肇濤瀾，張碩,2，錢文峰,2

特邀綜述

翻譯延伸的順式調(diào)控機(jī)理與生物學(xué)效應(yīng)

肇濤瀾1，張碩1,2，錢文峰1,2

1. 中國科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

翻譯延伸是核糖體將信使RNA (mRNA)蘊(yùn)含的遺傳信息解碼為蛋白質(zhì)的有序過程，是細(xì)胞維持基本代謝活動的核心步驟。多種人類疾病(如神經(jīng)退行性疾病、癌癥等)都與翻譯延伸的異常有關(guān)。翻譯延伸作為中心法則的關(guān)鍵步驟曾是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容，然而方法學(xué)上的限制卻阻礙了對其動態(tài)過程以及調(diào)控規(guī)律的進(jìn)一步研究。近年來，對翻譯延伸調(diào)控相關(guān)方法的突破讓與其相關(guān)的生命科學(xué)研究獲得了長足的發(fā)展，尤其是近10年來的研究揭示了翻譯延伸的復(fù)雜調(diào)控機(jī)理和多種生物學(xué)效應(yīng)，為理解蛋白表達(dá)調(diào)控和疾病發(fā)生的關(guān)聯(lián)提供了新的理論視角。本文在總結(jié)翻譯延伸研究方法的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)探討了順式調(diào)控元件(mRNA與新生肽鏈序列)對局部翻譯延伸速率的調(diào)控作用，同時(shí)列舉了翻譯延伸調(diào)控對模板mRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)物功能的影響，包括mRNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)的合成與降解、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)共翻譯折疊等，以期吸引生命科學(xué)各領(lǐng)域的學(xué)者共同參與翻譯延伸領(lǐng)域的研究。

翻譯延伸；核糖體；核糖體印跡測序；蛋白質(zhì)共翻譯折疊；密碼子使用偏好；RNA二級結(jié)構(gòu)；新生肽鏈

蛋白質(zhì)是生命代謝最重要的有機(jī)大分子，是細(xì)胞功能的主要執(zhí)行者。生物體內(nèi)所有的蛋白質(zhì)都是以信使RNA (mRNA)作為遺傳信息的載體通過核糖體合成的，這一過程被稱為翻譯(translation)。翻譯過程是分子生物學(xué)的重要研究對象，3位美國科學(xué)家Holley、Khorana和Nirenberg憑借對三聯(lián)體核苷酸密碼子(codon)的破譯工作于1968年獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

翻譯過程通常包括4個(gè)步驟：起始(initiation)、延伸(elongation)、終止(termination)和核糖體循環(huán)利用(recycling)。其中，翻譯起始長久以來被認(rèn)為是一條mRNA單位時(shí)間合成蛋白質(zhì)數(shù)量的主要調(diào)節(jié)因素[1]，受到翻譯起始因子、Shine-Dalgarno (SD)序列等多方面的調(diào)控。然而近年來的研究表明，翻譯延伸——核糖體從mRNA的5′端到3′端定向移動的同時(shí)將三聯(lián)體核苷酸密碼子的信息解碼為氨基酸序列的過程——同樣受到精細(xì)且嚴(yán)格的調(diào)控。翻譯延伸的異常將引發(fā)mRNA的降解、錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位和折疊以及蛋白質(zhì)的非生理性聚集[2]，進(jìn)而阻礙胚胎發(fā)育與神經(jīng)系統(tǒng)的功能維持，研究顯示這些影響與包括脆性X染色體綜合征(fragile X syndro-me)、神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative diseases)和癌癥在內(nèi)的多種人類疾病的發(fā)生有關(guān)[3]。

翻譯延伸的過程可以分解為3個(gè)過程：(1)解碼過程——在核糖體中mRNA上的三聯(lián)密碼子被特定轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (tRNA)上的反義密碼子(anticodon)所識別；(2)肽鍵合成過程——將該tRNA上攜帶的氨基酸連接到肽鏈羧基端，同時(shí)核糖體構(gòu)象發(fā)生改變；(3)移位過程——核糖體向mRNA的3′端移動一個(gè)密碼子，并恢復(fù)至延伸初始構(gòu)象[4]。具體而言，核糖體內(nèi)部有3個(gè)可容納tRNA的位點(diǎn)，從mRNA的5′端至3′端依次被稱為核糖體E (Exit)位點(diǎn)、P (Peptidyl)位點(diǎn)和A (Acceptor)位點(diǎn)。其中，A位點(diǎn)用于接納攜帶單個(gè)氨基酸的氨酰tRNA (aminoacyl-tRNA或aa-tRNA)并完成密碼子識別；P位點(diǎn)用于裝載攜帶多肽鏈的肽酰tRNA (peptidyl-tRNA)；而脫?；蟮膖RNA (deacylated tRNA)則通過E位點(diǎn)被核糖體釋放。翻譯延伸需要延伸因子(elongation factor，EF)的輔助。結(jié)合有高能分子GTP的延伸因子eEF-1 (真核生物)、aEF-1 (古細(xì)菌)或EF-TU (真細(xì)菌)攜帶氨酰tRNA進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn)；如果該氨酰tRNA的反義密碼子可以與A位點(diǎn)處mRNA的密碼子配對識別，則引發(fā)GTP水解，促使EF-1/EF-TU離開核糖體A位點(diǎn)；GTP水解提供的能量引起核糖體發(fā)生構(gòu)象變化，使位于A位點(diǎn)的氨酰tRNA的3′端與位于P位點(diǎn)的肽?；鵷RNA緊密接觸；當(dāng)兩個(gè)tRNA同時(shí)完成A-P位點(diǎn)轉(zhuǎn)移(A位點(diǎn)的tRNA部分移動到P位點(diǎn))和P-E位點(diǎn)轉(zhuǎn)移后，肽鍵合成發(fā)生，此時(shí)由剛移動到P位點(diǎn)的tRNA攜帶多肽鏈，并且在羧基端增加了一個(gè)氨基酸，而剛移動到E位點(diǎn)的tRNA則成為脫氨酰tRNA；接下來，另一個(gè)延伸因子eEF-2 (真核生物)、aEF-2 (古細(xì)菌)或EF-G (真細(xì)菌)進(jìn)入A位點(diǎn)，并通過水解其攜帶的GTP分子將核糖體恢復(fù)至延伸初始構(gòu)象(圖1)。在上述過程的不斷重復(fù)中，多肽鏈持續(xù)延伸，直到mRNA上的終止密碼子進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn)為止。

雖然翻譯延伸過程是上述核心步驟的循環(huán)往復(fù)，且在真核和原核生物間高度保守，但眾多研究結(jié)果表明mRNA不同區(qū)域的解碼速度并不恒定，在翻譯過程中會存在核糖體在mRNA特定位置的短期暫停(pause)甚至中止(stall)等事件，暗示著翻譯延伸過程受到了嚴(yán)格的調(diào)控[5]。本文將主要從研究方法、順式調(diào)控機(jī)理和生物學(xué)效應(yīng)3個(gè)角度介紹翻譯延伸領(lǐng)域的主要研究進(jìn)展。

圖1 翻譯延伸過程示意圖

第一步：解碼過程。結(jié)合高能分子GTP的翻譯延伸因子EF-1(EF-TU)攜帶氨酰tRNA (aa-tRNA)進(jìn)入核糖體A位點(diǎn)進(jìn)行密碼子配對，E位點(diǎn)的脫氨酰tRNA離開核糖體。第二步：肽鍵合成過程。GTP水解引發(fā)核糖體的構(gòu)象變化，使其內(nèi)部兩個(gè)tRNA緊密接觸，肽鍵合成發(fā)生。第三步：移位過程。核糖體向mRNA的3′端移動一個(gè)密碼子，并通過水解翻譯延伸因子EF-2(EF-G)所攜帶的GTP分子提供能量，使核糖體恢復(fù)至初始構(gòu)象。圖制于Biorender.com。

1 翻譯延伸的研究方法

1.1 核糖體結(jié)構(gòu)解析

核糖體結(jié)構(gòu)的解析是研究翻譯過程的重要手段，主要包括X射線晶體解析法(X-ray crystallography)、核磁共振波譜測定法(nuclear magnetic resonance [NMR] spectroscopy)以及冷凍電鏡技術(shù)(cryogenic electron microscopy, cryo-EM) 3大類。X射線晶體解析法獲得的核糖體結(jié)構(gòu)分辨率最高(2.0~3.5?)[6]，并且常常用于翻譯延伸相關(guān)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析[7,8]。2009年，美國科學(xué)家Ramakrishnan、Steitz和以色列科學(xué)家Yonath以X射線晶體解析法為基礎(chǔ)的核糖體結(jié)構(gòu)研究獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。X射線晶體解析法需要首先對核糖體進(jìn)行結(jié)晶。然而，核糖體是大量蛋白質(zhì)與多條RNA組成的大分子復(fù)合物，且在翻譯延伸過程中存在一些能量不穩(wěn)定的中間態(tài)構(gòu)象，這些因素使得核糖體很難形成結(jié)晶。即使成功結(jié)晶，也會破壞構(gòu)象的異質(zhì)性。上述問題阻礙了生理狀態(tài)下對核糖體結(jié)構(gòu)的全面與快速解析。核磁共振波譜測定法也可對核糖體結(jié)構(gòu)域[9]或者新生肽鏈的結(jié)構(gòu)動力學(xué)[10]進(jìn)行測定。盡管Nygaard等[11]通過固態(tài)NMR方法解析了大腸桿菌()完整核糖體的化學(xué)組成和分子間相互作用，但在大多數(shù)情況下NMR測定對象的大小局限于500 kDa范圍內(nèi)，不足以解析完整的原核核糖體(2000 kDa)或真核核糖體(3200 kDa)結(jié)構(gòu)。最近10年來，伴隨技術(shù)的突破，冷凍電鏡對核糖體結(jié)構(gòu)的分辨率已經(jīng)可以與X射線晶體解析法相媲美[12,13](圖2A)。冷凍電鏡技術(shù)無需結(jié)晶，核糖體可保持其生理狀態(tài)下的異質(zhì)性特征與翻譯延伸過程的中間狀態(tài)，因此，在研究核糖體及其與翻譯延伸因子等形成的大型復(fù)合物的結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)揮了越來越重要的作用[14~17]。

1.2 生化動力學(xué)研究法

翻譯延伸速率(特別是肽鍵形成的速率)可以通過生化動力學(xué)方法研究。這通常需要人工配制的體外翻譯體系，該體系包含翻譯過程所需的所有組分，并且可以通過放射性同位素或熒光對新生蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記和濃度測定。通過檢測多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)合成量，可以繪制模型曲線，進(jìn)而推算翻譯延伸速率[18,19]。例如，Wohlgemuth等[20]為了研究不同氨基酸提供羧基時(shí)形成肽鍵的速率，在翻譯體系中加入了嘌呤霉素(puromycin)(圖2B)。嘌呤霉素可以作為氨酰tRNA類似物進(jìn)入核糖體A位點(diǎn)與位于P位點(diǎn)的肽鏈發(fā)生類似肽鍵形成的生化反應(yīng)，在反應(yīng)結(jié)束后終止翻譯延伸并釋放翻譯產(chǎn)物。該研究在嘌呤霉素濃度飽和時(shí)測定特定氨基酸與嘌呤霉素形成肽鍵的速率常數(shù)，發(fā)現(xiàn)氨基酸在提供羧基時(shí)的肽鍵形成速率不盡相同：(賴氨酸 = 精氨酸) > 丙氨酸 > 絲氨酸 > (苯丙氨酸 = 纈氨酸) > 天冬氨酸 >> 脯氨酸。

