三萜類化合物指紋圖譜在山茶油真?zhèn)舞b別研究

董瑩瑩，胡重怡，朱啟盛，朱作為，郭 平，張文中，王 棟*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330045；2.江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330001；3.江西齊云山油茶科技有限公司，江西 贛州 341000)

食用植物油是人們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵罚煌参镉蜖I養(yǎng)成分和成本不同導(dǎo)致售價不同，以低價植物油冒充或摻假高價植物油而造成食用油市場魚龍混雜。隨著人們生活水平的提高，人們對食用植物油的品質(zhì)越來越重視，通過明確不同食用油之間營養(yǎng)成分的差異將對有效遏制摻假提供了新思路[1-4]。

目前，指紋圖譜分析技術(shù)憑借高靈敏度，高穩(wěn)定性和低樣品損耗的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥檢測、人類疾病診斷等領(lǐng)域[5-6]，常見指紋圖譜技術(shù)主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、質(zhì)譜法(MS)等。國內(nèi)外已有眾多學(xué)者利用指紋圖譜技術(shù)分析植物油中多種營養(yǎng)成分[8]。吳衛(wèi)國等[9]利用氣相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)，構(gòu)建了5類植物油標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸指紋圖譜，為食用油的產(chǎn)品質(zhì)量控制和摻假檢測提供理論依據(jù)。Purcaro等[10]利用全二維氣相色譜-火焰離子化檢測/質(zhì)譜檢測技術(shù)方法(GC×GC-FID/MS)，分析了植物油中甾醇、游離脂肪酸和蠟等次要特征成分，并利用指紋圖譜技術(shù)準(zhǔn)確判斷出特級初榨橄欖油中摻雜少量葵花籽油和棕櫚油的特征標(biāo)志物。Roberta等研究橄欖油中摻雜不同比例的大豆油，利用ESI-MS得到大豆油中特有脂質(zhì)標(biāo)記物，從而迅速準(zhǔn)確地判斷出橄欖油中摻假大豆油的比例[11]。三萜類化合物是食用植物油的重要脂肪伴隨物，又可細(xì)分為甾醇和三萜，本研究主要以特色高價食用植物油山茶油為材料，探究了幾種常見植物油并構(gòu)建三萜類物質(zhì)指紋圖譜，從而明確不同植物油之間三萜類化合物含量的差異，為今后山茶油真實性鑒別提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米油、花生油、葵花籽油、菜籽油、稻米油、大豆油、亞麻籽油、山茶油各3種，購買于超市或由企業(yè)提供。

角鯊烯、膽甾烷醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、膽固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、β-香樹脂醇、羽扇豆醇、環(huán)阿屯醇、無水吡啶由美國Sigma公司生產(chǎn)；羊毛甾醇由美國Avanti公司生產(chǎn)；中性氧化鋁由中國國藥集團(tuán)生產(chǎn)，層析用，F(xiàn)CP200-300目、氫氧化鉀、無水乙醇由中國國藥集團(tuán)生產(chǎn)，分析純；丙酮、正己烷由美國Honeywell公司生產(chǎn)，色譜純；0.22 μm有機(jī)濾膜由日本SHIMADZU公司生產(chǎn)；99∶1雙三甲基硅基三氟乙酰胺∶三甲基氯硅烷(99∶1，BSTFA-TMCS)由美國TCI公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-三重四級桿串接質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890B+7000D)(由美國安捷倫公司生產(chǎn))；QUINTIX124-1CN電子分析天平(由德國賽多利斯公司生產(chǎn)，精度：≤0.1 mg)；HH-6電熱恒溫水浴鍋(由上海博訊實業(yè)有限公司生產(chǎn))；Vortex Wizard渦旋儀(由意大利VELP公司生產(chǎn))；N-EVAP氮吹儀(由美國Organomation公司生產(chǎn))；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(由瑞士Buchi公司生產(chǎn))；層析柱、冷凝回流管、圓底燒瓶、玻璃試管(四川蜀玻有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 中性氧化鋁柱制備：根據(jù)GB/T 25223─2010/ISO 12228:1999《動植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測定氣相色譜法》[12]改進(jìn)，在20 mL乙醇中加入10 g中性氧化鋁混合，并將混合液倒入層析柱中，使氧化鋁沉降并敲打至無縫隙，使用前打開活塞使乙醇液面到達(dá)氧化鋁頂層時關(guān)閉，備用。

