應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)小麥儲(chǔ)藏過(guò)程中真菌群落的變化

岳曉禹,張 華,陳威風(fēng),許文濤,郭明璋,*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品工程學(xué)院,河南 鄭州 450046;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要的糧食品種之一,對(duì)國(guó)家糧食安全具有重要的戰(zhàn)略意義。小麥容易發(fā)生真菌污染,導(dǎo)致小麥品質(zhì)下降,并產(chǎn)生真菌毒素。若含有真菌毒素的小麥被人食用,則可能會(huì)導(dǎo)致肝炎、肝癌等嚴(yán)重危害人體健康的疾病[1-2]。市場(chǎng)調(diào)查結(jié)果顯示,小麥中真菌毒素的檢出率明顯高于其他谷物[3],說(shuō)明小麥的真菌污染的情況比其他谷物嚴(yán)重。小麥真菌污染可能發(fā)生在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、銷售等各個(gè)階段,其中小麥倉(cāng)儲(chǔ)過(guò)程由于時(shí)間周期長(zhǎng)、麥粒密度大,極易發(fā)生真菌污染的加重和擴(kuò)散,是決定小麥真菌污染嚴(yán)重程度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

研究小麥倉(cāng)儲(chǔ)過(guò)程中真菌污染的發(fā)生規(guī)律是降低小麥真菌污染的前提條件和有效途徑。目前在此方面的研究主要集中在水分和溫度對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)小麥真菌發(fā)生的影響[4-6],發(fā)現(xiàn)了抑制真菌發(fā)生的最佳濕度和溫度,從而為小麥倉(cāng)儲(chǔ)的溫濕度條件設(shè)置提供了參考。在倉(cāng)儲(chǔ)過(guò)程中,小麥中的真菌群落并非一成不變,而是隨著時(shí)間和空間發(fā)生動(dòng)態(tài)變化,因此研究小麥儲(chǔ)存過(guò)程中真菌群落的時(shí)空變化對(duì)于小麥倉(cāng)儲(chǔ)真菌污染控制具有指導(dǎo)意義。本研究團(tuán)隊(duì)在之前的研究中應(yīng)用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)探究了玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中的霉菌群落時(shí)空分布特征[7],但在小麥領(lǐng)域尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

研究微生物群落的方法主要有3 類,即培養(yǎng)法、傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法和高通量測(cè)序方法[8-9]。培養(yǎng)法通過(guò)分離培養(yǎng)研究樣品中的微生物群落。由于在培養(yǎng)過(guò)程中各種微生物的生長(zhǎng)速率不同,導(dǎo)致培養(yǎng)后的微生物群落組成與樣品中原始的微生物群落有明顯差異。用于研究微生物群落的傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法包括DGGE法[10]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)[11]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)[12]等,但這些方法通常只能研究微生物群落中高豐度菌株。高通量測(cè)序方法研究微生物多樣性具有靈敏度、準(zhǔn)確率高等優(yōu)勢(shì),己被廣泛應(yīng)用于各類樣品的真菌群落研究中[13-16]。本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)河南和黑龍江兩地、不同儲(chǔ)藏時(shí)間、不同儲(chǔ)藏位置小麥樣品的真菌群落進(jìn)行研究,為小麥倉(cāng)儲(chǔ)過(guò)程中真菌污染的控制提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥樣品采自河南省和黑龍江省,樣品編號(hào)及相關(guān)信息如表1所示。

從河南嵩縣儲(chǔ)藏糧庫(kù)采集小麥,糧庫(kù)中小麥品種主要為西農(nóng)928、洛旱9號(hào)、運(yùn)旱115、洛旱15。從黑龍江雙鴨山糧庫(kù)中采集儲(chǔ)藏小麥,糧庫(kù)中小麥品種主要為東農(nóng)121號(hào)、墾九9號(hào)、遼春14號(hào)小麥、小麥新品種東農(nóng)024。河南小麥采樣時(shí)間為2016年8月9日,黑龍江小麥取樣時(shí)間為2016年8月23日。每個(gè)樣品采樣質(zhì)量約2 kg。糧庫(kù)南側(cè)、糧庫(kù)北側(cè)距離墻壁距離大約1～1.5 m。同一個(gè)年份的樣品是從一個(gè)糧倉(cāng)中取。