1.3 報(bào)告基因檢測法

使用人工構(gòu)建的報(bào)告基因載體，將待檢測序列插入報(bào)告基因特定位置，則可以通過分析報(bào)告基因的表達(dá)水平估算插入序列對于翻譯延伸的影響。例如，Chu等[21]采用熒光素酶(luciferase)報(bào)告系統(tǒng)，將待檢測的序列插入到螢火蟲熒光素酶(firefly-luciferase)的起始密碼子下游，并將位于同一載體上且具有獨(dú)立啟動子的海腎熒光素酶(renilla-luciferase)作為內(nèi)參，通過比較兩種熒光信號的強(qiáng)度推測該待檢測序列對翻譯延伸速率的影響。

伴隨著單分子熒光技術(shù)的發(fā)展，在活細(xì)胞中觀察單條mRNA翻譯動態(tài)的方法日趨成熟[22]。單分子翻譯檢測技術(shù)可將人為設(shè)計(jì)的報(bào)告mRNA錨定在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上，并采用不同的熒光分子分別標(biāo)記mRNA和新生肽鏈，在較長的時(shí)間范圍內(nèi)持續(xù)記錄翻譯延伸的進(jìn)程[23~25]。例如，Yan等[23]通過抑制劑阻斷翻譯起始，并統(tǒng)計(jì)單位時(shí)間內(nèi)從mRNA上釋放的帶有熒光標(biāo)記的核糖體的數(shù)目，該數(shù)目越大則意味著翻譯延伸越快。針對mRNA序列進(jìn)行修改，則可以進(jìn)一步探究翻譯延伸速率的順式調(diào)控因素(圖2C)。該方法目前的局限性在于只適用于對單一基因翻譯過程的逐個(gè)研究，尚無法推廣到高通量研究之中。

圖2 翻譯延伸的研究方法

A：釀酒酵母80S核糖體冷凍電鏡解析模型(http://www.rcsb.org/structure/6SNT)。B：肽鍵形成生化動力曲線示意圖。fMet：甲酰甲硫氨酸，Puromycin：嘌呤霉素，X：待檢測氨基酸。C：單分子mRNA動態(tài)翻譯檢測示意圖。D：ribo-seq與disome-seq實(shí)驗(yàn)流程示意圖。圖制于Biorender.com。

1.4 核糖體印跡測序(ribo-seq)法

在全基因組范圍研究翻譯調(diào)控可以通過ribo-seq實(shí)現(xiàn)。早在20世紀(jì)60年代，Steitz[26]就研發(fā)出通過密度梯度離心按照核糖體結(jié)合數(shù)目分離核糖體-mRNA復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)技術(shù)(polysome profiling)，用于檢測mRNA的翻譯狀態(tài)。伴隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，polysome profiling技術(shù)與大規(guī)模測序技術(shù)的有力結(jié)合誕生出了ribo-seq技術(shù)。此技術(shù)采用RNA酶處理核糖體與mRNA的復(fù)合物，將因被核糖體保護(hù)而無法被RNA酶降解的mRNA片段用于高通量測序的文庫構(gòu)建和序列信息讀取(圖2D)。該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對某一時(shí)刻細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄本上核糖體的位置信息與狀態(tài)信息的高通量捕獲，并可達(dá)到單堿基的分辨率[27]，因此，在內(nèi)源基因翻譯延伸調(diào)控的研究領(lǐng)域具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。除ribo-seq技術(shù)外，Pelechano等[28]建立的5PSeq技術(shù)也可以在單堿基分辨率下高通量捕獲核糖體的位置信息。這一技術(shù)的開發(fā)基于mRNA共翻譯降解的原理——mRNA在5?脫帽后由5?外切酶自5?端至3?端逐個(gè)堿基降解，由于外切速率大于翻譯延伸速率，5?外切酶緊跟正在進(jìn)行最后一輪翻譯的核糖體行使其降解功能。因此，對無帽mRNA的5?端堿基進(jìn)行測序即可獲得這些核糖體的位置信息。上述高通量技術(shù)已成為測定翻譯延伸速率和檢測翻譯延伸遲滯事件的重要手段[29,30]。

如果一個(gè)基因內(nèi)部的翻譯延伸速率無差異，則核糖體應(yīng)該大致均勻分布于轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)的各個(gè)區(qū)域。反之，如果檢測到核糖體在某段編碼區(qū)上嚴(yán)重堆積，則提示該區(qū)段存在翻譯延伸的遲滯。根據(jù)這一原理，通過ribo-seq實(shí)驗(yàn)以及后續(xù)數(shù)據(jù)分析可以推斷核糖體停滯的位置[31]。進(jìn)一步的工作針對ribo- seq數(shù)據(jù)創(chuàng)立了算法，可以系統(tǒng)性地檢測翻譯延伸遲滯的順式調(diào)控因素，并將其應(yīng)用于估算61個(gè)編碼氨基酸的密碼子各自的解碼時(shí)間[32]。

需要特別注意的是，為了防止在樣品制備過程中核糖體在mRNA上的進(jìn)一步延伸，往往需要在核糖體提取的試劑中加入翻譯延伸抑制劑——放線菌酮(cycloheximide)。早期釀酒酵母()的ribo-seq實(shí)驗(yàn)通常還包含細(xì)胞與放線菌酮在室溫下共孵育的步驟[27]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，室溫下的放線菌酮處理并不能完全阻止翻譯延伸過程，而且會對不同密碼子產(chǎn)生不同的抑制作用，從而影響延伸速率的測量[33,34]。因此，在使用ribo-seq研究翻譯延伸遲滯事件時(shí)應(yīng)盡量避免細(xì)胞與放線菌酮在室溫下的共孵育。

當(dāng)一個(gè)核糖體發(fā)生翻譯延伸遲滯時(shí)，如果其上游正常延伸的核糖體距離不遠(yuǎn)，則可能與其發(fā)生碰撞(ribosome collision)并在mRNA上形成串聯(lián)的雙核糖體結(jié)構(gòu)。因此，該結(jié)構(gòu)可以更為特異地反映翻譯延伸遲滯事件的發(fā)生?；谶@一想法，一些研究工作通過改造ribo-seq實(shí)驗(yàn)體系，建立了串聯(lián)雙核糖體(disome)的檢測技術(shù)disome-seq (圖2D)，并成功地在細(xì)胞內(nèi)捕獲到了翻譯延伸遲滯的信號。例如在缺失亮氨酸和絲氨酸的培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌內(nèi)，可在編碼亮氨酸與絲氨酸的密碼子處觀察到大量串聯(lián)雙核糖體的富集[35]。同樣，當(dāng)釀酒酵母的組氨酸合成被抑制時(shí)，可在編碼組氨酸的密碼子處觀察到串聯(lián)雙核糖體信號[36]。

ribo-seq可以用于研究同一基因不同區(qū)域的翻譯延伸速率，然而這一方法在研究不同基因的翻譯延伸速率時(shí)會失效。其原因是，不同基因上核糖體的分布除了由其延伸速率決定，也受到翻譯起始速率的影響。特別值得注意的是，在計(jì)算中通常使用的對mRNA水平的均一化并不能解決這個(gè)問題。從ribo-seq數(shù)據(jù)中拆分翻譯起始速率和延伸速率在計(jì)算上仍然存在一定困難，因此僅有少量研究工作通過實(shí)驗(yàn)方法系統(tǒng)地比較了不同基因的翻譯延伸速率。例如，Ingolia等[31]在小鼠()的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中添加了翻譯起始抑制劑用以阻斷核糖體在mRNA上的持續(xù)起始，在之后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行ribo-seq分析，進(jìn)而通過測定核糖體單位時(shí)間內(nèi)從mRNA上的釋放數(shù)目來估算翻譯延伸速率。此外，將ribo-seq與蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析可估算翻譯起始速率，進(jìn)而間接推算翻譯延伸速率[37]。

2 翻譯延伸的調(diào)控機(jī)理

順式和反式因子均對翻譯延伸有重要的調(diào)控作用。由于反式因子如翻譯延伸因子[38~40]、small RNA[41,42]等對翻譯延伸的調(diào)控作用已有較詳細(xì)的總結(jié)和討論，下文主要從順式元件角度出發(fā)，著重介紹mRNA與氨基酸序列對翻譯延伸速率的調(diào)控機(jī)理。

2.1 mRNA序列對翻譯延伸的調(diào)控作用

2.1.1 同義密碼子使用對翻譯延伸的調(diào)控作用

在大多數(shù)生物中，20種氨基酸由61種密碼子編碼。其中，18種氨基酸由不止一種密碼子編碼。人們將編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼子(synonymous codon)。研究發(fā)現(xiàn)，不同物種之間、同一個(gè)物種的不同基因之間以及同一個(gè)基因的不同區(qū)域之間，同義密碼子使用頻率均存在差異[43~46]。一個(gè)基因組內(nèi)部基因之間同義密碼子差異使用的現(xiàn)象被稱為密碼子使用偏好性(codon usage bias)[46,47]。高表達(dá)基因傾向于使用的同義密碼子被稱為偏好密碼子(preferred codon)，其他的被稱為稀有密碼子(rare codon)。

密碼子的使用偏好參與了翻譯調(diào)控。一些學(xué)者認(rèn)為偏好密碼子具有更高的解碼準(zhǔn)確性[48,49]。而以Ikemura為代表的另一派學(xué)者則認(rèn)為偏好密碼子具有更高的翻譯延伸速率(圖3A)，因此獲得更高的核糖體使用效率[44,50,51]。該“效率”假說指出，在細(xì)胞中偏好密碼子通常對應(yīng)含量充足的同工tRNA (cognate tRNA)，而識別稀有密碼子的同工tRNA則拷貝數(shù)較低且含量稀少[3,52]。當(dāng)稀有密碼子出現(xiàn)在核糖體A位點(diǎn)時(shí)，由于其對應(yīng)的氨酰tRNA在細(xì)胞內(nèi)濃度低，核糖體需要花費(fèi)更長的時(shí)間才能完成tRNA的識別與裝載。因此，稀有密碼子具有更低的翻譯延伸速率[53]。

Curran和Yarus[54]巧妙地通過和的非同框融合基因報(bào)告系統(tǒng)檢測了29個(gè)YNN (N代表A、C、G、T四個(gè)堿基之一，Y代表C或T)密碼子的識別效率。的基因內(nèi)部存在滑動序列(slippery sequence)，可以促進(jìn)核糖體以一定概率在特定位點(diǎn)發(fā)生單堿基移位讀碼。Curran和Yarus將該滑動序列(23個(gè)堿基)下游連接YNN密碼子，并整體插入基因的上游。只有當(dāng)在該滑動序列上發(fā)生向3′端的單堿基核糖體移碼時(shí)，基因才能在正確的開放閱讀框中翻譯。兩位作者假定核糖體的移位讀碼在單位時(shí)間內(nèi)以一定的概率發(fā)生，且與正常的翻譯延伸構(gòu)成競爭。因此，若密碼子YNN被快速識別，則移位讀碼不會發(fā)生，報(bào)告基因無法產(chǎn)生功能蛋白；當(dāng)密碼子YNN識別較慢時(shí)，則發(fā)生核糖體移碼的概率上升，從而合成出正確的lacZ蛋白。他們發(fā)現(xiàn)偏好密碼子的識別速率顯著快于稀有密碼子，且密碼子之間的識別速率差異可高達(dá)25倍。S?rensen等[55]也發(fā)現(xiàn)在lacZ基因內(nèi)插入偏好密碼子檢測到的翻譯延伸效率比插入稀有密碼子的版本快6倍。需要注意的是，上述研究均使用了少數(shù)報(bào)告基因，因此統(tǒng)計(jì)學(xué)上無法完全排除mRNA二級結(jié)構(gòu)、堿基GC含量以及特定基序等干擾因素。通過對ribo-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析則可以從海量內(nèi)源基因中歸納密碼子使用偏好對翻譯延伸的調(diào)控作用。Qian等[32]開創(chuàng)了依據(jù)ribo-seq數(shù)據(jù)演算每個(gè)密碼子翻譯延伸速率的先河，發(fā)現(xiàn)了同義密碼子與同工tRNA的平衡使用可以避免核糖體的閑置并促進(jìn)細(xì)胞整體的蛋白質(zhì)合成效率。在認(rèn)識到放線菌酮共孵育所帶來的影響后，采用速凍法(flash frozen)產(chǎn)生的ribo-seq數(shù)據(jù)定性地支持了前人報(bào)告基因的研究結(jié)果——即偏好密碼子的使用可提高翻譯延伸速率。然而，同義突變對翻譯延伸速率的影響在數(shù)值上仍然存在分歧意見[33,34,56]。