植物油前處理：準(zhǔn)確稱取0.5 g(±0.01 g)油樣，加入100 μL內(nèi)標(biāo)(1 mg/mL膽甾烷醇)和2%的氫氧化鉀-乙醇溶液10 mL，混勻，75 ℃下水浴回流1 h后冷卻至室溫，取5 mL皂化液過中性氧化鋁柱，先用5 mL乙醇活化后用30 mL正己烷洗脫不皂化物，收集洗脫液。洗脫液在65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干后復(fù)溶于5 mL正己烷，轉(zhuǎn)移到15 mL玻璃離心小管中，氮吹干后加入100 μL硅烷化(99∶1 BSTFA-TMCS和等體積無水嘧啶)衍生試劑，室溫放置15 min，加入1500 μL正己烷稀釋后過0.22 μm有機(jī)濾膜，準(zhǔn)備進(jìn)樣。每個樣品3次重復(fù)。

標(biāo)準(zhǔn)品配置：用丙酮分別配置角鯊烯、菜籽甾醇、菜油甾醇、膽甾烷醇、膽固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、β-香樹脂醇、環(huán)阿屯醇、羽扇豆醇、羊毛甾醇1 mg/mL母液。其中膽甾烷醇為內(nèi)標(biāo)物，對其他10種目標(biāo)化合物分別考察線性范圍。

根據(jù)不同植物油中目標(biāo)化合物含量范圍，本試驗中標(biāo)準(zhǔn)曲線配置：用丙酮將母液稀釋，分別配置角鯊烯、菜籽甾醇、菜油甾醇、膽甾烷醇、膽固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、β-香樹脂醇、環(huán)阿屯醇、羽扇豆醇、羊毛甾醇1 mg/mL母液。根據(jù)不同植物油種類目標(biāo)化合物實際含量，定量標(biāo)準(zhǔn)曲線配置：用母液分別配置成含有菜油甾醇(2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL)，菜籽甾醇、β-香樹脂醇、環(huán)阿屯醇(1.25、2.50、5.00、10.00、25.00、50.00 μg/mL)，角鯊烯、豆甾醇、β-谷甾醇(0.625、1.250、2.500、5.000、12.500、25.000 μg/mL)、膽固醇、羽扇豆醇、羊毛甾醇(0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL)共6個梯度的混標(biāo)，各梯度混標(biāo)中加入100 μL內(nèi)標(biāo)(1 mg/mL膽甾烷醇)。氮吹后硅烷化衍生并用正己烷稀釋，備用。對目標(biāo)化合物較高的樣品采取稀釋10倍后上機(jī)。

1.3.2 儀器分析條件

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣：氦氣，流速0.95 mL/min，進(jìn)樣口溫度：320 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，不分流；柱溫升溫程序：初始溫度180 ℃，保持1 min，然后以4 ℃/min升到300 ℃，并保持25 min；溶劑延遲時間：20 min。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度300 ℃；離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～650。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化目標(biāo)化合物分離條件

根據(jù)GB/T 25223─2010/ISO 12228:1999《動植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測定氣相色譜法》[12]方法改進(jìn)，優(yōu)化前處理和GC-MS條件，11個化合物標(biāo)準(zhǔn)品都能有效分離，結(jié)果見圖1。

2.2 GC-MS法檢測各食用油中三萜類化合物含量

角鯊烯是一種酚類活性成分，具有抗疲勞，提高機(jī)體免疫力和血紅蛋白攜氧能力，促進(jìn)胃腸道吸收等功能，廣泛應(yīng)用于保健品、藥品和化妝品等領(lǐng)域[13-16]；甾醇是以環(huán)戊烷多氫菲為骨架的一類甾體類化合物，它具有降低飲食中人體腸道對膽固醇的吸收，預(yù)防動脈粥樣硬化以及抗炎等功效[17-20]；三萜大多是由2,3-氧化鯊烯CCC構(gòu)象環(huán)化而來，是植物油中的次要組成成分，具有預(yù)防心臟病、抗癌、抗氧化等功效，也可作為評估植物油質(zhì)量和真實性的重要指標(biāo)[21-22]。角鯊烯、甾醇、三萜都屬于萜類化合物，來自于植物甲羥戊酸代謝通路。