表1 小麥樣品編號(hào)及相關(guān)信息Table 1 Information about wheat samples tested in this study

Phusion超保真DNA聚合酶 美國(guó)New England Biolabs公司;高通量測(cè)序建庫(kù)試劑盒 美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250B超聲波振蕩器 中國(guó)上海早盈公司;H1850R低溫高速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增儀 美國(guó)Biometra公司;HiSeq 2500 PE250高通量測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥中真菌基因組DNA提取

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)法提取小麥的真菌[17-19]。具體參考文獻(xiàn)[7]中的玉米中真菌提取方法。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序主要委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。具體方法為利用帶有標(biāo)簽的ITS1區(qū)通用引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)對(duì)樣品真菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),對(duì)目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用高通量測(cè)序建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量,文庫(kù)合格后,使用HiSeq 2500 PE250進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析及統(tǒng)計(jì)分析

原始數(shù)據(jù)根據(jù)標(biāo)簽序列信息進(jìn)行拆分,得到樣品序列信息。序列經(jīng)過(guò)去除標(biāo)簽序列、去除引物序列、序列拼合、去除低質(zhì)量序列后,得到有效序列。有效序列利用QIIME軟件[20]進(jìn)行97%相似度的可操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)聚類,代表序列提取,基于GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)代表序列進(jìn)行注釋,得到每個(gè)樣品中每種OTU的序列數(shù)量。利用PAST軟件[21]對(duì)樣品中真菌群落OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scaling,NMDS)和Simpson多樣性指數(shù)分析。利用Draw Venn Diagram在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對(duì)樣品中真菌群落OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行韋恩圖分析。利用在線分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析工具[22]對(duì)小麥真菌群落中各物種的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。利用LDA Effect Size(LEfSe)[23]在線工具對(duì)不同組之間有顯著差異的真菌種類進(jìn)行分析。利用STEM軟件[24]對(duì)不同深度小麥中真菌群落的分布做趨勢(shì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥儲(chǔ)藏過(guò)程中真菌群落的一般結(jié)構(gòu)特征

圖1 小麥儲(chǔ)藏過(guò)程中真菌群落的一般結(jié)構(gòu)特征Fig. 1 General structural characteristics of fungal communities during wheat storage

如圖1 A所示,儲(chǔ)糧小麥中真菌以子囊菌門(mén)(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)為主,二者之和占到全部真菌的99.6%以上,其他低豐度微生物屬于接合菌門(mén)(Zygomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、球囊菌門(mén)(Glomeromycota)。不同樣品中子囊菌門(mén)微生物與擔(dān)子菌門(mén)微生物的比例差異較大,子囊菌門(mén)微生物的比例通常大于擔(dān)子菌門(mén)微生物的比例。如圖1B所示,在屬的分類水平上,物種多樣性最高的屬為鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)和枝孢霉屬(Cladosporium)是測(cè)序結(jié)果中豐度最高的己知菌屬,其中曲霉屬測(cè)得12 個(gè)種,包括亮白曲霉(A. candidus)、黃曲霉(A. flavus)、煙曲霉(A. fumigatus)、嗜鹽曲霉(A. halophilicus)、蜂蜜曲霉(A. melleus)、黑曲霉(A. niger)、帚狀曲霉(A. penicillioides)、局限曲霉(A. restrictus)、曲霉屬NRRL 145(Aspergillussp.NRRL 145)、土曲霉(A. terreus)、小麥曲霉(A. tritici)和雜色曲霉(A. versicolor)。在種的水平上,共發(fā)現(xiàn)93 種真菌,平均豐度最高的種為Pleosporaceae sp. RS_5、極細(xì)鏈格孢(A. tenuissima)、帚狀曲霉、小麥黑穗菌(Tilletia controversa)、蒜狀枝孢菌(C. allicinum)和枝狀枝孢菌(C. cladosporioides)。分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析可以揭示各種真菌在數(shù)量關(guān)系上的相關(guān)性,結(jié)果如圖1C所示,Selenophoma mahoniae、極細(xì)鏈格孢(A. tenuissima)和索伊納尾孢菌(Cercospora sojina)是分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的中心位置,與其他菌種具有最為豐富的相關(guān)性,說(shuō)明這些菌種可能在倉(cāng)儲(chǔ)小麥真菌群落中起到核心作用。