圖3 翻譯延伸的調(diào)控機(jī)理與生物學(xué)效應(yīng)

A：同義密碼子使用對翻譯延伸的調(diào)控作用。當(dāng)位于核糖體A site的是稀有密碼子(黃色線段)時(shí)，由于其對應(yīng)的同工tRNA濃度較低，因此在該區(qū)域翻譯延伸速率變慢(紅色線段)。B：mRNA二級結(jié)構(gòu)對翻譯延伸的調(diào)控。位于編碼區(qū)的mRNA二級結(jié)構(gòu)抑制翻譯延伸。C：肽鍵合成速率對翻譯延伸的調(diào)控。氨基酸可以通過與PTC的相互作用影響肽鍵合成速率。D：新生肽鏈序列對翻譯延伸的調(diào)控。新生肽鏈序列可通過與核糖體肽鏈輸出通道相互作用調(diào)控翻譯延伸速率。E：核糖體關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制(RQC)。由于翻譯延伸中止導(dǎo)致的串聯(lián)雙核糖體可被E3連接酶識別并進(jìn)行泛素化修飾，從而引發(fā)核糖體大小亞基解離和RQC過程。在RQC過程中，已解離的核糖體大亞基中的新生肽鏈在E3連接酶Ltn1和Rqc1蛋白的協(xié)同作用下被泛素化修飾。F：非行進(jìn)性降解(NGD)。內(nèi)切酶切割串聯(lián)雙核糖體結(jié)合處的mRNA序列，殘余的mRNA片段則被降解。G：調(diào)控蛋白質(zhì)合成速率。翻譯延伸的調(diào)控(如同義密碼子的使用)對蛋白質(zhì)合成速率具有重要影響。H：調(diào)控mRNA穩(wěn)定性。含有稀有密碼子的mRNA傾向于具有更低的穩(wěn)定性。I：調(diào)控蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。分泌蛋白氨基端的信號序列(藍(lán)色線段)被翻譯完成后的翻譯暫停會促進(jìn)其與信號肽識別因子的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)正確的亞細(xì)胞定位。J：調(diào)控蛋白質(zhì)共翻譯折疊。同義密碼子的使用和mRNA二級結(jié)構(gòu)可通過影響翻譯延伸速率調(diào)控蛋白質(zhì)折疊。另外，核糖體關(guān)聯(lián)分子伴侶與新生肽鏈的結(jié)合也可以輔助蛋白質(zhì)的共翻譯折疊。圖制于Biorender.com。

2.1.2 mRNA二級結(jié)構(gòu)對翻譯延伸的調(diào)控作用

RNA二級結(jié)構(gòu)是指RNA分子通過堿基互補(bǔ)配對而形成的莖環(huán)(stem loop)或假結(jié)(pseudoknot)等結(jié)構(gòu)。位于mRNA 5′-UTR區(qū)的二級結(jié)構(gòu)可以阻礙核糖體小亞基對起始密碼子的掃描，而位于3′-UTR區(qū)的二級結(jié)構(gòu)則可能削弱小RNA介導(dǎo)的翻譯抑制[57,58]。由于翻譯延伸過程消耗GTP中高能磷酸鍵的能量，部分學(xué)者認(rèn)為核糖體及其結(jié)合蛋白可以有效打開位于編碼區(qū)的mRNA二級結(jié)構(gòu)[59]。

然而，一些報(bào)道又顯示位于編碼區(qū)的mRNA二級結(jié)構(gòu)可能具有翻譯延伸抑制效應(yīng)(圖3B)。例如，釀酒酵母基因編碼調(diào)控交配型轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)錄因子，該蛋白質(zhì)在出芽繁殖時(shí)主要定位于子細(xì)胞而非母細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)的極性定位是通過編碼區(qū)的mRNA二級結(jié)構(gòu)抑制該基因位于母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本的翻譯實(shí)現(xiàn)的[60]。另外，單分子光鑷技術(shù)檢測單核糖體在mRNA上移動速率的結(jié)果也顯示，穩(wěn)定的mRNA二級結(jié)構(gòu)可以導(dǎo)致核糖體的延伸暫停[61]?；趓ibo-seq的高通量數(shù)據(jù)分析結(jié)果則顯示，位于核糖體入口處的mRNA二級結(jié)構(gòu)對延伸速率的影響最為明顯[37]；且高表達(dá)基因傾向于具有更高的mRNA二級結(jié)構(gòu)，可以通過降低翻譯延伸速率的方式確保翻譯的準(zhǔn)確性[37]。還有研究指出，mRNA二級結(jié)構(gòu)傾向存在于編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)(protein domain junction)或無序區(qū)(disordered region)[62~64]。由此Tang等[63]提出假說，當(dāng)核糖體行進(jìn)至這些區(qū)域時(shí)，其延伸速率會被mRNA二級結(jié)構(gòu)下調(diào)，確保新生肽鏈有充分的時(shí)間實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的正確折疊。

在病毒中，mRNA二級結(jié)構(gòu)常常與滑動序列成對出現(xiàn)。當(dāng)核糖體的延伸被mRNA莖環(huán)或假結(jié)等二級結(jié)構(gòu)阻攔后會滯留在上游緊鄰的滑動序列區(qū)，并因此有一定概率在此區(qū)域發(fā)生核糖體的移位讀碼，進(jìn)而將新的讀碼框延伸到下游序列[65]。這種發(fā)生在固定位置的核糖體移位讀碼是程序性的，借此，病毒可使用有限的基因組編碼更多種類的蛋白質(zhì)[66]。導(dǎo)致新冠肺炎(COVID-19)疫情的新冠病毒(SARS- CoV-2)，在其第一個(gè)開放閱讀框()中就存在一個(gè)程序性核糖體移位讀碼位點(diǎn)[67]，以此維持該基因編碼的pp1a和pp1b兩段多肽的劑量平衡。此外，也有報(bào)道顯示在原核與真核生物的基因組中存在程序性核糖體移位讀碼事件[38,68]。上述發(fā)現(xiàn)從另一角度表明了一些mRNA二級結(jié)構(gòu)對翻譯延伸的抑制作用。

但也有研究結(jié)果指出大多數(shù)mRNA二級結(jié)構(gòu)對翻譯延伸的影響力可能較弱。例如，大腸桿菌的體內(nèi)mRNA二級結(jié)構(gòu)譜圖分析顯示，mRNA二級結(jié)構(gòu)對翻譯的調(diào)控作用似乎僅局限于翻譯起始過程，對翻譯延伸效率幾乎沒有影響[69]。對熱激處理水稻()的mRNA二級結(jié)構(gòu)與ribo-seq譜圖的比較分析結(jié)果也表明，mRNA二級結(jié)構(gòu)的改變與熱誘導(dǎo)的翻譯水平變化無顯著相關(guān)性[70]。Beaudoin等[58]甚至提出了“因果互換”的新假說：翻譯過程中的核糖體塑造了mRNA的二級結(jié)構(gòu)，而非mRNA二級結(jié)構(gòu)指導(dǎo)了核糖體的翻譯延伸。上述各類研究結(jié)果的矛盾之處使得mRNA二級結(jié)構(gòu)在翻譯延伸過程中的調(diào)控功能顯得撲朔迷離，其相關(guān)機(jī)理亟待進(jìn)一步的分析與挖掘。

2.2 氨基酸序列對翻譯延伸的調(diào)控作用

除mRNA序列外，氨基酸序列——位于核糖體A位點(diǎn)和P位點(diǎn)的氨基酸之間的肽鍵形成以及位于核糖體肽鏈輸出通道(exit tunnel)內(nèi)的新生肽鏈序列——也是調(diào)控翻譯延伸速率的重要因素。

由于氨基酸側(cè)鏈的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)存在差異，其形成肽鍵的速率各不相同(圖3C)。脯氨酸是20種生物體主要氨基酸中最為特殊的一種，其氨基(-NH2)與側(cè)鏈成環(huán)后僅存余亞氨基(-NH-)結(jié)構(gòu)，因此準(zhǔn)確地說是亞氨基酸。這使得其在位于核糖體A位點(diǎn)處時(shí)成為肽鍵形成的弱受體[20,71,72]。近期，A位點(diǎn)含有脯氨酰-tRNA類似物的核糖體結(jié)構(gòu)進(jìn)一步顯示，脯氨酸作為底物在肽基轉(zhuǎn)移酶中心(peptidyl transferase center, PTC)內(nèi)處于不利的空間位置[73]。此外，不利的空間位置也使得位于核糖體P位點(diǎn)處的脯氨酸成為肽鍵形成的弱供體[74]。由于脯氨酸既是肽鍵形成的弱供體也是弱受體，當(dāng)其串聯(lián)出現(xiàn)時(shí)，對翻譯延伸的抑制作用尤為明顯[74~79]。

除脯氨酸外，另一個(gè)推測可以降低肽鍵形成速率的氨基酸是甘氨酸[80]。大腸桿菌的ribo-seq結(jié)果顯示富含甘氨酸的三肽在三肽組合中具有最強(qiáng)的翻譯延伸抑制作用[77]。此外，對小鼠ribo-seq數(shù)據(jù)的分析也發(fā)現(xiàn)，在核糖體P位點(diǎn)富集的氨基酸中，甘氨酸緊隨脯氨酸之后位列第二，暗示了其對翻譯延伸的抑制作用[31]。

2.2.2 新生肽鏈序列對翻譯延伸的調(diào)控作用

阻礙肽鍵形成的氨基酸通過與核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心區(qū)域的相互作用來抑制翻譯延伸，而某些新生肽鏈序列則可以通過與核糖體肽鏈輸出通道的相互作用降低翻譯延伸速率(圖3D)[81,82]。

肽鏈輸出通道是核糖體內(nèi)部緊鄰P位點(diǎn)的一段狹長的管道結(jié)構(gòu)，此管道不同位置的內(nèi)徑并不一致。其中內(nèi)徑最小的區(qū)段被稱作狹窄段(constriction site)，研究者認(rèn)為其可通過阻礙特定新生肽鏈的通過而抑制翻譯延伸。例如在一個(gè)被廣泛研究的細(xì)菌案例中，SecM蛋白包含一段長度為17個(gè)氨基酸的F150XXX-XWIXXXXGIRAGP166(X代表可變的氨基酸)序列[83]。此序列作為新生肽鏈通過核糖體的肽鏈輸出通道會導(dǎo)致核糖體的暫停，此時(shí)G165占據(jù)在P位點(diǎn)的位置[84]。此暫?？梢l(fā)mRNA二級結(jié)構(gòu)的調(diào)整，其下游基因本來位于莖環(huán)內(nèi)的翻譯起始位點(diǎn)因此暴露出來，從而促進(jìn)SecA蛋白的合成[82]。在之后的研究中，越來越多的細(xì)菌多肽序列被發(fā)現(xiàn)對翻譯延伸具有抑制作用。例如，通過遺傳篩選的方法，F(xiàn)XXYXIWPP等肽段被鑒定為翻譯延伸的抑制信號[77,85]；通過生物信息學(xué)分析，一系列在蛋白質(zhì)組中低頻出現(xiàn)的短肽段也被發(fā)現(xiàn)具有抑制翻譯延伸的作用[86]。