2.2.1 定性分析 在GC-MS全掃模式下對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行掃描，并對各標(biāo)準(zhǔn)品線性范圍進(jìn)行考察，各標(biāo)準(zhǔn)品線性范圍見表1，在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 定量分析 筆者根據(jù)前期對不同植物油的考察，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品線性范圍確定定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量分析是采用內(nèi)標(biāo)法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積等獲得被測組分含量，得到不同品牌的山茶油、稻米油、花生油、大豆油等8種食用植物油的三萜類化合物物質(zhì)成分含量如表2所示，可以看出在幾種植物油中，花生油中角鯊烯含量最高，約為273.10 mg/kg，此結(jié)論與朱云[23]報道的花生油中角鯊烯含量218.33 mg/kg相當(dāng)；菜籽甾醇在本試驗中只在菜籽油和稻米油中被檢測到，其中菜籽油含量高達(dá)1426.20 mg/kg；菜油甾醇在稻米油和菜籽油中的含量較高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他植物油種類；豆甾醇在稻米油中含量最高，約為3274.61 mg/kg；羊毛甾醇和β-香樹脂醇只在山茶油中被檢測出來；β-谷甾醇在玉米油和菜籽油中含量較高；羽扇豆醇在稻米油中含量較高，約為663.94 mg/kg；環(huán)阿屯醇在亞麻籽油和山茶油中較高。從三萜化合物總量來看，稻米油、玉米油、菜籽油和山茶油均超過2000 mg/kg，富含三萜類化合物。

表2 各植物油中三萜類物質(zhì)成分含量 mg/kg

2.3 主成分分析

利用PCA主成分分析對不同食用植物油的三萜化合物建模分析，發(fā)現(xiàn)不同植物油均可以按照植物油種類聚類在一起(圖2)。在所有聚類中，山茶油和稻米油與其他植物油種類可以明顯被分開，通過載荷圖可以看出，山茶油是由于香樹脂醇、環(huán)阿屯醇和羊毛甾醇較高而與其他植物油區(qū)分開來，在8種植物油中，其中羊毛甾醇和香樹脂醇只在山茶油中被檢出；稻米油則是由于較高的膽固醇、豆甾醇、菜油甾醇和羽扇豆醇與其他植物油區(qū)分開來；菜籽甾醇主要存在于菜籽油中，其他植物油中只稻米油檢測出少量。結(jié)合表2和圖2可以看出，在不同植物油中三萜類化合物指紋圖譜具有不同的特征，如稻米油中以β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇為主；花生油、大豆油、葵花籽油和玉米油以谷甾醇為主；而菜籽油中以菜籽甾醇、菜油甾醇和谷甾醇為主。

圖2 不同植物油三萜化合物PCA散點圖和載荷圖

從主成分分析結(jié)果可以看出，山茶油中β-香樹脂醇、環(huán)阿屯醇和羊毛甾醇屬于其特征三萜類化合物，可以作為對山茶油真?zhèn)蔚亩ㄐ砸罁?jù)，而低價植物油中菜油甾醇含量均比山茶油高，因此今后可以作為山茶油中其他低價植物油摻假識別指標(biāo)進(jìn)行應(yīng)用。

3 結(jié)論

山茶油營養(yǎng)豐富，富含角鯊烯、維生素E、植物甾醇，并且煙點較高，符合國人高溫烹飪飲食習(xí)慣，是我國有名的木本植物油。由于山茶油售價較高，不法商販常以低價油冒充山茶油摻假售賣，一直影響山茶油行業(yè)發(fā)展。對山茶油真?zhèn)舞b別中，國標(biāo)方法利用山茶油高油酸含量的特點，通過脂肪酸含量判斷山茶油是否摻假，而目前市場上已經(jīng)出現(xiàn)了新型高油酸花生油、高油酸葵花籽油、高油酸菜籽油，僅測定脂肪酸組成而往往不能滿足山茶油真?zhèn)舞b別的需求。本文通過對山茶油和常見食用植物油的三萜類物質(zhì)進(jìn)行檢測，并利用PCA主成分分析進(jìn)行判別，我們發(fā)現(xiàn)三萜類化合物作為食用油中的一類重要的脂肪伴隨物，在不同植物油中種類和含量均有所差異；通過主成分分析，發(fā)現(xiàn)不同品種植物油均可依據(jù)三萜化合物含量和種類進(jìn)行聚類，本方法可以為后續(xù)利用三萜化合物指紋圖譜對不同品種植物油鑒別起到借鑒作用。

綜上所述，本文利用GC-MS法測定8種植物油中的三萜類物質(zhì)，建立了不同植物油品種三萜類化合物指紋圖譜同時應(yīng)用PCA主成分分析，發(fā)現(xiàn)不同植物油中三萜化合物種類和含量有差異，山茶油中富含環(huán)阿屯醇、β-香樹脂醇和羊毛甾醇，其中β-香樹脂醇和羊毛甾醇是山茶油中特有的三萜化合物，可作為山茶油定性三萜化合物指標(biāo)進(jìn)行開發(fā)。此外針對幾種常見低價植物油，菜油甾醇含量均遠(yuǎn)高于山茶油，后續(xù)可作為其他低價植物油摻假識別指標(biāo)進(jìn)行應(yīng)用。