2.2 小麥儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)其中真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究于2016年從河南省糧倉(cāng)采集入庫(kù)年份分別為2013年(S2013、N2013)、2014年(S2014、N2014)、2015年(S2015、N2015)的小麥樣品,分別儲(chǔ)藏3、2、1 a。NMDS圖在二維圖譜上繪制各個(gè)樣品的菌群特征,圖上兩點(diǎn)距離越近,代表菌群特征越相近。由圖2A可知,儲(chǔ)藏3 a的小麥樣品與儲(chǔ)藏1 a的小麥樣品分別聚類在圖譜的不同區(qū)域,而儲(chǔ)藏2 a的小麥樣品中真菌群落介于儲(chǔ)藏1 a和儲(chǔ)藏3 a的真菌群落之間,可能處于過(guò)渡狀態(tài)。上述結(jié)果表明,小麥中真菌群落可能與小麥的儲(chǔ)藏時(shí)間有關(guān)。S2014和N2014在圖譜坐標(biāo)系上的距離較遠(yuǎn),這可能是由于過(guò)渡狀態(tài)群落物種組成不穩(wěn)定,變化較大導(dǎo)致的,其中N2014樣品與儲(chǔ)藏3 a的樣品在圖譜上距離較近,說(shuō)明N2014樣品中的真菌群落處于過(guò)渡狀態(tài)的后期,而圖譜上S2014樣品距離儲(chǔ)藏3 a和儲(chǔ)藏1 a的樣品距離均較遠(yuǎn),說(shuō)明S2014樣品中的真菌群落可能處于過(guò)渡中期。在多樣性方面,小麥真菌Simpson指數(shù)隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而略微上升,但各組之間均無(wú)顯著差異。

圖2 小麥真菌群落與儲(chǔ)藏時(shí)間之間的關(guān)系Fig. 2 Relationship between fungal communities in wheat and its storage period

儲(chǔ)藏時(shí)間不同可能導(dǎo)致小麥真菌群落整體結(jié)構(gòu)有所差異,而真菌群落整體結(jié)構(gòu)差異通常是由關(guān)鍵真菌菌種的差異所導(dǎo)致。LEfSe分析(圖3)可以得到不同儲(chǔ)藏時(shí)間真菌群落間的差異菌群。由圖3可以看出,儲(chǔ)存1 a的小麥樣品中,只有Geosmithia屬的CCF3652菌株是特征菌群,即該菌株在儲(chǔ)存1 a的小麥真菌群落中的比例顯著高于該菌株在儲(chǔ)存2、3 a的小麥真菌群落中。儲(chǔ)存2 a的小麥樣品特征真菌包括出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、S. mahoniae、Candida palmioleophila和Chaetomidium leptoderma,其中S. mahoniae是小麥真菌群落分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中的核心菌群。儲(chǔ)存3 a的小麥樣品特征菌群包括亮白曲霉(A. candidus)、C. railenensis、粉紅單端孢霉(Trichothecium roseum)、Pleurotus citrinopileatus、少根根霉原變種(Rhizopus arrhizus var. arrhizus)。

圖3 利用LEfSe分析不同儲(chǔ)藏時(shí)間小麥真菌群落中的特征真菌Fig. 3 LEfSe analysis of characteristic fungi in fungal communities in wheat stored for different years

2.3 小麥在糧庫(kù)內(nèi)儲(chǔ)藏位置對(duì)其中真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

圖4 小麥真菌群落與糧庫(kù)中儲(chǔ)存位置的關(guān)系。Fig. 4 Relationship between fungal communities in wheat and its location in warehouse