也有觀點(diǎn)認(rèn)為核糖體的肽鏈輸出通道是通過電勢作用來調(diào)控翻譯延伸的。有報(bào)道顯示，肽鏈輸出通道內(nèi)壁的靜電勢為負(fù)值[87]，當(dāng)富含正電荷氨基酸(例如精氨酸和賴氨酸)的新生肽鏈通過帶負(fù)電的肽鏈輸出通道時(shí)，因電荷的異性相吸作用，抑制了核糖體的延伸[88]。例如，基于分子卷尺(molecular tape measure)的體外實(shí)驗(yàn)表明，含連續(xù)精氨酸或賴氨酸的肽鏈在完全通過肽鏈輸出通道之前會引發(fā)核糖體暫停[88]。大腸桿菌和釀酒酵母的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，在熒光素酶報(bào)告基因的5′編碼區(qū)插入連續(xù)的賴氨酸密碼子(AAG或AAA)可顯著下調(diào)報(bào)告基因的蛋白質(zhì)合成效率[89]。在基因組水平上，Charneski和Hurst[90]對釀酒酵母ribo-seq數(shù)據(jù)的分析顯示，新生肽鏈中的正電荷氨基酸是核糖體翻譯延伸速率的主要抑制因素；且他們發(fā)現(xiàn)正電荷氨基酸對翻譯延伸的抑制作用具有累加效應(yīng)，即正電荷氨基酸密度越高則核糖體停滯現(xiàn)象越明顯。然而，也有實(shí)驗(yàn)室對該結(jié)果提出了不同的看法。Artieri和Fraser[91]指出，Charneski和Hurst的報(bào)道可能是數(shù)據(jù)的低覆蓋度導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。Sabi和Tuller[92]對9個(gè)物種的ribo-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了聯(lián)合分析，卻僅在3個(gè)物種中檢測到了正電荷氨基酸對翻譯延伸的抑制作用，而他們還在5個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)負(fù)電荷氨基酸也可抑制翻譯延伸。因此，肽鏈輸出通道中新生肽鏈?zhǔn)欠窨赏ㄟ^電荷相互作用調(diào)控翻譯延伸尚存在爭議，相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步的分析與探討。

3 翻譯延伸的生物學(xué)效應(yīng)

諸多情況都可能導(dǎo)致核糖體無法繼續(xù)行進(jìn)，例如細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)下，在轉(zhuǎn)錄加工錯(cuò)誤或化學(xué)損傷的mRNA上，或當(dāng)翻譯終止錯(cuò)誤造成核糖體行進(jìn)至3′-UTR甚至poly(A)尾時(shí)。此時(shí)，滯留的核糖體將激活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)，降解模板mRNA和翻譯中間產(chǎn)物[93]。然而，相對于這些不可逆的翻譯延伸中止事件，細(xì)胞內(nèi)更普遍存在的可能是那些核糖體可以恢復(fù)行進(jìn)的翻譯延伸暫停事件。這些翻譯暫停事件通常被認(rèn)為是程序性的且具有生物適應(yīng)性意義[5]，參與調(diào)控多種分子生物學(xué)過程，如蛋白質(zhì)表達(dá)水平、mRNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)折疊[3,94]。

隨著焊接次數(shù)的增加，螺柱卡頭十字槽與焊槍之間的同軸度不斷增大，導(dǎo)致螺柱與焊槍(支撐套筒)之間形成斜角；焊槍與工件之間主要通過三角支撐套筒保證，由于人工手動操作焊槍，支撐套筒與工件無法保證每次都是三點(diǎn)接觸，尤其是在施焊的瞬間，一致性無法保證。

3.1 翻譯延伸中止的生物學(xué)效應(yīng)

當(dāng)核糖體翻譯延伸中止時(shí)，細(xì)胞會啟動核糖體關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制(ribosome-associated protein quality control, RQC)，通過特定調(diào)控通路降解潛在有害的新生肽鏈；并同時(shí)啟動非行進(jìn)性降解(no-go decay, NGD)，特異性地降解發(fā)生翻譯延伸中止的mRNA[93]。

3.1.1 核糖體關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制RQC

延伸中止的核糖體可能會與位于其同一mRNA上游的核糖體發(fā)生“碰撞”或“追尾”，形成串聯(lián)雙核糖體結(jié)構(gòu)。近期的研究結(jié)果表明，串聯(lián)雙核糖體可能是引發(fā)RQC的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元(圖3E)。冷凍電鏡結(jié)果顯示，組成串聯(lián)雙核糖體的兩個(gè)核糖體40S小亞基之間緊密接觸，為E3泛素連接酶Hel2提供了良好的底物識別平臺。在釀酒酵母中，Hel2蛋白可在核糖體40S小亞基上添加賴氨酸連接的多聚泛素化修飾[95,96]。泛素化修飾的核糖體可被RQC觸發(fā)復(fù)合體(RQC-triggering complex)識別，并導(dǎo)致大小亞基的解離與RQC過程[95,97]。在RQC過程中，殘留于核糖體60S大亞基中的新生肽鏈在E3泛素連接酶Ltn1和Rqc1蛋白的協(xié)同作用下被泛素化修飾(圖3E)[97]。同時(shí)，Rqc2蛋白會在該多肽鏈的羧基端添加多聚丙氨酰和三酰殘基尾(CAT-tailing)[98]。最終泛素化的多肽鏈被Vms1從核糖體大亞基中釋放[99,100]，并由Cdc48蛋白攜帶進(jìn)入蛋白酶體(protea-some)降解[97,101,102]。

3.1.2 非行進(jìn)性降解NGD

串聯(lián)雙核糖體在引發(fā)RQC的同時(shí)還會引發(fā)NGD。在NGD過程中，被泛素化修飾的核糖體40S小亞基可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)某尚未報(bào)道的內(nèi)切酶在串聯(lián)雙核糖體結(jié)合的mRNA序列附近進(jìn)行切割(圖 3F)[103]。之后，位于切割斷點(diǎn)5′一側(cè)的核糖體將被Dom34- Hbs1蛋白質(zhì)復(fù)合體釋放[104~106]，殘余的5′-NGD mRNA片段則被Ski復(fù)合體和外切酶體(exosome)降解；而位于切割斷點(diǎn)3′一側(cè)的停滯核糖體可能被釋放，也可能重新啟動完成完整的翻譯過程。之后，殘余的3′-NGD mRNA片段由Xrn1外切酶降解[5]。

值得注意的是，迄今為止被觀察到的NGD和RQC事件大部分來自于含有人為設(shè)計(jì)的翻譯延伸中止序列的報(bào)告系統(tǒng)或處于惡劣環(huán)境條件下的細(xì)胞中。例如，Doma等[103]在釀酒酵母中首次發(fā)現(xiàn)NGD途徑時(shí)使用的是含有穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的PGK1-SL報(bào)告載體。此后，含有串聯(lián)多聚腺苷酸[107~109]、串聯(lián)精氨酸稀有密碼子CGA[110]、多聚正電氨基酸[97]以及被氧化的mRNA[111]等可嚴(yán)重阻礙翻譯延伸的特定序列也被廣泛應(yīng)用于人工報(bào)告系統(tǒng)研究NGD和RQC。此外，在氨基酸饑餓[36]、tRNA缺乏[112]和氧化脅 迫[111]等條件下也可檢測到NGD或RQC現(xiàn)象。在正常生長條件下的細(xì)胞內(nèi)源基因上檢測到的NGD或RQC事件較為少見。造成這一結(jié)果的原因可能是：在正常生長的細(xì)胞中，發(fā)生翻譯延伸中止的mRNA比例較低，且其蛋白質(zhì)中間產(chǎn)物和mRNA又會被NGD和RQC途徑迅速識別降解，以目前檢測手段的靈敏度尚無法及時(shí)捕獲這些中間產(chǎn)物。通過實(shí)驗(yàn)方法鑒定在正常生長條件下NGD或RQC的目標(biāo)內(nèi)源基因，需要人為提高細(xì)胞內(nèi)發(fā)生翻譯延伸中止但尚未完全被NGD途徑降解的mRNA比例。敲除或者敲降這兩條調(diào)控通路關(guān)鍵的調(diào)控蛋白(如Hel2、Dom34和Xrn1等)從而減緩相關(guān)過程可能是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的有效手段[111]。

3.2 翻譯延伸暫停的生物學(xué)效應(yīng)

在正常生長的細(xì)胞中，ribo-seq實(shí)驗(yàn)觀察到了大量翻譯過程中核糖體的堆積位點(diǎn)，暗示了翻譯延伸遲滯事件的廣泛存在性[31]。如果這些核糖體以及被其翻譯的mRNA均進(jìn)入降解途徑，將會是極大的細(xì)胞資源浪費(fèi)并會引發(fā)嚴(yán)重的細(xì)胞代謝紊亂。例如，有約10%的真核生物蛋白質(zhì)含有多聚脯氨酸序列[5]，如果這10%的蛋白質(zhì)均因多聚脯氨酸序列對翻譯延伸的抑制作用而發(fā)生翻譯中止并且被降解，對細(xì)胞將是巨大的傷害，在這樣的情況下這些多聚脯氨酸序列理應(yīng)在進(jìn)化中被自然選擇淘汰。事實(shí)上，多聚脯氨酸序列對翻譯延伸的抑制作用可被翻譯延伸因子eIF5A (盡管從名字看是翻譯起始因子)所緩解[76,113]：在暫停后，核糖體可沿mRNA繼續(xù)行進(jìn)，翻譯出完整的蛋白質(zhì)。我們將這種現(xiàn)象與翻譯延伸中止相區(qū)分，稱之為翻譯延伸暫停。翻譯延伸暫停事件在細(xì)胞內(nèi)的普遍存在暗示其具有功能性調(diào)控作用，下文將分別從蛋白質(zhì)表達(dá)水平、mRNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)折疊等研究較多的4個(gè)方面詳細(xì)探討其生物學(xué)效應(yīng)。

3.2.1 調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)水平

翻譯起始一般被認(rèn)為是翻譯的限速步驟，其速率直接影響蛋白質(zhì)合成速率[23,114]。然而越來越多的證據(jù)表明，翻譯延伸速率對蛋白質(zhì)產(chǎn)量也具有重要的調(diào)控作用(圖3G)。例如Carlini等[115]改造了果蠅()乙醇脫氫酶基因()，將它的1個(gè)、6個(gè)或10個(gè)偏好密碼子替換為稀有密碼子，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示稀有密碼子的使用降低了ADH蛋白的水平。反之亦然，將人類() HEK-HT細(xì)胞中的原癌基因編碼區(qū)的稀有密碼子替換為偏好密碼子之后，突變體中的KRas蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，移植瘤生長實(shí)驗(yàn)顯示腫瘤增大[116]。Chu等[21]的研究工作結(jié)合報(bào)告基因和計(jì)算模擬的手段，系統(tǒng)性地探討了翻譯起始與延伸對蛋白質(zhì)合成速率的協(xié)同調(diào)控作用。該研究將報(bào)告基因分別設(shè)計(jì)為全部使用偏好密碼子、使用正常配比的同義密碼子、以及全部使用稀有密碼子3個(gè)版本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)基因具有高翻譯起始速率時(shí)，偏好密碼子版本的蛋白質(zhì)產(chǎn)量明顯高于稀有密碼子版本；而當(dāng)基因具有低翻譯起始速率時(shí)，3個(gè)版本的蛋白質(zhì)產(chǎn)量則無顯著差異。這一研究結(jié)果表明，只有當(dāng)核糖體可以在起始密碼子下游快速延伸的時(shí)候，高的翻譯起始速率才可能獲得高豐度蛋白質(zhì)產(chǎn)物；否則，與高起始速率不相匹配的緩慢的翻譯延伸將成為限速步驟。更為有趣的是，還有研究表明，釀酒酵母在脅迫條件下可以通過改變特定tRNA的濃度，調(diào)控同義密碼子的翻譯延伸速率，選擇性地加速合成響應(yīng)該脅迫條件的蛋白質(zhì)，促進(jìn)環(huán)境適應(yīng)[117]。

