菌濃度的抑菌強度相當,而1/4最小抑菌濃度的迷迭香酸和ε-聚賴氨酸的聯(lián)合使用同1/4最小抑菌濃度的迷迭香酸和1/4最小抑菌濃度的ε-聚賴氨酸各自使用抑菌效果相當,表明聯(lián)合使用抑菌劑可以降低各抑菌劑的濃度和使用量。Liu等[10]研究得出ε-聚賴氨酸和Nisin協(xié)同作用,可以大大降低這兩種抑菌劑的抑菌濃度。

圖1 抑菌動力學曲線Fig.1 Antibacterial dynamics of the antimicrobials注:抑菌劑濃度分別為:4 mg/mL RA、0.1875 mg/mLε-PL、1 mg/mL RA+0.0469 mg/mL ε-PL。

2.4 金黃色葡萄球菌胞內還原性糖含量的變化

如圖2所示,隨著處理時間的延長,在抑菌劑的作用下,金黃色葡萄球菌胞內還原糖泄漏量明顯大于對照組。在6 h的處理時間內,對照組中的還原糖基本沒有泄漏量,而處理組中的還原糖泄漏量隨著時間的增加呈現(xiàn)上升趨勢,且ε-聚賴氨酸的作用效果強于迷迭香酸,兩種抑菌成分協(xié)同作用可以增強迷迭香酸的抑菌效果。結果表明,ε-聚賴氨酸可以顯著(P<0.05)破壞金黃色葡萄球菌的細胞膜,其與迷迭香酸聯(lián)合使用也可顯著(P<0.05)促進菌體內還原糖的泄漏,隨著處理時間的增加而增加。

圖2 抑菌劑對金黃色葡萄球菌中還原性糖含量的影響Fig.2 Effects of antibiotics on the reducing sugar from Staphylococcus aureus cells注:抑菌劑濃度分別為:4 mg/mL RA、0.1875 mg/mLε-PL、1 mg/mL RA+0.0469 mg/mL ε-PL、未加抑菌劑CS。

2.5 金黃色葡萄球菌胞內可溶性蛋白泄漏的情況

如圖3所示,未添加任何抑菌劑的對照組,金黃色葡萄球菌上清液的可溶性蛋白含量隨著時間的增長基本沒有變化,而實驗組與對照組相比均導致上清液可溶性蛋白含量增加,實驗組中添加MIC迷迭香酸的導致菌可溶性蛋白泄漏量最多,其次是添加1/4MIC RA+1/4MIC ε-PL,最后是加入MIC ε-聚賴氨酸。在2～6 h隨著時間的增長,添加RA和1/4MIC RA+1/4MIC ε-PL的這兩組,可溶性蛋白逐漸增多,第8 h蛋白有少部分降解。加入ε-PL的這組在2～4 h間隔,可溶性蛋白有部分降解,而4～8 h又逐漸增多,說明這兩種抑菌成分以及兩種抑菌成分的結合能增加細菌細胞膜的通透性,導致胞內蛋白物質泄漏。蔡曉軍等[19]實驗發(fā)現(xiàn),迷迭香中的1,8-桉葉素可以破壞沙門氏菌的細胞膜,導致菌的蛋白質發(fā)生泄漏。

圖3 抑菌劑對金黃色葡萄球菌菌液中可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of antibiotics on soluble proteins from Staphylococcus aureus注:抑菌劑濃度分別為:4 mg/mL RA、0.1875 mg/mLε-PL、1 mg/mL RA+0.0469 mg/mL ε-PL、未加抑菌劑 CS；不同小寫字母表示同一處理方式不同時間數(shù)據差異顯著,P<0.05。

2.6 金黃色葡萄球菌表層蛋白的SDS-PAGE電泳分析

由圖4可知,與對照組相比在抑菌劑的作用下,金黃色葡萄球菌的表層蛋白分子表達發(fā)生了不同的變化。細菌表面膜蛋白中含有多種毒力因子,MSCRAMMs是最主要的毒力因子,其包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)中的聚集因子A(ClfA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)中的SdrG,以及其他金黃色葡萄球菌中類似膠原結合蛋白成分[25]。文華等[26]研究金黃色葡萄球菌在抑菌劑作用下,菌蛋白凝膠電泳圖譜中出現(xiàn)了幾條變化的蛋白條帶,表明抑菌劑抑制了金黃色葡萄球菌可溶性蛋白的表達。添加迷迭香酸實驗組中的金黃色葡萄球菌與對照組相比,相應的蛋白分子消失;添加ε-聚賴氨酸實驗組中的金黃色葡萄球菌與對照相比出現(xiàn)其他小分子的蛋白,這也表明了迷迭香酸和ε-聚賴氨酸能抑制金黃色葡萄球菌可溶性蛋白的表達,從而抑制了菌表面毒力因子的毒性,表明RA和ε-PL對金黃色葡萄球菌的MSCRAMMs有抑制作用。

圖4 抑菌劑對金黃色葡萄球菌表層蛋白的影響Fig.4 Effects of antibiotics on the surface layer proteins from Staphylococcus aureus注:泳道1:4 mg/mL RA、泳道2:0.1875 mg/mL ε-PL、泳道3:1 mg/mL RA+0.0469 mg/mL ε-PL、泳道4:不加抑菌劑、泳道5,6,7,8分別為前四者的上清液。

3 結論

實驗表明迷迭香酸和ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌均有抑制作用,但是迷迭香酸的最小抑菌濃度值(MIC)較高,兩種抑菌劑協(xié)同作用可以降低迷迭香酸的用量,即1 mg/mL 迷迭香酸+0.0469 mg/mL ε-聚賴氨酸的復合抑菌劑。迷迭香酸和ε-聚賴氨酸的復合對金黃色葡萄球菌的抑菌效果隨著時間的增長而增強,蛋白泄漏量和還原糖的泄漏也隨著作用時間的增長而增加,這表明兩種抑菌成分可以破壞金黃色葡萄球菌的細胞膜,促使菌胞內蛋白和還原糖的泄漏。同時其可能抑制或降低了金黃色葡萄球菌MSCRAMMs的蛋白毒性,從而對金黃色葡萄球菌有抑制作用,為以后研究這兩種抑菌成分協(xié)同抗菌作用機制提供了一定的參考依據。