采集3 個(gè)不同倉(cāng)庫(kù)南側(cè)和北側(cè)的糧食樣品,分析其真菌群落結(jié)構(gòu),研究糧庫(kù)內(nèi)儲(chǔ)藏位置對(duì)小麥真菌群落結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果如圖4所示。從糧庫(kù)南側(cè)和糧庫(kù)北側(cè)采集的樣品真菌群落并未發(fā)生分別聚類,而是呈現(xiàn)間隔分布的特點(diǎn),由此可見(jiàn)儲(chǔ)存位置對(duì)小麥真菌群落的影響可能沒(méi)有儲(chǔ)藏時(shí)間明顯。這一現(xiàn)象可能是由于同一糧倉(cāng)中整體環(huán)境比較均一,且糧庫(kù)中不同位置小麥的真菌孢子可以通過(guò)空氣進(jìn)行交流。在多樣性方面,從糧庫(kù)南側(cè)采集的小麥樣品中真菌群落的多樣性在平均值方面略高于從糧庫(kù)北側(cè)采集的小麥樣品,但差異并不顯著(P＞0.05)。由于對(duì)糧庫(kù)中真菌群落的空間分布鮮見(jiàn)于前人的報(bào)道中,因此本結(jié)果需要更深入的研究和更多糧庫(kù)樣品的驗(yàn)證。

2.4 小麥儲(chǔ)藏深度對(duì)其中真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

小麥儲(chǔ)藏深度可能影響溫度、濕度、氧氣濃度等環(huán)境條件,從而導(dǎo)致其中真菌群落的組成有所差異。本研究采集了糧倉(cāng)中表層(WH1)、中層(WH2)、深層(WH3)3 份小麥樣品,分析其中真菌群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。由圖5A可以看出,3 份樣品中共有真菌種類為87 種,仍然占到所有真菌種類的45.1%,而在各層特有真菌方面,表層小麥樣品特有33 種真菌,中層小麥樣品特有20 種真菌,深層小麥樣品特有8 種真菌。在表層小麥特有的33 種真菌種,糞殼菌綱(Sordariomycetes)的真菌有17 種,占51.5%。進(jìn)一步分析糞殼菌綱中所有真菌在不同層次小麥樣品中分布情況,發(fā)現(xiàn)大部分糞殼菌綱真菌由“表層-中層-深層”的分布呈現(xiàn)出減少的趨勢(shì)(圖5B),即糞殼菌綱真菌主要分布在表層或中層的儲(chǔ)藏小麥中,而在深層小麥中分布較少。通過(guò)糞殼菌綱的例子可以看出,小麥儲(chǔ)藏深度對(duì)其中的真菌群落有一定程度的影響。

圖5 小麥真菌群落與儲(chǔ)藏深度之間的關(guān)系Fig. 5 Relationship between fungal communities in wheat and its storage depth in warehouse

2.5 河南和黑龍江兩地儲(chǔ)藏小麥中真菌群落的比較

圖6 河南和黑龍江兩地小麥樣品中真菌群落的比較。Fig. 6 Comparison of fungal communities in wheat samples collected from different provinces

整體比較河南省和黑龍江省糧庫(kù)所采集的小麥樣品中的真菌群落,可以發(fā)現(xiàn)二者具有很大差異。LefSe分析(圖6A)表明,兩省樣品在種水平上的23 種真菌具有顯著性差異,其中既涉及到Pleosporaceae RS_5、帚狀曲霉(A. penicillioides)等高豐度菌種,也涉及到S. mahoniae,極細(xì)鏈格孢(A. tenuissima)和索伊納尾孢菌(C. sojina)等在小麥真菌群落分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置菌種,由此可見(jiàn),河南和黑龍江兩地儲(chǔ)藏小麥種真菌群落結(jié)構(gòu)具有實(shí)質(zhì)性的區(qū)別。從圖6B可以看出,主要菌群在各個(gè)樣品中的豐度分布情況。取自同一省份的樣品中真菌群落分布較為一致,而河南和黑龍江兩地的樣品中這些菌種分布差異明顯。由于河南省樣品屬于不同儲(chǔ)藏時(shí)間,黑龍江省樣品采自不同儲(chǔ)藏深度,可以推測(cè)河南和黑龍江兩地對(duì)小麥真菌群落的影響可能大于儲(chǔ)藏時(shí)間和儲(chǔ)藏深度對(duì)真菌群落的影響。