另外，Zhao等[118]發(fā)現(xiàn)擬南芥() mRNA的poly(A)尾中含有非腺嘌呤核苷酸(C、G和T)，而且腺嘌呤純度(即一條mRNA poly(A)尾中腺嘌呤所占poly(A)尾全長的比例)的下降可以抑制蛋白質(zhì)的合成。這可能是因?yàn)橄汆堰始兌容^高的poly(A)尾可以通過5′端帽子(5′-cap)結(jié)合蛋白(eIF4E)、腳手架蛋白(eIF4G)和poly(A)結(jié)合蛋白(PABP)構(gòu)成的蛋白質(zhì)復(fù)合體促進(jìn)mRNA的首尾成環(huán)(cap-to-tail looping)，提升翻譯結(jié)束后被釋放的核糖體重啟翻譯的回收效率，進(jìn)而提高翻譯起始速率和蛋白質(zhì)合成速率。

3.2.2 調(diào)控mRNA穩(wěn)定性

翻譯延伸速率不僅可影響蛋白質(zhì)表達(dá)量，還有報(bào)道顯示其對mRNA水平的調(diào)控：同義密碼子的使用可直接調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性(圖3H)。例如，Chen等[119]通過構(gòu)建報(bào)告基因的上千個(gè)同義突變體發(fā)現(xiàn)，含有偏好密碼子的基因傾向于具有更高的mRNA穩(wěn)定性和表達(dá)水平；在排除了mRNA二級結(jié)構(gòu)與GC含量等干擾因素的影響后依然如此。Schikora-Tamarit和Carey[120]認(rèn)為這是一種細(xì)胞識別“移碼”轉(zhuǎn)錄本并將其降解的機(jī)制，因?yàn)殚喿x框移碼后偏好密碼子的使用可能會減少。Espinar等[121]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)組成型表達(dá)的基因的mRNA水平受密碼子偏好性的影響更大，其機(jī)制與RNA解旋酶Dbp2有關(guān)。其他研究組的工作將密碼子使用偏好性、mRNA穩(wěn)定性和翻譯調(diào)控3方面進(jìn)行聯(lián)系：在斑馬魚()和爪蟾(的卵母細(xì)胞向合子的轉(zhuǎn)變過程中，富含偏好密碼子的基因具有更高的mRNA穩(wěn)定性、更長的poly(A)尾和更高的翻譯效率[122]；釀酒酵母中的研究結(jié)果則表明，偏好密碼子在具有更快的翻譯延伸速率的同時(shí)，也具有更高的mRNA穩(wěn)定性[123]，而這一偶聯(lián)是由Dhh1蛋白介導(dǎo)的[124]。另一個(gè)斑馬魚中的研究工作更是直接指出，稀有密碼子介導(dǎo)的mRNA降解過程是依賴于mRNA翻譯的——當(dāng)人為阻斷翻譯起始時(shí)，富含稀有密碼子的mRNA不再被快速降解[125]。

3.2.3 調(diào)控蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位

翻譯延伸還可以調(diào)控蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位(圖 3I)。定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分泌蛋白通常在其氨基端具有5~30個(gè)氨基酸的信號肽序列(signal peptide)，當(dāng)此序列被翻譯完成后會與信號肽識別因子(signal recognition particle, SRP)結(jié)合，與此同時(shí)信號肽識別因子會將自身插入核糖體A位點(diǎn)，通過阻止氨酰tRNA進(jìn)入的方式暫停翻譯延伸，直至翻譯暫停的mRNA-核糖體復(fù)合物正確定位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，翻譯延伸才重新恢復(fù)[126,127]。一些學(xué)者認(rèn)為神經(jīng)退行性疾病亨廷頓綜合征(Huntington’s disease, HD)是由翻譯延伸調(diào)控紊亂引發(fā)的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤定位導(dǎo)致的。亨廷頓綜合征的致病蛋白Htt的第一個(gè)外顯子從氨基端起依次編碼17個(gè)氨基酸的定位信號肽(N17)、19個(gè)谷氨酰胺的串聯(lián)序列以及長度為38個(gè)氨基酸的富脯氨酸序列[128]，其中谷氨酰胺串聯(lián)序列的加長突變(≥35個(gè)氨基酸)可引發(fā)疾病[129~131]。在正常的Htt中，脯氨酸序列位于信號肽N17序列下游的30~57個(gè)氨基酸的最佳位置來暫停翻譯延伸，此時(shí)N17剛剛從核糖體肽鏈輸出通道中暴露出來，為信號肽識別因子提供了最優(yōu)結(jié)合肽鏈長度和充足的識別時(shí)間，使得Htt蛋白可以在信號肽識別因子的幫助下正確定位于高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體[132]；而在突變的Htt中，隨著N17序列從核糖體肽鏈輸出通道出現(xiàn)，其后方的加長谷氨酰胺區(qū)域?qū)⒈豢焖俜g(速率比脯氨酸快2~6倍)[71,91]，因此信號肽識別因子將沒有足夠的時(shí)間與N17結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致突變的Htt錯(cuò)誤地聚集于細(xì)胞質(zhì)并引發(fā)疾病[133]。

3.2.4 調(diào)控蛋白質(zhì)折疊

新生肽鏈的正確折疊對蛋白質(zhì)正常執(zhí)行其分子功能至關(guān)重要，而蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和聚集則可導(dǎo)致多種嚴(yán)重的人類疾病，如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)、朊病毒(prion)相關(guān)疾病和帕金森病(Parkinson’s disease, PD)等[134~136]。模擬分析結(jié)果顯示，近1/3的胞質(zhì)蛋白質(zhì)存在共翻譯折疊現(xiàn)象(co-translational protein folding)[137]，暗示了翻譯延伸速率可能對蛋白質(zhì)折疊發(fā)揮重要的調(diào)控作用(圖3J)。

核糖體在同一條mRNA上延伸速率的異質(zhì)性可能直接影響新合成蛋白質(zhì)的構(gòu)象。迄今為止，大多數(shù)相關(guān)例證均與密碼子使用偏好性有關(guān)[138]。例如，稀有密碼子被發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域邊界區(qū)成簇出現(xiàn)，由其導(dǎo)致的翻譯暫停一般被認(rèn)為可為其上游蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的正確折疊提供充足時(shí)間[119,139~142]。通過改變同義密碼子使用的方式改變翻譯延伸速率可生成構(gòu)象和功能異常的蛋白質(zhì)[143~146]。除同義密碼子的使用之外，一些基因組證據(jù)顯示mRNA二級結(jié)構(gòu)也可通過調(diào)控翻譯延伸速率影響蛋白質(zhì)折疊[147]。例如，擬南芥的mRNA二級結(jié)構(gòu)傾向于在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域連接區(qū)或無序區(qū)增強(qiáng)，這可能會通過減緩翻譯延伸保證新生肽鏈有充足的時(shí)間折疊出正確的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域[63]；美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI) Koonin課題組通過分析兩個(gè)真核生物和3個(gè)原核生物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)也得到了類似的結(jié)論[148]。

蛋白質(zhì)的共翻譯折疊在新生肽鏈進(jìn)入核糖體肽鏈輸出通道的一刻即可開始[10]。核糖體肽鏈輸出通道可容納30~40個(gè)氨基酸長度的新生肽鏈，其寬度(10~20 ?)一般認(rèn)為足夠容納α-螺旋(α-helix)等小型蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)在其內(nèi)部折疊[149~153]。肽鏈輸出通道出口外的新生肽鏈則可以與核糖體表面相互作用，這也可能調(diào)控蛋白質(zhì)的折疊[154~156]。位于肽鏈輸出通道外部的新生肽鏈還會接觸到大量細(xì)胞質(zhì)中的核糖體關(guān)聯(lián)蛋白因子(ribosome-associated protein factor)與分子伴侶(chaperone)，這些蛋白因子與核糖體及新生肽鏈的動態(tài)結(jié)合也被認(rèn)為對蛋白質(zhì)的共翻譯折疊起到重要的調(diào)控作用[157~159]。例如，Liu等[160]研究顯示，細(xì)菌中唯一的核糖體相關(guān)分子伴侶——觸發(fā)因子(trigger factor)可通過結(jié)合EF-G的新生肽鏈來抑制結(jié)構(gòu)域之間的錯(cuò)誤相互作用，并防止未折疊區(qū)域的多肽對已折疊結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象破壞。

4 結(jié)語與展望

翻譯延伸并非mRNA上密碼子解碼過程的簡單重復(fù)，mRNA的編碼序列攜帶的信息也并非只有氨基酸序列。相反，mRNA序列里蘊(yùn)含著豐富的遺傳信息，可調(diào)控蛋白質(zhì)的合成、折疊、亞細(xì)胞定位以及mRNA的穩(wěn)定性。伴隨著研究手段的不斷突破與創(chuàng)新，翻譯延伸的調(diào)控機(jī)理和生物學(xué)效應(yīng)開始逐步被解析與認(rèn)知?？紤]到生物體在不同的外界環(huán)境下、不同發(fā)育時(shí)間節(jié)點(diǎn)、不同器官組織細(xì)胞類型之間乃至同一細(xì)胞內(nèi)的不同mRNA中，翻譯延伸過程均可能受到特異的調(diào)控，翻譯延伸過程的動態(tài)性與復(fù)雜性可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人們目前的認(rèn)知。

關(guān)于翻譯延伸當(dāng)下仍有許多問題有待進(jìn)一步探索。例如，細(xì)胞內(nèi)核糖體組分的異質(zhì)性是否參與調(diào)控翻譯延伸速率？細(xì)胞如何區(qū)分翻譯中止與暫停產(chǎn)生的串聯(lián)雙核糖體并引導(dǎo)不同的下游響應(yīng)？細(xì)胞是通過哪些反式作用因子調(diào)整翻譯延伸響應(yīng)外界環(huán)境變化的？翻譯延伸調(diào)控機(jī)器是否參與應(yīng)激顆粒(stress granule)的形成從而迅速響應(yīng)外界環(huán)境變化？翻譯延伸調(diào)控的紊亂究竟是如何參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展的？大量已有的以核糖體為靶點(diǎn)的藥物是否可以用于改善翻譯延伸速率并促進(jìn)病理蛋白質(zhì)的正確折疊？這一系列問題的解答必將為蛋白折疊相關(guān)疾病的診斷與治療提供新的見解。

另外，設(shè)計(jì)新的生物系統(tǒng)、賦予細(xì)胞嶄新的生物學(xué)功能的合成生物學(xué)方興未艾。還有一系列翻譯調(diào)控相關(guān)問題有待回答。例如，如何優(yōu)化mRNA序列以避免翻譯延伸遲滯對核糖體的占用和對細(xì)胞整體翻譯效率的影響？如何優(yōu)化mRNA序列以促進(jìn)特定蛋白質(zhì)的正確折疊與亞細(xì)胞定位？因此，對于翻譯延伸調(diào)控背后錯(cuò)綜復(fù)雜的分子機(jī)理的解析還將幫助合成生物學(xué)建立未來人工設(shè)計(jì)的新規(guī)則。

[1] Zheng CX, Ma XF, Zhang YH, Li HJ, Zhang GF. Research progress in the mechanism of translation initiation of eukaryotic mRNAs., 2018, 40(8): 607–619.鄭超星, 馬小鳳, 張永華, 李洪杰, 張根發(fā). 真核生物mRNA翻譯起始機(jī)制研究進(jìn)展. 遺傳, 2018, 40(8): 607–619.