3 討 論

在本研究之前,國(guó)內(nèi)外己有利用培養(yǎng)法或傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法研究小麥中真菌群落特征的報(bào)道。與前人的報(bào)道相比,本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)得到的結(jié)果在全面性和靈敏性方面有明顯提高。例如,李慧等[25]應(yīng)用培養(yǎng)法從小麥粉中分離培養(yǎng)出5 株真菌,為鏈格孢霉、橘灰青霉、黑曲霉各1 株,米曲霉2 株。Tralamazza等[26]利用培養(yǎng)法研究巴西小麥,發(fā)現(xiàn)小麥中真菌以鏈格孢霉、鐮刀菌、附球孢菌為主。都立輝等[27]利用PCR-DGGE技術(shù)研究?jī)?chǔ)糧小麥中真菌群落,共發(fā)現(xiàn)了8 種真菌,主要為帚狀曲霉、格孢腔菌、枝孢菌和假絲酵母。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù),共發(fā)現(xiàn)了93 種真菌,其中高豐度真菌種類與培養(yǎng)法和傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法得到的結(jié)果基本一致,但高通量測(cè)序方法對(duì)低豐度真菌的研究能力是培養(yǎng)法和傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法所不能勝任的。高通量測(cè)序方法也存在不足,如培養(yǎng)法分離得到菌株后,可以方便的研究菌株的產(chǎn)毒素能力,而高通量測(cè)序方法只能研究真菌物種組成,在真菌毒素方面只能依據(jù)物種組成進(jìn)行推測(cè)。

本研究結(jié)果表明,鏈格孢屬、曲霉屬和枝孢霉屬是測(cè)序結(jié)果中豐度最高的己知菌屬。鏈格孢屬和曲霉屬都是小麥作物常見(jiàn)的病原菌,而枝孢霉屬?gòu)V泛分布在土壤和空氣中,因此這些微生物的孢子附著在倉(cāng)儲(chǔ)小麥上的概率很高。若儲(chǔ)藏條件不當(dāng),這些真菌的孢子可能萌發(fā),產(chǎn)生真菌毒素,導(dǎo)致倉(cāng)儲(chǔ)小麥的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。例如鏈格孢屬微生物可能產(chǎn)生交鏈孢酚、交鏈孢酚單甲醚、交鏈孢烯、交鏈孢菌酮酸和交鏈孢毒素等[28],曲霉屬微生物可能產(chǎn)生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等[25,29]。利用高通量測(cè)序技術(shù)分析倉(cāng)儲(chǔ)小麥中真菌種類,有利于改進(jìn)儲(chǔ)藏條件,有針對(duì)性的防止相應(yīng)的真菌毒素產(chǎn)生。

在之前的研究中,本課題組曾提出“依據(jù)預(yù)測(cè)微生物學(xué),構(gòu)建儲(chǔ)糧中微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型,可以快速對(duì)儲(chǔ)糧中微生物的生長(zhǎng)情況進(jìn)行判斷,對(duì)儲(chǔ)糧中病原微生物和腐敗微生物的控制有重要作用”[30]。任何預(yù)測(cè)模型的建立都必須以實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),在實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)中找到規(guī)律,建立模型,之后進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果對(duì)小麥真菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的指導(dǎo)意義包括:首先,建立模型時(shí),應(yīng)考慮糧庫(kù)所在省份的差異,河南和黑龍江兩地由于地理位置和環(huán)境條件的差異,可能需要完全不同的預(yù)測(cè)模型;其次,儲(chǔ)藏時(shí)間和儲(chǔ)藏深度時(shí)可能是影響小麥真菌生長(zhǎng)和演替的主要因素,其原因可能是這2 個(gè)因素都影響小麥的呼吸狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)及氧氣、溫度、濕度等環(huán)境條件;再次,由于糧倉(cāng)中整體環(huán)境比較均一,因此儲(chǔ)藏位置可能對(duì)小麥真菌生長(zhǎng)模型的影響較小。本實(shí)驗(yàn)可為儲(chǔ)糧中微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型建立提供參考,但具體規(guī)律仍需更多的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。