[2] Stein KC, Frydman J. The stop-and-go traffic regulating protein biogenesis: how translation kinetics controls proteostasis., 2019, 294(6): 2076–2084.

[3] Richter JD, Coller J. Pausing on polyribosomes: make way for elongation in translational control., 2015, 163(2): 292–300.

[4] Choi J, Grosely R, Prabhakar A, Lapointe CP, Wang Jf, Puglisi JD. How messenger RNA and nascent chain sequences regulate translation elongation., 2018, 87: 421–449.

[5] Buskirk AR, Green R. Ribosome pausing, arrest and rescue in bacteria and eukaryotes., 2017, 372(1716): 20160183.

[6] Voorhees RM, Ramakrishnan V. Structural basis of the translational elongation cycle., 2013, 82: 203–236.

[7] Lin JZ, Gagnon MG, Bulkley D, Steitz TA. Conforma-tional changes of elongation factor G on the ribosome during tRNA translocation., 2015, 160(0): 219– 227.

[8] Gagnon MG, Lin JZ, Bulkley D, Steitz TA. Crystal structure of elongation factor 4 bound to a clockwise ratcheted ribosome., 2014, 345(6197): 684–687.

[9] Mustoe AM, Brooks CL, Al-Hashimi HM. Hierarchy of RNA functional dynamics., 2014, 83: 441–466.

[10] Javed A, Christodoulou J, Cabrita LD, Orlova EV. The ribosome and its role in protein folding: looking through a magnifying glass., 2017, 73(pt 6): 509–521.

[11] Nygaard R, Romaniuk JAH, Rice DM, Cegelski L. Whole ribosome NMR: dipolar couplings and contribu-tions to whole cells., 2017, 121(40): 9331–9335.

[12] Bai XC, Fernandez IS, McMullan G, Scheres SH. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles., 2013, 2: e00461.

[13] Amunts A, Brown A, Bai XC, Llacer JL, Hussain T, Emsley P, Long F, Murshudov G, Scheres SHW, Ramakrishnan V. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit., 2014, 343(6178): 1485–1489.

[14] Liu Z, Gutierrez-Vargas C, Wei J, Grassucci RA, Sun M, Espina N, Madison-Antenucci S, Tong L, Frank J. Determination of the ribosome structure to a resolution of 2.5 ? by single-particle cryo-EM., 2017, 26(1): 82–92.

[15] Loveland AB, Demo G, Grigorieff N, Korostelev AA. Ensemble cryo-EM elucidates the mechanism of translation fidelity., 2017, 546(7656): 113–117.

[16] Fischer N, Neumann P, Konevega AL, Bock LV, Ficner R, Rodnina MV, Stark H. Structure of theribosome-EF-Tu complex at <3 ? resolution by Cs-corrected cryo-EM., 2015, 520(7548): 567– 570.

[17] Zhang YQ, Mandava CS, Cao W, Li XJ, Zhang DJ, Li NN, Zhang YX, Zhang XX, Qin Y, Mi KX, Lei JL, Sanya S, Gao N. HflX is a ribosome-splitting factor rescuing stalled ribosomes under stress conditions., 2015, 22(11): 906–913.

[18] Johansson M, Bouakaz E, Lovmar M, Ehrenberg M. The kinetics of ribosomal peptidyl transfer revisited., 2008, 30(5): 589–598.

[19] Wang JF, Kwiatkowski M, Forster AC. Kinetics of ribosome-catalyzed polymerization using artificial aminoacyl-tRNA substrates clarifies inefficiencies and improvements., 2015, 10(10): 2187– 2192.

[20] Wohlgemuth I, Brenner S, Beringer M, Rodnina MV. Modulation of the rate of peptidyl transfer on the ribosome by the nature of substrates., 2008, 283(47): 32229–32235.

[21] Chu D, Kazana E, Bellanger N, Singh T, Tuite MF, von der Haar T. Translation elongation can control translation initiation on eukaryotic mRNAs., 2014, 33(1): 21–34.

[22] Morisaki T, Stasevich TJ. Quantifying single mRNA translation kinetics in living cells., 2018, 10(11): a032078.

[23] Yan XW, Hoek TA, Vale RD, Tanenbaum ME. Dynamics of translation of single mRNA molecules, 2016, 165(4): 976–989.

[24] Wu B, Eliscovich C, Yoon YJ, Singer RH. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons., 2016, 352(6292): 1430–1435.

[25] Morisaki T, Lyon K, DeLuca KF, DeLuca JG, English BP, Zhang ZJ, Lavis LD, Grimm JB, Viswanathan S, Looger LL, Lionnet T, Stasevich TJ. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells., 2016, 352(6292): 1425–1429.

[26] Steitz JA. Polypeptide chain initiation: nucleotide sequences of the three ribosomal binding sites in bacteriophage R17 RNA., 1969, 224(5223): 957–964.

[27] Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysisof translation with nucleotide resolution using ribosome profiling., 2009, 324(5924): 218–223.

[28] Pelechano V, Wei W, Steinmetz LM. Widespread co-translational RNA decay reveals ribosome dynamics., 2015, 161(6): 1400–1412.

[29] Michel AM, Baranov PV. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale., 2013, 4(5): 473–490.

[30] Zhao J, Zhang G. Translatomics: methods and applications., 2017, 37(1): 70–79.趙晶, 張弓. 翻譯組學(xué):方法及應(yīng)用. 生命的化學(xué), 2017, 37(1): 70–79.

[31] Ingolia NT, Lareau LF, Weissman JS. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes., 2011, 147(4): 789–802.

[32] Qian WF, Yang JR, Pearson NM, Maclean C, Zhang JZ. Balanced codon usage optimizes eukaryotic translational efficiency., 2012, 8(3): e1002603.

[33] Weinberg DE, Shah P, Eichhorn SW, Hussmann JA, Plotkin JB, Bartel DP. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation., 2016, 14(7): 1787–1799.

[34] Hussmann JA, Patchett S, Johnson A, Sawyer S, Press WH. Understanding biases in ribosome profiling experiments reveals signatures of translation dynamics in yeast., 2015, 11(12): e1005732.

[35] Subramaniam AR, Zid BM, O'Shea EK. An integrated approach reveals regulatory controls on bacterial translation elongation., 2014, 159(5): 1200–1211.

[36] Guydosh NR, Green R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions., 2014, 156(5): 950–962.

[37] Yang JR, Chen XS, Zhang JZ. Codon-by-codon modulation of translational speed and accuracy via mRNA folding., 2014, 12(7): e1001910.

[38] Dever TE, Dinman JD, Green R. Translation elongation and recoding in eukaryotes., 2018, 10(8): a032649.

[39] Chen PJ, Huang YS. CPEB2-eEF2 interaction impedes HIF-1α RNA translation., 2012, 31(4): 959– 971.

[40] Grelet S, Howe PH. hnRNP E1 at the crossroads of translational regulation of epithelial-mesenchymal transition., 2019, 5: 16.

[41] Desnoyers G, Bouchard MP, Masse E. New insights into small RNA-dependent translational regulation in prokaryotes., 2013, 29(2): 92–98.

[42] Ambros V, Chen XM. The regulation of genes and genomes by small RNAs., 2007, 134(9): 1635–1641.

[43] Grantham R, Gautier C, Gouy M, Mercier R, Pavé A. Codon catalog usage and the genome hypothesis., 1980, 8(1): r49–r62.

[44] Ikemura T. Correlation between the abundance oftransfer RNAs and the occurrence of the respective codons in its protein genes: A proposal for a synonymous codon choice that is optimal for thetranslational system., 1981, 151(3): 389–409.

[45] Hershberg R, Petrov DA. Selection on codon bias., 2008, 42: 287–299.

[46] Plotkin JB, Kudla G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias., 2011, 12(1): 32–42.

[47] Gingold H, Pilpel Y. Determinants of translation efficiency and accuracy., 2011, 7: 481.

[48] Akashi H. Synonymous codon usage in: natural selection and translational accuracy., 1994, 136(3): 927–935.

[49] Stoletzki N, Eyre-Walker A. Synonymous codon usage in: selection for translational accuracy., 2007, 24(2): 374–381.

[50] Ikemura T. Correlation between the abundance of yeast transfer RNAs and the occurrence of the respective codons in protein genes. Differences in synonymous codon choice patterns of yeast andwith reference to the abundance of isoaccepting transfer RNAs., 1982, 158(4): 573–597.

[51] Ikemura T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms., 1985, 2(1): 13–34.

[52] Novoa EM, Ribas de Pouplana L. Speeding with control: codon usage, tRNAs, and ribosomes., 2012, 28(11): 574–581.

[53] Buhr F, Jha S, Thommen M, Mittelstaet J, Kutz F, Schwalbe H, Rodnina MV, Komar AA. Synonymous codons direct cotranslational folding toward different protein conformations., 2016, 61(3): 341–351.

[54] Curran JF, Yarus M. Rates of aminoacyl-tRNA selection at 29 sense codons., 1989, 209(1): 65–77.

[55] S?rensen MA, Kurland CG, Pedersen S. Codon usage determines translation rate in., 1989, 207(2): 365–377.

[56] Gardin J, Yeasmin R, Yurovsky A, Cai Y, Skiena S, Futcher B. Measurement of average decoding rates of the 61 sense codons., 2014, 3: e03735.

[57] Kertesz M, Iovino N, Unnerstall U, Gaul U, Segal E. The role of site accessibility in microRNA target recognition., 2007, 39(10): 1278–1284.

[58] Beaudoin JD, Novoa EM, Vejnar CE, Yartseva V, Takacs CM, Kellis M, Giraldez AJ. Analyses of mRNA structure dynamics identify embryonic gene regulatory programs., 2018, 25(8): 677–686.

[59] Rouskin S, Zubradt M, Washietl S, Kellis M, Weissman JS. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures., 2014, 505(7485): 701–705.

[60] Chartrand P, Meng XH, Huttelmaier S, Donato D, Singer RH. Asymmetric sorting of ash1p in yeast results from inhibition of translation by localization elements in the mRNA., 2002, 10(6): 1319–1330.

[61] Qu XH, Wen JD, Lancaster L, Noller HF, Bustamante C, Tinoco I. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation., 2011, 475(7354): 118–121.

[62] Kertesz M, Wan Y, Mazor E, Rinn JL, Nutter RC, Chang HY, Segal E. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast., 2010, 467(7311): 103–107.

[63] Tang Y, Assmann SM, Bevilacqua PC. Protein structure is related to RNA structural reactivity, 2016, 428(5): 758–766.

[64] Watts JM, Dang KK, Gorelick RJ, Leonard CW, Bess JW, Swanstrom R, Burch CL, Weeks KM. Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome., 2009, 460(7256): 711–716.

[65] Dinman JD. Mechanisms and implications of programmed translational frameshifting., 2012, 3(5): 661–673.

[66] Biswas P, Jiang X, Pacchia AL, Dougherty JP, Peltz SW. The human immunodeficiency virus type 1 ribosomal frameshifting site is an invariant sequence determinant and an important target for antiviral therapy., 2004, 78(4): 2082–2087.

[67] Wu F, Zhao S, Yu B, Chen YM, Wang W, Song ZG, Hu Y, Tao ZW, Tian JH, Pei YY, Yuan ML, Zhang YL, Dai FH, Liu Y, Wang QM, Zheng JJ, Xu L, Holmes EC, Zhang YZ. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China., 2020, 579(7798): 265–269.

[68] Caliskan N, Peske F, Rodnina MV. Changed in translation: mRNA recoding by -1 programmed ribosomal frame-shifting., 2015, 40(5): 265–274.

[69] Mustoe AM, Busan S, Rice GM, Hajdin CE, Peterson BK, Ruda VM, Kubica N, Nutiu R, Baryza JL, Weeks KM. Pervasive regulatory functions of mRNA structure revealed by high-resolution SHAPE probing., 2018, 173(1): 181–195.e118.

[70] Su Z, Tang Y, Ritchey LE, Tack DC, Zhu M, Bevilacqua PC, Assmann SM. Genome-wide RNA structurome reprogramming by acute heat shock globally regulates mRNA abundance., 2018, 115(48): 12170–12175.

[71] Pavlov MY, Watts RE, Tan Z, Cornish VW, Ehrenberg M, Forster AC. Slow peptide bond formation by proline and other N-alkylamino acids in translation., 2009, 106(1): 50–54.

[72] Muto H, Ito K. Peptidyl-prolyl-tRNA at the ribosomal P-site reacts poorly with puromycin., 2008, 366(4): 1043–1047.

[73] Melnikov S, Mailliot J, Rigger L, Neuner S, Shin BS, Yusupova G, Dever TE, Micura R, Yusupov M. Molecular insights into protein synthesis with proline residues., 2016, 17(12): 1776–1784.

[74] Doerfel LK, Wohlgemuth I, Kothe C, Peske F, Urlaub H, Rodnina MV. EF-P is essential for rapid synthesis of proteins containing consecutive proline residues., 2013, 339(6115): 85–88.

[75] Ude S, Lassak J, Starosta AL, Kraxenberger T, Wilson DN, Jung K. Translation elongation factor EF-P alleviates ribosome stalling at polyproline stretches., 2013, 339(6115): 82–85.

[76] Gutierrez E, Shin BS, Woolstenhulme CJ, Kim JR, Saini P, Buskirk AR, Dever TE. eIF5A promotes translation of polyproline motifs., 2013, 51(1): 35–45.

[77] Woolstenhulme CJ, Parajuli S, Healey DW, Valverde DP, Petersen EN, Starosta AL, Guydosh NR, Johnson WE, Wilson DN, Buskirk AR. Nascent peptides that block protein synthesis in bacteria., 2013, 110(10): E878–E887.

[78] Starosta AL, Lassak J, Peil L, Atkinson GC, Virum?e K, Tenson T, Remme J, Jung K, Wilson DN. Translational stalling at polyproline stretches is modulated by the sequence context upstream of the stall site., 2014, 42(16): 10711–10719.

[79] Peil L, Starosta AL, Lassak J, Atkinson GC, Virum?e K, Spitzer M, Tenson T, Jung K, Remme J, Wilson DN. Distinct XPPX sequence motifs induce ribosome stalling, which is rescued by the translation elongation factor EF-P., 2013, 110(38): 15265–15270.

[80] Rodnina MV. The ribosome in action: tuning of translational efficiency and protein folding., 2016, 25(8): 1390–1406.

[81] Ito K, Chiba S. Arrest peptides: cis-acting modulators of translation., 2013, 82: 171–202.

[82] Tenson T, Ehrenberg M. Regulatory nascent peptides in the ribosomal tunnel., 2002, 108(5): 591–594.

[83] Nakatogawa H, Ito K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate., 2002, 108(5): 629–636.

[84] Muto H, Nakatogawa H, Ito K. Genetically encoded but nonpolypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall., 2006, 22(4): 545–552.

[85] Tanner DR, Cariello DA, Woolstenhulme CJ, Broadbent MA, Buskirk AR. Genetic identification of nascent peptides that induce ribosome stalling., 2009, 284(50): 34809–34818.

[86] Navon SP, Kornberg G, Chen J, Schwartzman T, Tsai A, Puglisi EV, Puglisi JD, Adir N. Amino acid sequence repertoire of the bacterial proteome and the occurrence of untranslatable sequences., 2016, 113(26): 7166–7170.

[87] Lu JL, Kobertz WR, Deutsch C. Mapping the electrostatic potential within the ribosomal exit tunnel., 2007, 371(5): 1378–1391.

[88] Lu JL, Deutsch C. Electrostatics in the ribosomal tunnel modulate chain elongation rates., 2008, 384(1): 73–86.

[89] Koutmou KS, Schuller AP, Brunelle JL, Radhakrishnan A, Djuranovic S, Green R. Ribosomes slide on lysine-encoding homopolymeric A stretches., 2015, 4: e05534.

[90] Charneski CA, Hurst LD. Positively charged residues are the major determinants of ribosomal velocity., 2013, 11(3): e1001508.

[91] Artieri CG, Fraser HB. Accounting for biases in riboprofiling data indicates a major role for proline in stalling translation., 2014, 24(12): 2011– 2021.

[92] Sabi R, Tuller T. A comparative genomics study on the effect of individual amino acids on ribosome stalling., 2015, 16(Suppl.10): S5.

[93] Ikeuchi K, Izawa T, Inada T. Recent progress on the molecular mechanism of quality controls induced by ribosome stalling., 2018, 9: 743.

[94] Sharma AK, O'Brien EP. Non-equilibrium coupling of protein structure and function to translation-elongation kinetics., 2018, 49: 94–103.

[95] Matsuo Y, Ikeuchi K, Saeki Y, Iwasaki S, Schmidt C, Udagawa T, Sato F, Tsuchiya H, Becker T, Tanaka K, Ingolia NT, Beckmann R, Inada T. Ubiquitination of stalled ribosome triggers ribosome-associated quality control., 2017, 8(1): 159.

[96] Ikeuchi K, Tesina P, Matsuo Y, Sugiyama T, Cheng J, Saeki Y, Tanaka K, Becker T, Beckmann R, Inada T. Collided ribosomes form a unique structural interface to induce Hel2-driven quality control pathways., 2019, 38(5): e100276.

[97] Brandman O, Stewart-Ornstein J, Wong D, Larson A, Williams CC, Li GW, Zhou S, King D, Shen PS, Weibezahn J, Dunn JG, Rouskin S, Inada T, Frost A, Weissman JS. A ribosome-bound quality control complex triggers degradation of nascent peptides and signals translation stress., 2012, 151(5): 1042–1054.

[98] Shen PS, Park J, Qin YD, Li XM, Parsawar K, Larson MH, Cox J, Cheng YF, Lambowitz AM, Weissman JS, Brandman O, Frost A. Protein synthesis. Rqc2p and 60S ribosomal subunits mediate mRNA-independent elongation of nascent chains., 2015, 347(6217): 75–78.

[99] Verma R, Reichermeier KM, Burroughs AM, Oania RS, Reitsma JM, Aravind L, Deshaies RJ. Vms1 and ANKZF1 peptidyl-tRNA hydrolases release nascent chains from stalled ribosomes., 2018, 557(7705): 446–451.

[100] Zurita Rendon O, Fredrickson EK, Howard CJ, Van Vranken J, Fogarty S, Tolley ND, Kalia R, Osuna BA, Shen PS, Hill CP, Frost A, Rutter J. Vms1p is a release factor for the ribosome-associated quality control complex., 2018, 9(1): 2197.

[101] Defenouillère Q, Yao YH, Mouaikel J, Namane A, Galopier A, Decourty L, Doyen A, Malabat C, Saveanu C, Jacquier A, Fromont-Racine M. Cdc48-associated complex bound to 60S particles is required for the clearance of aberrant translation products., 2013, 110(13): 5046–5051.

[102] Verma R, Oania RS, Kolawa NJ, Deshaies RJ. Cdc48/p97 promotes degradation of aberrant nascent polypeptides bound to the ribosome., 2013, 2: e00308.

[103] Doma MK, Parker R. Endonucleolytic cleavage of eukaryotic mRNAs with stalls in translation elongation., 2006, 440(7083): 561–564.

[104] Shoemaker CJ, Eyler DE, Green R. Dom34:Hbs1 pro-motes subunit dissociation and peptidyl-tRNA drop-off to initiate no-go decay., 2010, 330(6002): 369– 372.

[105] Shoemaker CJ, Green R. Kinetic analysis reveals the ordered coupling of translation termination and ribosome recycling in yeast., 2011, 108(51): E1392–1398.

[106] Pisareva VP, Skabkin MA, Hellen CU, Pestova TV, Pisarev AV. Dissociation by Pelota, Hbs1 and ABCE1 of mammalian vacant 80S ribosomes and stalled elongation complexes., 2011, 30(9): 1804–1817.

[107] Dimitrova LN, Kuroha K, Tatematsu T, Inada T. Nascent peptide-dependent translation arrest leads to Not4p-mediated protein degradation by the proteasome., 2009, 284(16): 10343–10352.

[108] Juszkiewicz S, Hegde RS. Initiation of quality control during poly(A) translation requires site-specific ribosome ubiquitination., 2017, 65(4): 743–750.e744.

[109] Bengtson MH, Joazeiro CAP. Role of a ribosome- associated E3 ubiquitin ligase in protein quality control., 2010, 467(7314): 470–473.

[110] Letzring DP, Wolf AS, Brule CE, Grayhack EJ. Translation of CGA codon repeats in yeast involves quality control components and ribosomal protein L1., 2013, 19(9): 1208–1217.

[111] Simms CL, Hudson BH, Mosior JW, Rangwala AS, Zaher HS. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized Mrna., 2014, 9(4): 1256–1264.

[112] Ishimura R, Nagy G, Dotu I, Zhou HH, Yang XL, Schimmel P, Senju S, Nishimura Y, Chuang JH, Acker-man SL. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodege-neration., 2014, 345(6195): 455–459.

[113] Saini P, Eyler DE, Green R, Dever TE. Hypusine- containing protein eIF5A promotes translation elongation., 2009, 459(7243): 118–121.

[114] Shah P, Ding Y, Niemczyk M, Kudla G, Plotkin JB. Rate-limiting steps in yeast protein translation., 2013, 153(7): 1589–1601.

[115] Carlini DB, Stephan W.introduction of unpreferred synonymous codons into thegene results in reduced levels of ADH protein., 2003, 163(1): 239–243.

[116] Lampson BL, Pershing NL, Prinz JA, Lacsina JR, Marzluff WF, Nicchitta CV, MacAlpine DM, Counter CM. Rare codons regulate KRas oncogenesis., 2013, 23(1): 70–75.

[117] Torrent M, Chalancon G, de Groot NS, Wuster A, Madan Babu M. Cells alter their tRNA abundance to selectively regulate protein synthesis during stress conditions., 2018, 11(546): eaat6409.

[118] Zhao TL, Huan Q, Sun J, Liu CY, Hou XL, Yu X, Silverman IM, Zhang Y, Gregory BD, Liu CM, Qian WF, Cao XF. Impact of poly(A)-tail G-content onPAB binding and their role in enhancing translational efficiency., 2019, 20: 189.

[119] Chen SY, Li K, Cao WQ, Wang J, Zhao T, Huan Q, Yang YF, Wu SH, Qian WF. Codon-resolution analysis reveals a direct and context-dependent impact of individual synonymous mutations on mRNA level., 2017, 34(11): 2944–2958.

[120] Schikora-Tamarit MA, Carey LB. Poor codon optimality as a signal to degrade transcripts with frameshifts., 2018, 9(5): 327–333.

[121] Espinar L, Schikora Tamarit Mà, Domingo J, Carey LB. Promoter architecture determines cotranslational regulation of mRNA., 2018, 28(4): 509–518.

[122] Bazzini AA, Del Viso F, Moreno-Mateos MA, Johnstone TG, Vejnar CE, Qin YD, Yao J, Khokha MK, Giraldez AJ. Codon identity regulates mRNA stability and translation efficiency during the maternal-to-zygotic transition., 2016, 35(19): 2087–2103.

[123] Presnyak V, Alhusaini N, Chen YH, Martin S, Morris N, Kline N, Olson S, Weinberg D, Baker KE, Graveley BR, Coller J. Codon optimality is a major determinant of mRNA stability., 2015, 160(6): 1111–1124.

[124] Radhakrishnan A, Chen YH, Martin S, Alhusain N, Green R, Coller J. The DEAD-box protein Dhh1p couples mRNA decay and translation by monitoring codon optimality., 2016, 167(1): 122–132.e129.

[125] Mishima Y, Tomari Y. Codon usage and 3' UTR length determine maternal mRNA stability in zebrafish., 2016, 61(6): 874–885.

[126] Siegel V, Walter P. Each of the activities of signal recognition particle (SRP) is contained within a distinct domain: analysis of biochemical mutants of SRP., 1988, 52(1): 39–49.

[127] Halic M, Becke T, Pool MR, Spahn CM, Grassucci RA, Frank J, Beckmann R. Structure of the signal recognition particle interacting with the elongation-arrested ribosome., 2004, 427(6977): 808–814.

[128] Crick SL, Ruff KM, Garai K, Frieden C, Pappu RV. Unmasking the roles of N- and C-terminal flanking sequences from exon 1 of huntingtin as modulators of polyglutamine aggregation., 2013, 110(50): 20075–20080.

[129] Brinkman RR, Mezei MM, Theilmann J, Almqvist E, Hayden MR. The likelihood of being affected with Huntington disease by a particular age, for a specific CAG size., 1997, 60(5): 1202–1210.

[130] Li SH, Li XJ. Aggregation of N-terminal huntingtin is dependent on the length of its glutamine repeats., 1998, 7(5): 777–782.

[131] Lee JM, Ramos EM, Lee JH, Gillis T, Mysore JS, Hayden MR, Warby SC, Morrison P, Nance M, Ross CA, Margolis RL, Squitieri F, Orobello S, Di Donato S, Gomez-Tortosa E, Ayuso C, Suchowersky O, Trent RJ, McCusker E, Novelletto A, Frontali M, Jones R, Ashizawa T, Frank S, Saint-Hilaire MH, Hersch SM, Rosas HD, Lucente D, Harrison MB, Zanko A, Abramson RK, Marder K, Sequeiros J, Paulsen JS, Landwehrmeyer GB, Myers RH, MacDonald ME, Gusella JF. CAG repeat expansion in Huntington disease determines age at onset in a fully dominant fashion., 2012, 78(9): 690–695.

[132] Rockabrand E, Slepko N, Pantalone A, Nukala VN, Kazantsev A, Marsh JL, Sullivan PG, Steffan JS, Sensi SL, Thompson LM. The first 17 amino acids of Huntingtin modulate its sub-cellular localization, aggregation and effects on calcium homeostasis., 2007, 16(1): 61–77.

[133] Nissley DA, O'Brien EP. Altered co-translational processing plays a role in Huntington's pathogenesis—a hypothesis., 2016, 9: 54.

[134] Hartl FU. Protein misfolding diseases., 2017, 86(1): 21–26.

[135] Chiti F, Dobson CM. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade., 2017, 86: 27–68.

[136] Soto C, Pritzkow S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases., 2018, 21(10): 1332–1340.

[137] Ciryam P, Morimoto RI, Vendruscolo M, Dobson CM, O'Brien EP.translation rates can substantially delay the cotranslational folding of thecytosolic proteome., 2013, 110(2): E132–140.

[138] Komar AA. Synonymous codon usage-a guide for co-translational protein folding in the cell., 2019, 53(6): 883–898.

[139] Clarke TF, Clark PL. Rare codons cluster., 2008, 3(10): e3412.

[140] Komar AA, Lesnik T, Reiss C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding duringtranslation., 1999, 462(3): 387–391.

[141] Zhang G, Ignatova Z. Folding at the birth of the nascent chain: coordinating translation with co-translational folding., 2011, 21(1): 25–31.

[142] Rodnina MV, Wintermeyer W. Protein elongation, co-translational folding and targeting., 2016, 428(10): 2165–2185.

[143] Cortazzo P, Cerve?ansky C, Marín M, Reiss C, Ehrlich R, Deana A. Silent mutations affectprotein folding in., 2002, 293(1): 537–541.

[144] Kimchi-Sarfaty C, Oh JM, Kim IW, Sauna ZE, Calcagno AM, Ambudkar SV, Gottesman MM. A “silent” polymorphism in thegene changes substrate specificity., 2007, 315(5811): 525–528.

[145] Walsh IM, Bowman MA, Soto Santarriaga IF, Rodriguez A, Clark PL. Synonymous codon substitutions perturb cotranslational protein foldingand impair cell fitness., 2020, 117(7): 3528– 3534.

[146] Agashe D, Sane M, Phalnikar K, Diwan GD, Habibullah A, Martinez-Gomez NC, Sahasrabuddhe V, Polachek W, Wang J, Chubiz LM, Marx CJ. Large-effect beneficial synonymous mutations mediate rapid and parallel adaptation in a bacterium., 2016, 33(6): 1542–1553.

[147] Yang JR. Does mRNA structure contain genetic information for regulating co-translational protein folding?, 2017, 38(1): 36–43.

[148] Faure G, Ogurtsov AY, Shabalina SA, Koonin EV. Role of mRNA structure in the control of protein folding., 2016, 44(22): 10898–10911.

[149] Voss NR, Gerstein M, Steitz TA, Moore PB. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel., 2006, 360(4): 893–906.

[150] Bhushan S, Gartmann M, Halic M, Armache JP, Jarasch A, Mielke T, Berninghausen O, Wilson DN, Beckmann R. Alpha-Helical nascent polypeptide chains visualized within distinct regions of the ribosomal exit tunnel., 2010, 17(3): 313–317.

[151] Nilsson OB, Hedman R, Marino J, Wickles S, Bischoff L, Johansson M, Müller-Lucks A, Trovato F, Puglisi JD, O'Brien EP, Beckmann R, von Heijne G. Cotranslational protein folding inside the ribosome exit tunnel., 2015, 12(10): 1533–1540.

[152] Lu JL, Deutsch C. Folding zones inside the ribosomal exit tunnel., 2005, 12(12): 1123– 1129.

[153] Woolhead CA, McCormick PJ, Johnson AE. Nascent membrane and secretory proteins differ in FRET-detected folding far inside the ribosome and in their exposure to ribosomal proteins., 2004, 116(5): 725–736.

[154] Kaiser CM, Goldman DH, Chodera JD, Tinoco I, Bustamante C. The ribosome modulates nascent protein folding., 2011, 334(6063): 1723–1727.

[155] Cabrita LD, Cassaignau AME, Launay HMM, Waudby CA, Wlodarski T, Camilloni C, Karyadi ME, Robertson AL, Wang XL, Wentink AS, Goodsell L, Woolhead CA, Vendruscolo M, Dobson CM, Christodoulou J. A structural ensemble of a ribosome-nascent chain complex during cotranslational protein folding., 2016, 23(4): 278–285.

[156] Cabrita LD, Hsu ST, Launay H, Dobson CM, Christo-doulou J. Probing ribosome-nascent chain complexes producedby NMR spectroscopy., 2009, 106(2): 22239–22244.

[157] Sandikci A, Gloge F, Martinez M, Mayer MP, Wade R, Bukau B, Kramer G. Dynamic enzyme docking to the ribosome coordinates N-terminal processing with polypeptide folding., 2013, 20(7): 843–850.

[158] D?ring K, Ahmed N, Riemer T, Suresh HG, Vainshtein Y, Habich M, Riemer J, Mayer MP, O'Brien EP, Kramer G, Bukau B. Profiling Ssb-nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding., 2017, 170(2): 298–311.e220.

[159] Waudby CA, Dobson CM, Christodoulou J. Nature and regulation of protein folding on the ribosome., 2019, 44(11): 914–926.

[160] Liu KX, Maciuba K, Kaiser CM. The ribosome cooperates with a chaperone to guide multi-domain protein folding., 2019, 74(2): 310–319.e7.

-regulatory mechanisms and biological effects of translation elongation

Taolan Zhao1, Shuo Zhang1,2, Wenfeng Qian1,2

Proteins are biological macromolecules essential for cells to maintain their metabolic activities. Proteins are synthesized during translation elongation, a synergistic process in which ribosomes decode the genetic information transmitted in mRNA, using tRNA. Numerous human diseases, such as neurodegenerative diseases and cancers, are known to be related to abnormal translation elongation. Translation elongation, as one of the two critical steps for the central dogma, used to be the focus of research in molecular biology. However, limitations in methodology had hindered further investigations on the dynamic process of translation elongation and its regulation. Recently, breakthroughs in methodology have revived this research field. Studies in the past decade or so have revealed that, beyond simple decoding of genetic information in mRNA, translation elongation entails sophisticated regulatory mechanisms and multifaceted biological consequences; such insights have provided a novel theoretical framework for understanding the maintenance of protein homeostasis and the development of diseases. In this review, we summarize the most updated methods that can be used to investigate the processes of translation elongation and highlight the mechanisms by which mRNA and protein sequences modulate the local rate of translation elongation. We further enumerate the consequences of dysregulation in translation elongation, from various aspects such as mRNA stability, protein synthesis and degradation, protein subcellular localization, and co-translational protein folding. We anticipate that this review will serve to draw the attention of scholars in various research fields to participate in the study of translation elongation.

translation elongation; ribosome; ribo-seq; co-translational protein folding; codon usage bias; RNA secondary structure; nascent polypeptide

2020-03-18;

2020-06-28

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號：2019YFA0508700)和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31900455,91331112)資助[Supported by the National Key R&D Program of China (No. 2019YFA0508700), and the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31900455, 91331112)]

肇濤瀾，博士，研究方向：翻譯調(diào)控。E-mail：tlzhao@genetics.ac.cn

張碩，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：翻譯調(diào)控。E-mail: shzhang@genetics.ac.cn

肇濤瀾和張碩為并列第一作者。

肇濤瀾。

錢文峰，博士，研究員，研究方向：進(jìn)化基因組學(xué)、翻譯調(diào)控、植物單細(xì)胞組學(xué)。E-mail: wfqian@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.20-074

2020/7/9 10:44:43

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200707.1642.002.html

錢文峰課題組的主要研究方向之一是蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控及其進(jìn)化。建立在高通量的報(bào)告基因突變體蛋白質(zhì)水平測定(sort-seq)和翻譯組學(xué)(ribo-seq)兩大技術(shù)的基礎(chǔ)上，以釀酒酵母、擬南芥、線蟲等多個(gè)具有進(jìn)化代表意義的物種為研究材料，系統(tǒng)鑒定了參與翻譯調(diào)控的順式作用元件和反式作用因子，并探究了它們的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)了反式剪接和poly(A)尾中的鳥嘌呤可以調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯效率，同義密碼子可以通過翻譯延伸速率調(diào)控mRNA穩(wěn)定性，以及蛋白質(zhì)質(zhì)量控制機(jī)制參與調(diào)控非整倍體細(xì)胞蛋白質(zhì)的劑量平衡。相關(guān)研究成果發(fā)表在、、、等期刊上。現(xiàn)主持國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“蛋白質(zhì)機(jī)器與生命過程調(diào)控”青年項(xiàng)目1項(xiàng)。

(責(zé)任編委: 朱衛(wèi)國)